微生物鉴定技术发展历程
北京出入境检验检疫局技术中心食品微生物室曾静博士
2015.9
微生物的发现：
微生物学作为一门科学诞生于1674年。
是由充满好奇心的荷兰的布料商人Antony Van Leeuwenhoek（1632－1723）用一个经过他精心打磨的玻璃镜片去观察一滴湖水
微生物学家Robert Hooke（1635-1703）成为第一个看到真菌的人。在1665年，他发表了关于真菌的描述，他叫它们“微小的蘑菇”。他对样本的描述非常精确，后来被确认为面包霉。
食品、化妆品等产品
微生物鉴定技术在微生物检验工作中承上启下
?微生物鉴定就是将微生物分类到“种”或者以下的过程；
?“种”的定义：是分类系统中最基本的单位。种经常定义为：具有杂交繁殖能力并产生后代的一大群生物有机体。
?检验检疫工作中的微生物鉴定主要是判断该种菌是不是目标的致病菌，个别时候也需要判断新发现的菌是什么菌，其中后者需要做的实验更加完善，需要多种方法的相互参考、印证才能确定。
?目前鉴定技术的发展有两个方向：一是强调速度快，可以在数十秒内实现微生物的鉴定，以时间分型质谱为代表；二是强调分型能力，以各种基于DNA的鉴定技术为代表。
?选择哪种方式，应由工作中的需要入手。
微生物鉴定技术发展历程回顾
——形态?用于微生物鉴定的形态学特征：
?用于微生物鉴定的生理生化反应特征：
基于手工的形态学观察和生理生化反应，相对都比较繁琐，时间长，而且需要相对丰富的经验，操作无法完全标准，因而近年来被全自动微生物鉴定系统逐步替代。
——全自动?全自动微生物鉴定系统，将生化反应
有效整合，并浓缩于商业化的板卡上，方便了实验室进行微生物鉴定。?全自动生化鉴定系统的优点：
?生化反应数量多，商业化的板卡最
多可集合45-46种生化反应；
?实验操作标准化，节省大量人工；
?鉴定速度快，采用边孵育边检测的
实时动态检测模式，一般3-4个小
时即可出结果。
?目前，全自动微生物鉴定系统已作为
实验室的日常鉴定手段。
?全球每年消耗的抗生素总量中90%被用于畜禽养殖业，耐药性微生物不可避免地产生，尤其是人畜共患病的耐药性病原菌株种类多、增长快；
?耐药基因又可随细菌繁殖垂直传代，并且具有耐药因子的细菌可通过环境、饲料、肥料和食品等环节在动植物、微生物和人之间传播，进入食物链和流通环节的耐药性病原菌，将使消费者承担更大的食品安全风险；
?国际上一些发达国家已集合医学卫生、食品安全和农业领域的资源，开展了“耐药性致病菌”的监测与研究工作，例如：美国NARMS 网、欧盟EARSS网、亚洲耐药性致病菌监测网ANSORP；还有许多国家正在策划对进口动物产品进行耐药性微生物的检
关国家采取SPS协议措施，设置动物产品进口的限制
?
全自动微生物鉴定仪都具备利用微量肉汤稀释法，进行药敏实验的功能，可以在进行微生物鉴定的同时，得到微生物耐药的信息；
?
美国临床和实验室标准化协会(CLSI)对微量稀释法做了详细的规定，要求微量稀释法中抗生素的浓度应为倍比稀释，如2、4、8、16等浓度设置，这样测得的MIC 值（最小抑菌浓度），才能与CLSI 的规定的抗生素折点、耐药/中介/敏感（S/I/R ）等结果进行比较。
?
