乌骨藤中五环三萜类化合物的分离鉴定_张慧

乌骨藤中五环三萜类化合物的分离鉴定

张慧

1,2

　翟延君2　初正云2　韩炜3　裴志东

2

才凤1　张雪莹2　李玉新

*1

1

(东北师范大学国家教育部农业与医药基因工程研究中心,长春130024)

2

(辽宁中医药大学药学院,大连116600) 3(国家食品药品监督管理局药品审评中心,北京100038)

摘　要　利用硅胶柱色谱法、Sephadex LH -20凝胶柱色谱法及半制备高效液相色谱法,从乌骨藤的正丁醇萃取物中分离得到4种五环三萜类化合物。利用核磁共振谱、质谱、红外光谱等分析方法对化合物结构进行了分析和表征,确定了4种化合物分别为β-香树脂醇(β-a m yrin )、白桦酯醇(betulin )、白桦酯酸(be t u linic ac i d )和羽扇豆醇(l upeo l ),它们为首次在牛奶菜属植物中发现,其中后3种化合物具有抗肿瘤活性。关键词　乌骨藤,五环三萜,分离,鉴定,抗肿瘤活性

　2007-01-09收稿;2007-04-02接受本文系国家自然科学基金(N o .30670220,30472169)和吉林省科技发展计划(No .20060904)重点资助项目*E -m ail :s yyycs 2000@si na .co m

1　引　言

中药乌骨藤为萝藦科牛奶菜属植物通关藤M ars deni a tenocissi m a (Roxb )W igh t etA rn 的干燥藤茎,始载于《颠南本草》,主产于云南、贵州地区,具有清热解毒,止咳平喘、散结止痛等功效。现代药理已证实具有调节免疫功能、抗肿瘤等作用。目前临床上作为治疗肿瘤一线药物用于治疗胃癌、肝癌、宫颈癌

等[1]

。本研究利用硅胶柱色谱法、Sephadex L H -20凝胶柱色谱法及半制备高效液相色谱法,从乌骨藤正丁醇萃取物中分离得到4种五环三萜类单体化合物。有关中药乌骨藤化学成分研究多集中在甾体皂苷和多糖类成分,五环三萜类化学成分研究报道少见。本研究利用核磁共振谱、质谱、红外光谱等分析方法鉴定了4种化合物,即:β-香树脂醇Ⅰ、白桦酯醇Ⅱ、白桦酯酸Ⅲ、羽扇豆醇Ⅳ。它们为首次在中药乌骨藤和牛奶菜属植物中发现,其中后3种化合物具有抗肿瘤活性

[2,3]

。

2　实验部分

2.1　仪器与试剂

YANOCO MP -S 3型显微熔点测定仪(日本芝山制作所);B ruker -ARX -300型核磁共振仪(T M S 内标,瑞士Bruke r 公司);1100系列SL 离子阱质谱仪(美国安捷伦公司);Q -TofM icr o 高分辨质谱仪(英国M icr o m ass Inc .,M anchester );Bruke r I FS -55型傅立叶变换红外分光光度计(瑞士B ruke r 公司);W aters

半制备高效液相色谱仪(美国W aters 公司);1100分析型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。薄层层析硅胶GF 254、柱层析硅胶(青岛海洋化工厂);Sephadex L H -20凝胶(Pha r m ac ia 公司);甲醇为色谱纯(美国迪马公司);其它试剂为分析纯。

乌骨藤购于安国市杏林药材有限公司,经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为M ars -denia te nocissi m a (Roxb )W ight etA rn 的干燥藤茎。

2.2　样品的提取

取乌骨藤干燥药材50kg ,粉碎,分别用70%乙醇8倍、6倍量回流提取2次,每次2h ,合并2次提取液,减压浓缩至浸膏,加水溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯、水孢和正丁醇萃取3次,合并正丁醇萃取液,减压回收正丁醇并浓缩得浸膏392g 。2.3　样品的分离

2.3.1　硅胶柱和凝胶柱色谱分离　取上述正丁醇萃取后的浸膏114g ,经硅胶柱层析色谱分离,依次以

第35卷

2007年9月 分析化学(FENX I HUAXU E )　研究简报Chine se Journal o fA na l y tica lChe m istry

第9期

1377～1380

氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱,分段接收,共得到26个流分。其中流分2再经硅胶柱层析色谱分离,分别以石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱,收集体积比为100∶6和100∶18洗脱部分;流分4再经硅胶柱层析色谱分离,分别以氯仿-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱,收集体积比为100∶2和100∶15洗脱部分,其中体积比为100∶2的洗脱部分在氯仿中反复重结晶得化合物Ⅰ16.4m g 。体积比为100∶15洗脱部分再经Sephadex L H -20凝胶柱色谱分离,收集氯仿-甲醇混合溶剂(1∶2)洗脱部分。取上述3个洗脱部分,经TLC 检识,成分有所交叉,故将三者合并,甲醇超声溶解,备用。

