家蚕Apolipoprotein D基因克隆及功能分析

摘要 ................................................................................................................................ I ABSTRACT .................................................................................................................. V 第一章文献综述 (1)

1.1 载脂蛋白的研究概况 (1)

1.2载脂蛋白的分类与功能 (1)

1.3昆虫载脂蛋白研究概况 (2)

1.4 载脂蛋白D的概述 (3)

1.5载脂蛋白D的结构特征 (3)

1.6载脂蛋白D的研究现状 (4)

1.7载脂蛋白D在果蝇等昆虫中的研究进展 (6)

1.8 载脂蛋白D与脂类物质配体 (6)

1.9脂类物质激素与家蚕的变态发育 (7)

第二章引言 (10)

2.1研究背景及目的意义 (11)

2.2研究内容 (11)

2.3技术路线 (12)

第三章家蚕APODⅠ、APODⅡ的鉴定及生物信息学分析 (13)

3.1材料和方法 (13)

3.1.1实验材料 (13)

3.1.2实验仪器与试剂 (13)

3.2实验方法 (16)

3.2.1双向电泳的样品预处理 (16)

3.2.2等点聚焦电泳 (16)

3.2.3胶条平衡 (16)

3.2.4 SDS-PAGE电泳及IPG胶条转移 (16)

3.2.5蛋白质染色-银染 (17)

3.2.6银染样品的胶内酶解 (17)

3.2.7家蚕载脂蛋白D基因ApoDⅠ、ApoDⅡ的生物信息学分析 (18)

3.3实验结果 (19)

3.3.1家蚕血液及蜕皮液的双向电泳图谱 (19)

3.3.2双向电泳差异蛋白点的质谱鉴定 (20)

3.3.3 ApoDⅠ和ApoDⅡ基因的生物信息学分析 (20)

3.3.4载脂蛋白D基因（ApoDⅠ和ApoDⅡ）多序列比对与进化关系的分

析 (23)

3.3.5家蚕lipocalin家族表达芯片分析 (24)

3.4讨论 (26)

第四章家蚕载脂蛋白D基因APODⅠ,APODⅡ的原核表达、纯化和抗体制备29

4.1材料与方法 (29)

4.1.1.实验材料 (29)

4.1.2实验仪器与试剂 (29)

4.1.3主要试剂 (30)

4.1.4主要溶液配制 (31)

4.2实验方法 (35)

4.2.1 ApoDⅠ, ApoDⅡ基因的引物设计 (35)

4.2.2 RNA的提取及cDNA的制备 (35)

4.2.3重组载体的构建 (37)

4.2.4原核表达及检测 (40)

4.2.5大量重组蛋白的表达与纯化 (41)

4.2.6多克隆抗体的制备 (43)

4.3实验结果 (43)

4.3.1家蚕载脂蛋白D基因的原核表达载体构建 (43)

4.3.2家蚕载脂蛋白D基因的原核表达检测 (44)

4.3.3 ApoDⅡ重组蛋白的纯化 (45)

4.3.4 ApoDⅡ的MALDI-TOF/TOF质谱鉴定 (45)

4.3.5 ApoDⅡ多克隆抗体制备及特异性检测 (46)

4.3.6可溶性的家蚕载脂蛋白D的原核表达载体构建 (47)

4.3.7可溶性的家蚕载脂蛋白D的原核表达检测 (48)

4.3.8可溶性重组蛋白ApoDⅡ的纯化 (48)

4.4讨论 (49)

第五章家蚕APODⅠ、APODⅡ的表达特征分析及组织定位 (51)

5.1实验材料与仪器试剂 (51)

5.1.1实验材料 (51)

5.1.2主要仪器 (51)

5.1.3主要试剂 (52)

5.1.4主要溶液配制 (52)

5.2试验方法 (53)

5.2.1 RNA的提取及cDNA的制备 (53)

5.2.2 RT-PCR和Q-PCR检测 (54)

5.2.3家蚕蛋白样品的制备及Western Blot分析 (55)

5.2.4免疫荧光定位 (56)

5.3实验结果 (56)

5.3.1家蚕载脂蛋白D基因在组织水平上的表达特征 (56)

5.3.2家蚕ApoDⅡ在5龄3天家蚕各组织蛋白水平表达检测 (58)