部分商业化的微生物鉴定/药敏系统，除了可以测定MIC 值，获得S/I/R 信息外，还可以直接给出耐药表型，如ESBL 、MRSA 、VRE 、BL 、HLSR 、HLGR 在内的多种耐药表型，这个过程无需附加实验，对与报告耐药菌的监测结果，十分便利
。
鉴定实验
药敏测试
?追求鉴定的速度，采用基于蛋白质检测的鉴定技术
ü时间飞行质谱鉴定（MALDI-TOF MS）?追求分型的能力，采用基于DNA检测的鉴
定技术
ü16S rDNA测序技术
üPFGE
ü全基因组测序技术
MALDI-TOF 质谱鉴定系统
?利用MALDI-TOF进行微生物鉴定的原理：通过质谱获得微生物特征蛋白质分子的“指纹图谱”，然后与大容量的数据库进行比对，最终实现菌种或者菌株水平上的鉴定。
?用于微生物鉴定的MALDI-TOF技术，被评为“2012年度临床医学的十大创新技术”。
?核糖体蛋白质等高丰度蛋白质成分在细胞内稳定存在，不因培养条
件的变化而变化，检测结果的稳定性非常高；
?但不同微生物之间，核糖体蛋白质的种类不同，因而可作为微生物
鉴定和分型的依据。
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Biotyper TM 软件及
库鉴别微生物纯培养菌落
挑取单菌落至样品板，滴加化学试剂，等待挥发. （仅有的人工操作）送入机器，自动进行MALDI-TOF 蛋白质指纹谱的鉴定方法；处理。
?鉴定速度快，一个微生物鉴定仅需
十余秒即可完成；
?微生物数据库大，超过2000种微生
物；
?鉴定操作最简单；
?“指纹图谱”具有一定的溯源价值
，即可以在菌株水平上实现分型。
5株马耳他氏菌的图谱具有差异
利用聚类分析软件和主成速
基于DNA检测的微生物鉴定方法
今天主要介绍三个常见的代表技术：
16S rDNA测序、PFGE、全基因组测序技术。
微生物检验技术试题
《微生物检验技术》期末考试试题(A 卷) 一、名词解释(每小题3分，共15分) 1、菌落 2、正常菌群 3、消毒 4、噬菌体 5、最小抑菌浓度（MIC ） 二、填空题（每空1分，共25分） 1．细菌的特殊结构 有 、 、 、 。 2.细菌生长繁殖的条件是 、 、 和气体。 3．病原菌的致病作用与 、 及 有密切关系。 4.诊断血清是用 免疫家兔等动物后取其 而制成的。一般置于 保存，使用时应避免 ， 降低效价。
5．K—B法中抑菌圈直径的大小与药物的最低抑菌浓度呈关系，即抑菌圈愈大，MIC值、细菌对药物的敏感程度。 6．、和可作为甲型溶血性链球菌与肺炎链球菌的鉴别试验。 7．淋病奈瑟菌主要以方式传播，引起。 8.细菌对待测药物的敏感程度可分为、、 三级。 三、选择题(每小题1.5分，共30分)： 1、属于非细胞型微生物的是（） A、真菌 B、细菌 C、放线菌 D、病毒 E、螺旋体 2、革兰染色所用染液的顺序是（） A、稀释复红—碘液—95％乙醇—结晶紫 B、稀释复红—95％乙醇—碘液—结晶紫 C、结晶紫—碘液—95％乙醇—稀释复红 D、结晶紫—95％乙醇—碘液—稀释复红 E、稀释复红—结晶紫—碘液—95％乙醇 3、靛基质试验又称（） A、甲基红试验 B、尿素分解试验 C、硫化氢生成试验 D、吲哚试验 E、糖发酵试验 4、对人体无害的细菌代谢物是（）
A、热原质 B维生素 C、外毒素 D、内毒素 E、侵袭性酶 5、正常人体不存在细菌的部位是（） A、体表 B、口腔 C、大肠 D、尿道口 E、血液 6、实验室对接种针（环）、试管口的灭菌方法是（） A干烤法 B、流通蒸汽法 C、烧灼 D、焚烧 E、煮沸法 7、卡介苗是由何种变异而产生的（） A、形态变异 B、结构变异 C、毒力变异 D、耐药变异 E、酶活性变异 8、病原菌侵入血流并在其中大量繁殖，产生毒性代谢产物，引起严 重的全身症状，称为（） A、毒血症 B、菌血症 C、败血症 D、脓毒血症 E、 病毒血症 9、哪种动物不是微生物学检验中常用的实验动物（） A、小白鼠 B、豚鼠 C、裸鼠 D、家兔 E、马 10、下列哪项不是金黄色葡萄球菌的特点（） A、凝固酶试验阳性 B、产生溶血素 C、分解 甘露醇 D、产生耐热核酸酶 E、胆汁溶菌试验阳性 11、在普通琼脂平板上生长的化脓性细菌是（） A、金黄色葡萄球菌 B、乙型链球菌 C、肺炎
微生物常规鉴定技术
微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
新版GMP与快速微生物检测鉴定技术
A B C D 高鹃 新版GMP 与快速微生物检测鉴定技术新版GMP 与 快速微生物检测鉴定技术 3.快速鉴定技术 4.法规与药典要求 第一部分引言无菌药品生产要求的大幅度提高 新版GMP 无菌药品附录 以上各级别空气悬浮粒子的标准规定如下表： 洁净度级别 悬浮粒子最大允许数静态 ≥0.5μm ≥5.0μm A 级(1) 352020B 级352029C 级3520002900D 级 3520000 29000 洁净级别 浮游菌cfu/m 3 沉降菌（φ90mm ）cfu /4小时 表面微生物 接触cfu /碟（φ55m m ） 5指手套cfu /手套A 级<1<1<1<1B 级10555C 级1005025 － D 级 200 100 50－ 洁净区微生物监测的动态标准 工业工程技术要求隔离装置隔离器Rabs RTP 公用工程 水系统空调系统氮气压缩 空气真空传送系统动态环境监测系统粒子监测沉降菌浮游菌
