电镜目前的技术难点及未来发展趋势

5 冷冻电镜目前的技术难点及未来发展趋势

与其他的结构生物学和生物物理学研究方法类似，冷冻电子显微学在硬件设备上的长足进展解决了很多关键性的技术难点，使该方法的应用普及成为趋势。同时，一些其他的技术难点凸显出来，成为结构解析中的瓶颈，需要更多的关注与投入。

5.1 样品制备技术

样品制备一直是冷冻电子显微学研究的关键步骤。对于生物大分子结构研究来说，需要保证单颗粒分子以合适的密度均匀分布于厚度合适的无序冰中，才有可能获得良好的电子显微数据进行结构解析。由于不同的生物大分子与样品支持膜的相互作用及在水溶液中的性质各不相同，分子在样品中的分布状态各异。目前普遍采用的冷冻制样技术在基本原理上仍然采用30 年前发明的方法，实验可重复性、操作可移植性、通用性等都很差。样品制备已经成为冷冻电子显微学结构解析的限速步骤。冷冻电子显微学要想成为结构生物学研究的主要应用手段，必须在样品制备这一步骤取得重要的突破。类似的，对于细胞结构研究来说，将本身很厚的细胞样品进行减薄处理，才适合冷冻电镜观察。在过去的十多年里，冷冻切片技术一直在稳步发展，至今已经成为相对成熟的技术，但是对该技术的熟练掌握仍然需要长期的培训与实践经验。最近发展起来的聚焦离子束减薄技术在未来可能会对冷冻细胞样品的结构研究带来新的契机。

5.2 高分辨率结构的分析与建模

应用冷冻电子显微学技术在过去的两年里所获得的近原子分辨率（4?以上）三维结构的数目几乎超过了前面几十年所获得的高分辨率结构数目之和。更多的在4~8?分辨率范围内的结构在很短时间内被解析出来，不同的分辨率结构可以揭示出的结构细节亦不同。而与晶体学手段不同，冷冻电子显微学单颗粒重构无法通过对晶格衍射点的信号强弱来判断分辨率。因此，如何客观地对三维重构的结果进行检验、明确结构解析的分辨率是目前高分辨率冷冻电镜研究中的一个重要问题。在此基础上，需要对不同分辨率水平的三维重构进行原子模型的构建，从而实现在原子水平上对分子功能的解释。对于分辨率在4?以上的三维重构基本可以应用X射线晶体学现有的方法进行建模；对分辨率在4?以下的三维结构如何建立较为可信的模型，则仍缺少相对成熟并被普遍接受的方法。一些研究组正在利用同源建模、分子动力学模拟等手段来进行这一分辨率水平的原子模型搭建的尝试。

5.3 生物大分子构象不均一性的分析

冷冻电子显微学单颗粒结构解析技术与晶体学技术的一个重要差异是不需要溶液中的

生物大分子形成高度有序的晶体排列，因而可以直接获得溶液中的生物大分子结构。但生物大分子尤其是大分子复合体本身的构象柔性亦因此没有被固定在晶体结构中，这些构象柔性反映在电子显微图像中，常常是导致三维重构无法获得高分辨率结构的根源。将不同构象的分子分开分析，是提高重构分辨率的重要过程。此外，分子在溶液中的不同构象很可能反映了分子发挥功能的不同结构形态，理解这些构象差异对于解释分子功能的机制非常重要。目前对生物大分子构象不均一性的分析是冷冻电子显微学结构解析中的技术难点和热点。现有的一些算法通过聚类分析、最大似然法分析等对某些生物大分子复合物的结构解析取得了重要的发现，但对这个问题的解决需要更多的新思路和新算法。

5.4 电子光学新技术方法在生物样品研究中的应用

材料科学超高分辨率研究在过去十几年里也发生了很多重要的技术进步，主要是电子显微镜光学系统的不断完善和提高，以及新的成像手段的进步，新的技术诸如球差矫正、色差矫正、扫描透射电子显微镜系统等都在材料科学领域结构分辨率的显著提高中发挥了重要作用。目前，利用最新的电子光学成像系统，物理学和材料科学研究者已经可以获得0.5?的分辨率。随着对生物样品近原子分辨率结构解析能力的逐渐普及，更高的分辨率必然成为冷冻电子显微学发展的下一个目标。如何应用材料科学领域证明对超高分辨成像卓有成效的电子显微学方法来提高生物样品的结构解析分辨率，是摆在所有冷冻电子显微学家面前的新机遇和挑战。此外，新的技术如电子显微镜相位板（phase-plate）的开发与应用已经被证明对于利用单颗粒技术解析小分子量的蛋白质结构以及利用电子断层扫描三维重构技术研究细胞结构具有重大的促进作用。该项技术很可能在未来几年里引起冷冻电子显微学的另一次新的重大突破。