5.3.3家蚕ApoDⅡ在各组织各时期的蛋白水平表达情况 (58)

5.3.4家蚕ApoDⅡ的免疫荧光定位 (59)

5.4讨论 (62)

第六章家蚕APOD的功能分析及调控初探 (63)

6.1实验材料与实验试剂 (63)

6.1.1实验材料 (63)

6.1.2实验仪器 (63)

6.1.3实验试剂与溶液配制 (63)

6.2实验方法 (64)

6.2.1紫外线和过氧化氢处理家蚕个体的实验 (64)

6.2.2细菌侵染家蚕个体实验 (64)

6.2.3蜕皮激素添加BmE细胞 (65)

6.2.4家蚕ApoDⅡ基因启动子预测 (65)

6.3实验结果 (65)

6.3.1家蚕个体在氧化应激压力下ApoDⅠ和ApoDⅡ基因的表达变化.65

6.3.2家蚕个体在细菌侵染后ApoDⅠ和ApoDⅡ基因的表达变化 (65)

6.3.3蜕皮激素在细胞水平诱导家蚕BmE细胞 (67)

6.3.4家蚕ApoDⅡ基因启动子序列转录因子结合点预测 (67)

6.4讨论 (67)

第七章综合与讨论 (71)

7.1家蚕血液和蜕皮液的蛋白质组学及生物信息学分析 (71)

7.2 ApoDⅠ和ApoDⅡ原核表达、纯化及抗体制备 (71)

7.3 ApoDⅠ和ApoDⅡ的表达特征及组织定位 (72)

7.4家蚕BmApoD的功能分析及调控初探 (72)

参考文献 (73)

硕士在读期间发表文章及参研课题 (77)

致谢 (79)

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家蚕Apolipoprotein D 基因克隆及功能分析生物化学与分子生物学硕士研究生陈世达

指导教师侯勇副教授

摘要

载脂蛋白D作为一种糖蛋白，主要存在于血液中的高密度脂蛋白（HDL），同时广泛分布于各组织中。载脂蛋白D主要作为脂类，固醇类物质的转运体，同时还参与中枢神经系统和周围神经系统的修复，免疫系统反应，抵抗外界压力信号，改变运动能力以及参与一些神经退行性疾病。载脂蛋白D广泛存在于不同物种中，通过由八个反向平行的β折叠形成的L-型桶状结构与一些疏水性的小分子结合，运输到靶组织，参与调控组织的发育等生理功能。载脂蛋白D在人类，小鼠，以及果蝇中有着深入的研究，然而在家蚕中研究却鲜有报道。

作为一种重要的鳞翅目经济性昆虫的家蚕，一直以来受到广泛的关注。同时家蚕在发育过程中伴随着巨大形态学和功能学的变化。利用蛋白质组学技术，我们从家蚕蛹后期鉴定出了两个具有lipocalin结构域的载脂蛋白D（Apolipoprotein D）基因，在SilkDB编号为BGIBMGA002703，BGIBMGA002704。

本研究主要通过生物信息学分析、基因克隆、原核表达、Western Blot技术、免疫组化、荧光定量PCR等方法鉴定到家蚕的两个载脂蛋白D蛋白，编号为BGIBMGA002703，BGIBMGA002704基因（ApoDⅠ和ApoDⅡ），并对其进行了克隆表达及抗体的制备研究，对其组织和时期表达特征进行探究及组织定位分析，同时对其功能进行了初步探究。主要研究结果如下：

1、家蚕载脂蛋白D(ApoDⅠ、ApoDⅡ)的鉴定及生物信息学分析；

通过对家蚕蛹后期的蜕皮液和血液的双向电泳分析，鉴定到了在SilkDB上编号为BGIBMGA002703，BGIBMGA002704的两个基因，基因定位于家蚕大造种的第五号染色体上，具体位置分别为nscaf2529:4191766..4194594 (+ strand)和nscaf2529:4202485..4205359 (+ strand)。芯片数据和RT-PCR显示，ApoDⅠ主要在家蚕的头部和精巢表达，ApoDⅡ主要在家蚕的头部和中部及后部丝腺表达。

基因组结构显示它们都具有4个外显子和3个内含子，结构域预测结果显示