动态环境监测带来的新课题 １、大量数据的管理和分析 ２、面对细菌培养阳性结果发生争执 是生产管理方面的问题？ 是QC 的OOS ？３、细菌培养阳性结果的后续处理明确what where who how 革兰氏染色无法判定 无菌药品生产要求的大幅度提高 未污染 ？ 无菌药品生产要求的大幅度提高 无菌药品附录： 产品的无菌或其它质量特性绝不能只依赖 于任何形式的最终处理或成品检验（包括无菌检查）。 微生物检测技术的飞跃发展 快速检测技术（不需进行培养PAT ）快速鉴定技术（属种株）为无菌药品生产和质量管理提供了先进技术手段及时发现污染，追溯污染源 案例： 爱吃桔子的员工 一直难以去除的革兰氏阳性短棒状菌燃烧麦秸杆与无菌药品生产车间
微生物检验常规鉴定技术
第一章微生物检验常规鉴定技术 课堂教学计划（1学时） 第一章微生物检验基本知识 包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。 接种、分离纯化和培养技术
一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C 左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至
梅里埃全自动微生物鉴定仪参数
设备名称：全自动微生物鉴定及药敏分析系统 一、具体用途：对食品，环境中的微生物进行快速，全自动的鉴定及药物敏感性测试。 二、技术参数与性能要求： 1. 系统可同时处理》30个标本，系统具有扩容功能，至少可以两台联机； 2. 分析组件可对环境中和食品中的细菌进行全自动鉴定，种类包括革兰阴性菌、革兰阳性 球菌、革兰氏阳性杆菌、酵母样真菌、假丝酵母类真菌、苛养菌、厌氧菌及棒状杆菌等的 鉴定； 3. ★分析组件可对芽孢杆菌进行全自动鉴定； 4. ★大于500种可鉴定细菌，鉴定结果通过美国FDA认证，细菌鉴定采用GB推荐生化鉴定 显色法，药敏检测采用比浊法，并且鉴定方法原理可在GB4789中查询（提供具体细菌库）； 5. ^分析组件可自动进行革兰阴性菌、革兰阳性菌、酵母样真菌、肺炎链球菌等药敏试验， 以上所有药敏试验均得到美国FDA批准用于临床应用（提供FDA证明资料）； 6. ★在对标本的鉴定及药敏试验过程中，无需添加任何额外附加试剂； 7. 快速全自动对细菌进行鉴定和药敏试验，采用实时检测系统，系统每隔15分钟对试剂卡 进行一次扫描读数，一旦确认结果，可马上出报告； & ★细菌最快鉴定时间V 4个小时，平均鉴定时间不超过5小时； 9?最快药敏实验时间5小时，平均药敏实验时间不大于6小时； 10. ★系统可同时进行鉴定和药敏实验，并且可同时上机的鉴定试剂卡种类不少于4种，可 同时上机的药敏试剂卡的种类不少于6种； 11. ★系统自动填充悬浮液至试剂卡，自动密封拭卡，并自动将拭卡装载于设备内置读数系 统/孵育系统，测试结束时可自动丢弃拭卡，操作都在仪器内部自动进行，不需要额外设 备； 12. 卡片填充菌液后为封闭式卡片，不会造成污染； 13. ★鉴定卡和药敏卡必须独立包装； 14. 鉴定卡应至少提供3种不同试剂的SFDA注册证； 15. 药敏卡应至少提供5种不同试剂的SFDA注册证； 16. 测试完成后，经分析软件分析后得出结果并可自动打印报告，并保存结果； 17. 具备中文报告软件系统； 18?双向联网软件，可传输报告结果；
微生物检测标准
微生物取样方法、微生物检测标准 举例一： 一、空气采样及检验方法 1培养基：普通营养琼脂平板，按GB4789.28中3.7条配制 2采样（空气沉降法） 2.1布点：面积小于30平方米的车间，设一对角线，在线上取3点，即中心一点，两端在距墙1米处各取一点；面积大于30平方米的车间，设东、西、南、北、中5个点，其中东、西、南、北点均距墙1米。 2.2采样高度：与地面垂直高度80-150厘米。 2.3采样方法；用直径为9厘米的普通营养琼脂平板在采样点上暴露20分钟盖上送检培养。 3培养：于37℃培养24小时。 4检测频率：每周 空气质量标准： 生车间、熟车间、成品车间：低于100个 半成品库、成品库：低于10个 二、设备的采样与检验方法 根据生产过程所要求的重点卫生部位，实验室对其进行涂抹采样，进行细菌总数检验。 1采样方法 1.1涂抹法（适用于表面平坦的设备和工器具产品接触面） 取经过灭菌的铝片框（框内面积为50平方厘米）放在需检查的部位上，用无菌棉球蘸上无菌生理盐水擦拭铝片中间方框部分，擦完后立即将棉球投入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。 1.2贴纸法（适用于表面不平坦的设备和工器具接处面） 将无菌规格纸（5×5厘米，纸质要薄而软）用无菌生理盐水泡湿后，于需测部分分别贴上两张，两张纸面积共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。 2检验方法 2.1细菌总数的检验 将上述样液充分振摇，根据卫生情况，相应地做10倍递增稀释，选择其中2-3个合适的稀释度作平皿倾注培养，培养基用普通营养琼脂，每个稀释度作2个平皿，每个平皿注入1毫升样液，于37℃培养24小时后计菌落数。 结果计算 表面细菌总数（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数/30×2 2.2致病菌的检验 沙门氏菌，参照GB4789.4进行 金黄色葡球菌，参照GB7918.5进行 4.检验合格标准：细菌总数10－100个∕cm2， 5.关键点：细菌总数≤10个∕cm2 一般区域：细菌总数≤100个∕cm2 三、人员手表面细菌污染情况的检验
