化学发光方法学比较分析

免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。

发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。

1、化学发光

化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。其主要特点为消耗发光剂。同时量子效率相对较低。

1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过

最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。所以重复性较差。为降低检测成本并实现重复测量，目前普遍采用原位进样加流动池的时间积分测量方式。因此仪器成本及维护费用较高，而且反复使用的流动池可能导致交叉污染；并目冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外，使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。

1.2 按发光持续时间分类：可分为闪光和辉光两类，闪光型发光时间在数秒内，如吖啶酯系统。其检测方式一般采用原位进样和时间积分法测量，即在检测器部位加装进样器，并保证加入发光剂和检测2个过程同步进行；同时以整个发光信号峰的面积为发光强度。而辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上，如HRP一鲁米诺系统、ALP—AMPPD 系统、黄嘌呤氧化酶-鲁米诺系统等。其信号检测无需原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域任意点测量单位时间的发光强度。

测量化学发光反应的光强度，求得某些化学物质和生物物质的

含量，尤其与免疫学方法结合以后形成的化学发光免疫测定法(CLIA)，其既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析的高度特异性，检测快速，试剂无放射危害，检测限达10负15 mol／L。

1.3 评价：化学发光标记物已广泛应用于抗原、半抗原和抗体的检测，与放射性核素标记物相比较，它的优点在于安全(无放射危害)、稳定、测量快速、灵敏度高、线性范围宽、自动化程度高、减少了人为的误差。检测快速缩短了等待结果的时间，无需批量检测可随到随测保证及时提供结果。缺点在于一般化学发光是标记催化酶或化学发光分子的发光反应，一般发光不稳定，为问断的、闪烁性发光，而且在反应过程中易发生裂变，导致反应结果不稳定。此外。检测时需对结合相、游离相进行分离，操作步骤多，测试成本高。主要问题是化学发光的产生通常是瞬间完成的，发光的峰值很快衰减，再是本底较高和干扰妨碍应用。

1.4 代表仪器

1.4.1 美国拜耳公司最新诊断产品——ACS：180系列全自动化学发光免疫分析系统，以吖啶酯作为标记，量度AE标记物化学反应所产生的光量为基础，灵敏度可达10负15 g／mL。

1.4.2 美国雅培公司生产的AxSYM系列全自动免疫发光分析仪将3种技术于一机，可用于非均相标记微粒子酶免发光分析(MEIA)、离子捕捉发光分析(ICIA)和均相标记荧光偏振免疫发光技术(FPIA)，目前已有80多个检测项目可供临床应用。

1.4.3 美国贝克曼库尔特公司AccessOR全自动微粒子化学发光免疫分析系统。采用ALP-AMPPD发光系统，以微粒子作为载体，表面积大、结合快、达到最大发光信号时间短、反应及分离速度快，缩短了分析时间，有效提高了灵敏度和准确性。该系统可全自动控制整个测定和数据分析处理，具有批量和任选测定24个项目的能力和急诊插入功能，平均检测速度100/h。冷藏试剂盘可放24种试剂，探针直接插入试剂盒并自动封闭，直至试剂用完，不污染不浪费。超声波技术被用于搅拌使微粒悬液混均匀并加速反应，用于探针取样液面检查保证取样准确，用于洗涤时减少交叉污染。使用AccessOR的用户还可以申请Internet全球通讯网络，进行通讯查询。AccessOR独特的塑料智能化外形设计，使其从外观到内在品质，给人们留下深刻的印象。

1.4.4 美国DPC公司全自动化学发光免疫分析仪IMMULlTE，以ALP为标记物，以金刚烷作发光底物，测定灵敏度相当于10负21mol ／ml的酶，采用聚苯乙烯珠作载体，其检测水平已能达到10负12g／ml。目前能够检测性腺类、甲状腺功能类、肿瘤标记物类、传染病类、细胞因子类、血液病类、糖尿病类、肾上腺功能类、治疗药物类、成瘾药物类、短肽及其他分析物类，还能提供象肌钙蛋白(TNI)这类急诊项目的快速诊断试剂盒。