2.3.2　半制备液相色谱分离　取上述溶液,用0.45μm 微孔滤膜滤过,注入半制备液相色谱仪。色谱条件为色谱柱:Pheno m enex K r o m asil C 18(250mm ×10mm .i d .,5μm );流动相:甲醇-水(98∶2,V /V );进样浓度:5g /L ;进样量:600μL ,流速:4m L /m i n ;柱温:25℃;检测波长:210nm 。根据色谱峰出峰时间接受流分,分离得到化合物Ⅱ23.6m g 、化合物Ⅲ30.1m g 和化合物Ⅳ27.1m g ,纯度>96%。2.4　样品结构的测试

取上述4种化合物分别进行核磁共振谱(NMR )、质谱(MS )、红外(I R )光谱的测试。NM R 测试条件:化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ以CDC l 3为溶剂,化合物Ⅲ以C 5D 5N 为溶剂,T M S 为内标;I R 测试条件:KB r 压片;HRMS 测试条件:离子源为API -ES ,正离子或负离子方式检测,去溶剂化气为N 2;低分辨ES I -M S 测试条件:离子源为ESI ,正离子和负离子方式检测,去溶剂化气为H e 。

3　结果与讨论

3.1　半制备液相色谱分离条件的优化

硅胶柱等分离得到的样品采用半制备液相色谱进行分离纯化。本实验对制备液相的色谱柱、流动相比例、进样浓度、进样体积及流速等进行了优化。选用了Zor bax C 18和Nuc leosil C 18、K r o m asilC 183种型号的色谱柱进行分离

[7]

,结果显示,K r o m asilC 18柱分离效果良好。分别选用了甲醇-水、甲醇-0.1%磷

酸和乙睛-水等不同比例流动相系统,结果显示:以甲醇-水(98∶2,V /V )为流动相分离效果良好。实验中发现,需制备分离的样品溶解度低,样品浓度过大,放置1h 即有沉淀析出。为此,进样浓度确定为5g /L 。实验对不同的进样体积进行优选,结果显示:进样体积大于600μL 时,柱子超载,化合物Ⅳ出现　图1　化合物Ⅱ～Ⅳ制备液相色谱图

F ig .1　P repa ra tive reversed phase li quid ch ro -

m atogra m o f compound Ⅱ-Ⅳ肩峰,故最终选用了600μL ;分离色谱图见图1。3.2　纯度的检测

制备分离所得的化合物Ⅱ～Ⅳ,采用分析型RPLC ,在203n m 、210n m 两个检测波长下测定纯度,结果显示:3种化合物在两个波长下均为单一色谱峰,纯度均高于96%。同时采用TLC 法,选用氯仿与甲醇的不同体积比例的展开剂对化合物Ⅰ进行纯度分析,结果化合物Ⅰ为单一斑点,证明4种化合物纯度满足进行结构光谱测试的要求。3.3　化合物结构鉴定

化合物Ⅰ:白色粉末,m p 197.0～198.0℃,Lieber m ann -Burchar d 反应呈阳性,TLC 板展开后,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热显紫红色。HRMS 测定值[M +Na ]

+

m /z 449.3754(C 30H 50ON a ,计算值449.3759),ESI -M S 给出准分子离子峰m /z 449.4[M +Na ]+

,427.4[M +H ]+

,结合1

H NMR 、13

C NMR 确定其分子式为

C 30H 50O 。I R (KB r )c m -1:3394(OH ),2922,2852,1469,1383(C H 3)。1

H NMR 谱中(CDC l 3),δ0.81、0.85、0.89(×2)、0.95、0.98、1.02、1.15(各3H ,s ),分别为8个甲基质子信号,δ3.24(1H ,dd ,J =5.2,10.9H z ,H -3),δ5.20(1H ,br .s ,H -12)。13

C NM R 谱中(CDC l 3),共给出30个碳信号,其中δ145.2和δ121.7为一对双键碳信号,δ79.0为连氧次甲基碳信号,δ15.0～56.0有27个SP 3

杂化的碳信号,13

C NM R 数据及归属见表1,结构式见图2。1

H NMR 及13

C NM R 波谱化学位移值与文献报道一致[4]