5.5 体内结构的研究

自从上世纪中期建立以来，结构生物学主要是通过对分离纯化至体外的生物大分子结构进行解析。至今解析出来的多达10万的生物大分子结构对于我们理解生物学过程的分子机制发挥了重要的作用。但迄今为止，我们仍无法通过直接观察获得细胞内乃至体内的生物大分子的原子分辨率结构。冷冻电子显微学尤其是三维断层扫描重构的发展给我们提供了这样的契机。通过更稳定的电子显微镜系统、更高效的数据采集装置、更强大的计算机处理工具，三维断层扫描重构将有可能帮助我们对细胞内的特定分子结构进行重构和统计分析，从而获得它们的高分辨率结构。如何对细胞中特定分子的标定则是目前冷冻电子显微学细胞结构研究面临的一个主要技术问题。如果能实现以上目标，冷冻电子显微学将可能真正填补结构生物学与细胞生物学之间的空隙，使得我们从不同空间与时间尺度上对生物体的理解更加完整。

6 个人感悟与结论

纵观整个冷冻电镜的工作流程，我们发现冷冻电镜的基本工作原理其实不难以理解，但整个冷冻电镜的结构非常的庞大与复杂，目前可以生产并且销售这种昂贵的冷冻电镜的公司也只有美国FEI等少数几家专业的显微镜制造公司，显然目前我国还并没有掌握这种高精尖仪器的生产制造技术，我国整体的科学仪器制造水平与美国等西方发达国家相比仍然是存在较大的差距。

结合仪器专业的角度来看冷冻电镜的结构，我们发现冷冻电镜技术其实在很多方面与我们仪器专业密切相关，比如说冷冻电镜的一大优点就是样品台稳定，普通的电镜稳定工作台需要10分钟，而最好的冷冻电镜工作台的稳定时间已经可以实现在20秒左右，效率至少是普通电镜的30倍，如何设计这样一种需要很快时间稳定下来且精度要求很高的工作台就是我们仪器专业领域所要研究的问题，我们可以遵循粗精结合、基面合一、变形最小等基本的仪器设计原则对工作台进行设计，在设计的过程当中可以借助计算机软件进行仿真，例如我们可以利用ANSYS软件，运用有限元的思想仿真工作台在受力情况下的变形程度以及计算工作台受外界扰动后再次达到稳定所需的时间，优化设计工作台的设计参数。而对于冷冻电镜自动换样品、自动换氮、自动维持清洁功能的实现，结合我们仪器专业分析，自动化功能的实现首先是需要设计一系列的传动、运动系统，有了传动、运动系统的配合，仪器才可能完成一系列把样品自动送出、送入，自动维持自身清洁等智能化的动作，如何设计出这样一整套既能够实现预期的功能，又要保证整个仪器的工作可靠性的系统，是我们在仪器设计的时候需要认真去考虑的问题。光学系统设计同样也是仪器设计当中一个重要的技术难点，对这些复杂、庞大的显微仪器而言，光学系统的设计就显得尤为重要。显微仪器设计的目的就是为了帮助人们更好地去认识微观世界，判断显微仪器的好坏最直接的方法就是看其成像的质量，成像是否清晰，是否可以突破衍射极限，达到原子分辨率量级，而这又与光学有着直接的联系。我们在设计仪器光路系统的时候，如何能够实现光路的最优化，如何可以消除球差、慧差、像差、畸变、色散等一系列的像差问题（借助专业的光学软件Zemax、Code V 等），如何选择透镜的面型（结合透镜的加工难度、价格等因素），如何尽可能用最少数量的透镜达到光路的设计要求，如何在保证质量要求的前提下尽可能减少系统的成本等等，这些都是我们在显微仪器（包括冷冻电镜这种高精尖仪器）光路系统设计过程当中所要面临的问题，都与我们平时所学习的仪器专业基础知识紧密结合。

冷冻电子显微学从20世纪中叶开始，经历了80年代到90年代的技术方法建立时期，21 世纪初的技术成熟期，在过去的两年里发生了革命性的技术进步，进入了快速发展期。结构生物学和细胞生物学研究者如何抓住这个契机，如何尽快适应新的局面，掌握新的技术，充分发挥该技术的优势从而更加深入地研究生命现象，将是未来几年里的一个主题。冷冻电镜技术是一个多学科交叉的技术，数学、物理学、计算机、材料、化学等自然科学将在未来冷冻电镜技术的发展中扮演重要的角色，未来冷冻电镜是否能够取代X射线晶体学，成为

今后结构生物学研究的主要工具，这一切都还是一个未知数。我国的结构生物学和仪器制造工作者应该抓住冷冻电镜所带来的全新机遇，不断缩小自身与世界先进水平的差距，努力赢得新技术变革所带来的挑战。