2、电化学发光分轿

2.1 电化学发光

2.1.1 电化学发光的原理是对电极施加一定的电压进行电化学反应，反应的产物之间或与体系中某种组分发生化学发光，用普通

光学手段测髓发光光谱军Ⅱ强度从而对物质进行衡量分析的一种方法。与化学发光有所不同，其差异在予氧化反应是通过电极上的电化学反应产生的，而不是氧化剂或发光剂自身内氧化产生，其标记物为三联吡啶钌及其衍生物Ru(bpy)3 2+，并以三丙胺(TPA)为还原荆。如图1所示，Ru(bpy)32十穰TPA分剃在弼投袅嚣氧化成Ru(bpy)3 3+搬TPA的阳离子自由基IPA+，IPA+迅速脱去一个质子形成TPA自由基，TPA具有强的还原性，从而把Ru(bpy)3 3+还原为激发态的Ru(bpy)3 2+，后者发射一个620 nm的光子回到基态再参与下一次电化学发光。必需0.01毫秒就可发出稳定的光，每毫秒几十万次的循环电化学发光，大大提高了分析的灵敏度。另外，通过电极反应在线制备了不稳定的发光剂Ru(bpy)32+TPA，避免了直接使用Ru(bpy)3 2+对分析测试的影响。

2.1.2 电纯学发光的主要特点是发光过程中的标记物基本不被消耗，丽反应体系中其他成分充分过量，因此发光倍号强而稳定，且发光时间较长。其缺点为测量方式复杂、仪器成本及维护费用高；同时环境及样品中同类元素也存在较弱的本底干扰。反复使用的流动池可能导致交叉污染；而冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。

2.2 免疫电化学发光分析：集电化学发光、生物素一抗生物索、免疫分析和由固相免疫分析发展起来的磁微球等技术于一体，是众多学科交叉的研究领域。

免疫学的核心问题是抗原一抗体的特异性结合，主要采用固相的方法，即将抗原或抗体固定到磁微球上，经免疫反应后，在固相载体磁微球上形成抗原一抗体复合物，外加磁场沉降这种复合物，然后洗涤除去多余或游离的抗体或抗原，然后进行电化学发光测定。与一般免疫反应类似，可分为直接法、双抗体夹心法和竞争法。

2.3 免疫毫纯学发光鹣瘟曩毫纯学发光综合了光学、电子学、生物学、免疫学和计算机，禚临床中可糟予以下几个方面。

(1) 蛋白质和激素测定：电化学发光技术在激素的测定中有替代放射免疫的趋势。可检测甲状腺激素、促甲状腺激索、性激素、雌二醇、促卵泡激索、促黄体激索、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、甲状腺降钙素、肿癌标志物、前列腺特异性抗原、肌钙蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、肿瘤坏死因子、r干扰素、人体肿瘤相关糖蛋白、自细胞介素系列等。

2.3.1 毒素与病毒抗原分析：如肉毒杆菌毒索、蓖麻蛋翻、霍乱亚基和葡萄球菌肠毒素等，检测限达10-15g。还有炭疽杆菌芽孢、伤寒沙门菌、鼠疫抗原等沙门菌和。O一157病毒等。

2.3.2 DNA／RNA核酸序列分析：在核酸分析中利用电化学发光技术将Ru(bpy)3+标记引物或探针进行DNA杂交分析或聚合酶链反应，是实验室定量分析标本中核酸含量的一种有发展前景的检测方法。该技术述可用于检测乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等其他致病性病毒和病原微生物。

2.3.3 其它物质的检测：还可对其他一些微量物质进行测定，如维生索、叶酸、免疫球蛋白及酶类，人免疫球蛋白、人血清清蛋白、人中性粒细胞溶菌酶、葡萄糖和除草荆等。

2.4 评价：电化学发光是一种电促发光技术，采用的是特殊的化学发光剂Ru(bpy)3+作为标记物并在发光反应中循环使用，既避免了同位素的半衰期短及放射蚀危害，又克服了酶标记的不稳定性，而标记物很稳定，在室温下半衰期大于1年；同时还结合了90年代初期问世的链霉亲和素的新型固相技术，不但使检测的融敏度大大提高，而且还可自动分离游离相和结合相，使检测更易实现自动化。电化学发光的反应时间仅为20 min，而且标准曲线储存在条码中，每次测定只需一点标定，Ru(bpy)3+的稳定性很好，在室温下半衰期长达1年。这些优点决定了操作的快速、简捷，无需经常校正。