,故

鉴定该化合物为β-香树脂醇(β-a my ri n )。

1378

分析化学第35卷

化合物Ⅱ:白色粉末,m p 260.0～261.0℃,Lieber m ann -Burchar d 反应呈阳性,TLC 板展开后,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热显紫红色。HR M S 测定值[M +N a ]

+

m /z 465.3724(C 30H 50O 2Na ,计算

值465.3709);ESI -M S 给出准分子离子峰m /z 465.3[M +Na ]+

,443.2[M +H ]+

,结合1

H NM R 、13

C NMR 确定其分子式为C 30H 50O 2;I R (KB r )c m

-1

:3392(OH ),1643,882(C CH 2);1

H NM R 谱中

(CDC l 3),δ0.77、0.83、0.98、0.99、1.03、1.69(各3H ,s ),分别为6个甲基质子信号,δ3.19(1H ,dd ,J =5.2,10.9H z ,H -3),δ3.34(1H ,d ,J =10.8)、δ3.81(1H ,d ,J =10.7H z )为28位上一对末端羟甲基质子信号,δ4.59,δ4.69(1H ,br .s ,H -29);13

C NM R 谱中(CDC l 3),共给出30个碳信号,其中δ150.5、δ109.7为一对双键碳信号,δ79.0和δ60.6为连氧次甲基碳信号,δ14～56有26个SP 3

杂化的碳信

号,13C NMR 数据及归属见表1,结构式见图2。1H NMR 及13C NM R 波谱化学位移值与文献报道一致[5],故鉴定该化合物为白桦酯醇(betu lin )。

化合物Ⅲ:白色针晶,m p 280.0～282.0℃,Lieber m ann -Burchar d 反应呈阳性,TLC 板展开后,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热显紫红色。HR M S 测定值[M -H ]-m /z 455.3513(C 30H 47O 3,计算值

455.3525),ES I -M S 给出准分子离子峰m /z 479.3[M +N a ]

+

,457.2[M +H ]+

,455.1[M -H ]-

;结

合1

H NM R 、13

C NM R 确定其分子式为C 30H 48O 3。I R (KBr )c m -1

:3449(OH ),1686(C O ),1641,885

(C

CH 2);1

H NM R 谱中(C 5D 5N ),δ0.81,δ1.00,1.04,1.06,1.22,1.78(各3H ,s ),分别为6个甲基

单峰信号,δ3.46(1H ,m ,H -3),δ4.76、δ4.94(1H ,br .s ,H -29);13

C NMR 谱中(C 5

D 5N ),共给出30个碳信号,其中δ178.9为羰基碳信号,δ151.4和δ110.0为一对双键碳信号,δ78.1为连氧次甲基碳信号,

δ14.0～56.0有26个SP 3杂化的碳信号,13C NM R 数据及归属见表1,结构式见图2。1H NM R 及13

C NM R 波谱化学位移值与文献报道一致

[5]

,故鉴定该化合物为白桦酯酸(betuli n ic acid )。

表1　化合物Ⅰ～Ⅳ的13C NM R 数据归属(化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ:CDC l 3;化合物Ⅲ:C 5D 5N )Table 1　The 13C NM R spe ctra da t a o f Compound Ⅰ～Ⅳ(C o m pound Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ:CDC l 3;Compound Ⅲ:C 5D 5N )

No .ⅠⅡⅢⅣNo .ⅠⅡⅢⅣC -1

38.638.7

39.538.7C -1626.129.232.9

35.6C -226.927.428.327.5C -1732.547.856.643.0C -379.079.078.179.0C -1847.247.847.848.3C -438.838.839.338.9C -1946.848.749.848.0C -555.155.355.955.3C -2031.1150.5151.4151.0C -618.418.318.818.3C -2134.729.730.329.9C -732.634.234.834.3C -2237.134.037.540.0C -839.840.941.140.8C -2328.128.028.729.7C -947.650.451.050.4C -2415.615.316.315.4C -1037.037.337.537.2C -2515.516.016.416.1C -1123.520.821.220.9C -2616.816.116.416.0C -12121.725.226.125.2C -2726.014.714.914.6C -13145.237.138.638.1C -2827.260.6178.918.0C -1441.742.742.942.8C -2933.3109.7110.0109.3C -15

28.4

27.

31.2

28.

C -30

23.

7

19.1

19.5

19.3

图2　化合物Ⅰ～Ⅳ的化学结构式

F ig .2　Che m ica l struc t ures o f Co m pound Ⅰ～Ⅳ

1379

第9期张慧等:乌骨藤中五环三萜类化合物的分离鉴定

化合物Ⅳ:白色粉末,m p 174.0～175.0℃,Lieber m ann -Burchar d 反应呈阳性,TLC 板展开后,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热显紫红色。H R M S 测定值[M +N a ]+

m /z 449.3742(C 30H 50ON a ,计算值

449.3759);ES I -M S 给出准分子离子峰m /z 449.3[M +Na ]

+

,427.3[M +H ]+

,结合1

H NM R 、13

C NMR

确定其分子式为C 30H 50O ;I R (KBr )c m -1

:3356(OH ),1640,881(C

CH 2);1

H NMR 谱中(CDC l 3),

δ0.76、0.79、0.83、0.95、0.97、1.03、1.68(各3H ,s ),分别为7个甲基质子信号,δ3.19(1H ,dd ,J =5.3,10.8H z ,H -3),δ4.57,δ4.69(1H ,br .s ,H -29)。13

C NM R 谱中(CDC l 3),共给出30个碳信号,其中δ151.0和δ109.3为一对双键碳信号,δ79.0为连氧的次甲基碳信号,δ14～56有27个SP 3

杂化的碳信号,13

C NMR 数据及归属见表1,结构式见图2。1

H NMR 及13

C NM R 化学位移值与文献报道一致[6]

,故鉴定该化合物为羽扇豆醇(l u peo l )。在牛奶菜属植物中首次分离得到的以上4种化合物中羽扇豆醇、白桦酯醇、白桦酯酸对肿瘤细胞均有细胞毒活性[2,3]

,化合物Ⅰ～Ⅳ在乌骨藤药材中的含量分析有待于进

一步研究。R eferences

1　X ing W ang -X ing (邢旺兴),Cheng Rong -Zhen (程荣珍),Chen Y uan -X in (陈园昕),G uo Sheng -Cai (郭胜才).Central South Phar m acy (中南药学),2003,1(4):229～231

2　H a ta K ,Ishika w a K ,Ho ri K ,K onishi T .B iol .Phar m.Bull .,2000,23(8):962～967

3　L akurtti S ,M ake l a T ,K o ski m i e s S ,Y li -K auha l uo m a J .Eur .J.Phar m.Sci .,2006,29(1):1～13

4　W ang Jing -Y uan (王静媛),T i an Fu -L i (田福利),F ang L i (方　利).Tucker D.Ch i nes e J.Phar m.Ana l .(药物分析杂志),2005,25(9):1019～1021

5　M u tai C ,A ba tis D ,V agias C ,M o reau D ,R oussak is C ,R oussis V.Phy toche m istry ,2004,65(8):1159～11646　T ene M ,T ane P ,Sondengam B L ,Conno ll y J D.Phytoche m istry ,2004,65(14):2101～2005

7　Peng Jin -Yong (彭金勇),F an G uo -Rong (范国荣),W u Y u -T ian (吴玉田),ChenH ong -Yuan (陈洪渊).Ch i nes e J.Ana l .Che m.(分析化学),2006,34(7):983～986

Isolati on and Identifi cati on of Pentacyclic Tr iterpenoi ds

Fro m Cau lis M arsden i ae Tenocissi m ae

Z hang H ui 1,2,Z hai Y an -J un 2,Chu Zheng -Y un 2,H an W ei 3,Pe i Zh i -Dong 2,

Ca i F eng 2,Z hang X ue -Y ing 2,L i Y u -X i n *1

1

(Research C enter of Agri culture and M edicine Gene Engineeri ng ofM i nistr y of Educa ti on ,

N ortheast N or m alUn i versity ,Changchun 130024)

2

(Depart men t of dr ug ,L i aoni ng Universit y of Traditional Ch i nes e M edici ne ,Da lian 116600)

3

(C enter f orD r ug E valuati on of State Foo d and D r ug Ad m inist rati on ,B eiji ng 100038)

Abst ract By using silica ge l co l u m n chro m atography ,Sephadex L H -20chro m atography and se m i -preparati v e r eve rsed phase li q u i d chro m atography ,f o ur pentacyc lic trit e r peno i d s w ere iso lated fro m n -butano l ex tr act o f

caulisM arsdeniae tenocissi m ae .The ir str uct u r es w ere identified as β-a m y rin ,be t u lin ,be t u linic aci d ,l u peo l r especti v e l y on the basis ofNM R ,MS and I R spec tral da ta .They w ere iso lated fr o m M arsden ia genius for the first ti m e .Am ong the m ,betulin ,betulinic acid and l u peo l have an ti -tu m o r activity .K eywords Cau lis mars de n i a e tenocissi m ae ,pentacyc lic trite r penoids ,iso lation ,identification ,anti -tum or acti v it y

(Received 9January 2007;accepted 2Ap ril 2007)

1380

分析化学第35卷