因此该技本与其它的分析手段比较，在免疫学检测中有显著的优势。它的优点除了灵敏度高、特异性强、检测快速外，更为可取的是所用试剂毒性低，无放射性危害，并且有良好的稳定性。以最易受影响的促甲状腺素为例，35℃3周后，电化学发光试剂仍然稳定。电化学发光分析方法多样，适用面较大，广泛地应用于抗原、半抗原和抗体的免疫梭测。其线性范围也较宽，符合临床检验的需要。耐它与普通的化学发光比较，前者为电促发光，在电极表面通过三角形脉冲电压的激发产生稳定、连续、高效的发光，后者则是标记辣根过氧化物酶作用下催化化学发光剂(如鲁米诺、吖啶酯等产生不稳定、间断、闪烁性的发光)，基反应过攘中容易发像裂变恧使结果不稳定。

电亿学发光测定的照光度裰据释放光子的波长仍属荧光测定酶范畴，但与直接的荧光发光不同，荧光发光的灵敏度受荧光发光的本底和光学部件散射光的影响，适应范围也较低。

电化学发光技术的发展趋向在于合成新的发光标记物、优化标记技术和免疫分析方法，从而追踪生命科学发展的前沿领域，建立对生命过程有重要意义的内源性和外源性物质的分析方法。

2.5 代表仪器：目前生产电化学发光仪的厂家较少，主要生产厂家是瑞士罗氏诊断公司，与德国BoehringerMannheim宝灵曼公司公司合作，Elecsysl0lO／20lO，ROCHE 2010系列全自动电化学发光免疫分析仪(ORIGEN分析仪)。标本可随时插入常规操作中并优先测试，也为临床急诊测定提供了方便。

3、时间分辨荧光

3.1 时间分辨荧光免疫分析(TR-FIA)TR-FIA是将三价稀土镧系离子铕(Eu)，钐(Sin)等通过络合物标记到抗原或抗体分子上，并通过检测其荧光实现免疫分析。由于稀土离子荧光的激发光波长范围较宽，而发射光波长范围较窄，而且激发光和发射光之间的波长差距较大，特别是荧光寿命大大长于常规荧光。因此它采用了与常规荧光免疫不同的检测方式，即通过脉冲激光器间歇激发样品，同时检测器在其激发的间隙测定特定波长的荧光强度。这样不仅消除了杂散光的干扰，而且也大大减弱了样品及反应杯中杂质所产生的背景荧光干扰。所以其检测灵敏度和线性范围大大高于常规荧光。

3.2 解离增强时间分辨荧光免疫分析法(DELFIA) 由于稀土离子在水相中的荧光效率很低，因此需要将其包裹在一个非水相的环境中才能检测到理想的荧光强度。最常见的做法是在检测前先用酸将稀土离子从标记抗原或抗体七解离出来，由一系列表面活性剂构成的微囊吸收并包裹稀土离子，这种方式称为DELFIA，其中的酸和表面活性剂等被称为增强剂。迄今为止，在所有的时间分辨荧光免疫分析法中，这种方法的灵敏度是最高的，因此近年来得到了广泛应用，已经成为目前最常见的时间分辨免疫分析技术。

3.3 直接时间分辨荧光测嚣法由于该方法需要在常规免疫分析中的洗涤步骤后还要进行荧光素的解离和增强操作，因此分析步骤有些冗长繁琐。时间分辨荧光免疫分析最大的不足是环境及样品中同类元素导致的本底干扰。作为稀土资源大国的中国，这一点尤其不容忽视，特别对北方地区更为重要。虽然可以通过实验用水和实验室环境的特殊净化杜绝一部分干扰，但会带来运行成本的提高；况且由于患者体内这类元素的积累而造成的临床标本污染根本无法消除。因此人们研究开发了另一种称为直接时间分辨荧光测量法的技术，也有人称之为后标记技术。它首先使用一种不含稀土元素的特殊络合物标记抗原或抗体，等常规免疫分析中的洗涤完成后，再加入稀土元素并进行测定，这样就基本掩蔽了同类元素导致的本底干扰。但其灵敏度较低，目前还不能与上述两种方法相抗衡。除上述方法外，还有一种固相时间分辨荧光法，它是使用一种特殊的络合物将三价稀土离子标记到抗原或抗体分子上，同时该络合物还可以维持三价稀土离子周围的

非水相环境，因此也充当了增强剂的角色。该方法的特点是无需增强剂，故操作简单，但灵敏度度低于上述DELFIA。

3.4 评价时间分辨荧光技术的不足为测量方式复杂、仪器成本及维护费用高，环境及样品中同类元素可导致本底干扰等。

3.5 代表仪器法国CIS公司1996年在欧洲推出KRYPTOR全自动时间分辨荧光免疫分析系统，用三价镧系元素铕(Eu3+)与磷酸三丁酯剂量校准曲线。近年来，该系统已可供临床实验室应用的试剂盒有肿瘤标志物、唐氏症筛查指标、性功能激素检查、心血管疾病、骨代谢、甲状腺自身免疫性疾病等。TRFlA可做双标记和多标记分析，美国PE公司的1420Victor多标记免疫分析系统集时间分辨免疫荧光分析、化学发光免疫分析、荧光分析及酶联免疫吸附分析于一机，实现一次反应多项结果，1台仪器多种功能。

4、生物发光

4.1 生物发光是生物体内发光蛋白通过消耗能量物质而产生的发光现象，其特点为只消耗能量物质，不消耗发光物质。近年来，随着越来越多的发光蛋白被提纯、其编码基因序列被测定、表达，其发光底物被人工合成，相关的基础研究和产品的商业化进展迅速。已经发现的发光蛋白包括细菌荧光素酶、虫荧光素酶、腰鞭毛虫、荧光索酶水母素及奥贝林绿色荧光蛋白等，类似的荧光蛋白还有橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝绿荧光蛋白等。另外，目前己经被发现的生物发光底物有：虫荧光素、腔肠素、还原型黄素单核苷酸、腰鞭毛虫荧光素、种虾索等。

4.2 生物发光免疫分析法是采用生物发光物质，如虫荧光素酶或细菌荧光素酶或者转助因子(NAD+、三磷酸腺苷等)进行标记抗原抗体，使其直接或间接发光反应进行检测。如Wannlund等在1980、1982年用荧光素酶进行标记，发光免疫分析测定氨甲蝶呤和细菌荧光素酶，Terouanne在1986年采用6一磷酸葡萄糖脱氨酶标记孕酮进行发光免疫分析血清中孕酮。

4.3 生物发光免疫分析法在生物医学领域内的应用主要包括细胞学、分子生物学、卫生学、生物传感器、脂质过氧化检测和药物筛选等6个方面。其中细胞学检测主要是利用细胞内ATP导致的虫荧光索酶生物发光进行活细胞计数，目前已实现快速、动态，单细胞分析。近年来，在该领域内的应用研究又有一些进展，例如用于测定T 细胞免疫活性等，同时也发现了一些新的与生物或化学发光有关的细胞学指标。分子生物学领域内的应用主要为报告基因和分子杂交，近年来又有人推出了生物发光实时DNA测序技术。卫生学检测则主要是利用分子杂交或ATP导致的生物发光检测微生物污染，有人将该技术用于尿样中的细菌总数快速测定，可在1h内完成的快速药敏试验方法。基于生物及化学发光的生物传感器主要有三类：酶固化传感器、免疫分子传感器和特异调控因子诱导的报告基因传感器。脂质过氧化检测主要是指利用化学发光检测自由基等活性物质。最近还有人分别推出了基于报告基因和细胞增殖的生物发光药物筛选系统。

5、激光免疫分析

作为激光技术在医学诊断学的新应用，美标公司医学集团

DiaSorin已研究开发了COPALIS多项检测系统。国内首次见到该系统是在1998年5月的全军后勤装备展览会上，接着6月的Sino-Med也展示了该系统。COPALIS即耦联颗粒光散射技术，其耦联颗粒是由抗原一抗体、受体一激素或核酸的相互作用，在聚苯乙烯微颗粒存在下，或自身聚集，或与胶态金颗粒聚集，形成单一的和／或聚集的均相配体颗粒。当它们逐个流过一个由半导体激光形成且精确聚焦的入射光束时，会产生一个散射光脉冲，信号被光电二极管探测器记录下来，直行的激光光束则被探测器上的中央光束隔栅阻断。该系统一次可同时自动检测4种不同的分析指标，如弓形体、风疹、巨细胞和非洲淋巴细胞瘤病毒等，12 min内报告全部结果。第5个通道用来放置内部参照物，作为系统的质控检查，以确保准确性和可靠性。目前，DiaSorin正在开发可以同时检测6项指标的第2代产品，将提供从出生前的围生医学到老年医学贯穿整个生命周期的健康服务。