微生物自动化鉴定系统的工作原理
微生物自动化鉴定系统的工作原理 微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配 套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药 敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。 一、微生物数码鉴定法 早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作 提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和 形成独特的不同细菌鉴定系统。如、、、和等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。 ( 一)数码鉴定法基本原理 数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索 本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并 比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。 1．简要介绍计算步骤： (1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以1
00的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0 .99值代替。 (2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。 (3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（） (4)在每个菌群中，再按值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T 值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，个体与总体越接近，鉴定价值越大。按大小排序，将相邻两项的之比为R， 代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果≥80，参考T及R值可作出鉴定。 2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以鉴定系统为例）。 (1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（和T值）。②对鉴定结果好坏的评价，最佳……等。 ③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结 果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。 (2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否 纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。 3. 结果解释
2020年(生物科技行业)微生物常规鉴定技术
（生物科技行业）微生物常 规鉴定技术
微生物常规鉴定技术 壹、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同壹种的细菌在壹定条件下，培养特征却有壹定稳定性。，以此能够对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的壹项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性仍是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如
青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。 革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）俩大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这俩类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法和简单染色涂片相同。 （2）晾干：和简单染色法相同。 （3）固定，和简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。
表面微生物检测SOP
一. 目的： 本规程规定了COL洁净区（D级）、ME洁净区（D级）、万古霉素洁净区（C级）、菌种（A级、C级、D级）、QC（A级、C级、D级）、取样车（C级）等（包括五指手套和设备?设施等）表面微生物的检测。 二. 检测依据： 中国GMP 、日本药局参考信息、ISO14644、EU-GMP 三. 术语： 1.静态atrest 洁净设施建造完成，生产设备就位，并按客户与供应商议定的条件运行，但无人员在场的状态。 2.动态operational 洁净设施按规定方式运行，规定数量的人员按议定方式工作的状态。 四. 测试方法 1. 表面微生物测试用培养基： （1）沙氏葡萄糖琼脂培养基：（也可使用市售配制好的培养基）： 按照使用说明书称取适量培养基于纯化水中，加热溶化后过滤，用PH计调节pH值至适当范围（略高0.2～0.4），保证灭菌后培养基pH值为5.6±0.2，按需要分装，在121±1℃灭菌15分钟，使用前进行培养基性能确认并做空白培养。 （2）大豆酪蛋白消化物琼脂培养基：（也可使用市售配制好的培养基）： 按照使用说明书称取适量培养基于纯化水中，加热溶化后过滤，用PH计调节pH值至适当范围（略高0.2～0.4），保证灭菌后培养基pH值为7.3±0.2，按需要分装，在121±1℃灭菌15分钟，使用前进行培养基性能确认并做空白培养。 2 培养基平皿的制备 将需要灭菌的培养皿置于121±1℃湿热灭菌15分钟，将培养基加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿,培养基的注入量不能太多也不能太少,要尽量注满整个培养基。待琼脂在室温下凝固后，在双碟上写上所检测位置的编号,将大豆酪蛋白
表面微生物检测标准操作规程
目的：建立洁净室（区）中表面微生物测试标准操作规程，保证药品在规定洁净级别内进行生产。 范围：适用于洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物量的测试。职责：质量管理部、QA检测员 内容： 1、测试方法:擦拭法 2、仪器、设备、培养基 2.1培养皿：Φ90mm×15mm 培养皿 2.2培养基：营养琼脂培养基 2.3生化培养箱：必须定期对生化培养箱进行校验。 2.4自动台式灭菌器：使用时应严格按照仪器说明书操作。 3、采样位置和采样点数 3.1根据洁净区内设施、设备等表面对产品和洁净室环境的影响程度，通常将表面分为三类：关键表面（与产品、容器及密封件直接接触或暴露于产品、容器及密封件的表面）、一般表面（如设备的外表面、墙壁等）和地板。 3.2表面微生物监测的取样点数依据下列因素确定： 3.2.1洁净区（室）的大小； 3.2.2设备、管路等的复杂程度； 3.2.3生产活动的重要性； 3.2.4易受污染的部位。如关键功能间的门、地面、墙面、生产设备的关键部位等。 3.3不宜每次固定在同一点取样，应在取样点附近的不同位置取样，使测试结果更具代表性。 4、采样量：表面微生物取样面积宜控制在25cm2左右。
5、测试状态及时间：动态测试。 6、测试 6.1依据测试区域的取样点数，按照《培养基配制标准操作规程》制备适量的营养琼脂培养基。 6.2将灭菌的棉签用灭菌注射用水润湿（棉签容易脱落纤维，故在使用前应先用注射用水预先清洗，以免纤维遗留在取样表面），并将其靠在瓶上挤压以除去多余的水分。 6.3将棉签按在取样物表面上，用力使其稍弯曲，平稳而缓慢地擦拭取样表面约25cm2，擦拭过程应覆盖整个表面。 6.4翻转棉签，让棉签的另一面也进行擦拭。但与前次擦拭移动方向垂直。 6.5擦拭方法如图： 6.6擦拭完成后，将棉签放入无菌试管中并密封，检测时，加入15ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，取1ml样液注入到培养平皿中，加入约15ml配置好的营养琼脂培养基充分混匀，待培养基凝固。 7、培养：取样结束后将平皿复倒置于生化培养箱内35℃培养72小时，并以未采样的营养琼脂平皿作对照皿。 8、菌落计数 8.1培养结束，将上述培养后的平皿取出，用肉眼直接计数，逐个点计菌落数，然后用5-10倍放大镜检查，是否遗漏，并记录。 8.2若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，可分辨时，仍以2个或2个以上的菌落计数。 9、结果评定 9.1每个采样点的菌落数必须低于所选定的评定标准。
9204 微生物鉴定指导原则
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微生物鉴定指导原则
本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定， 以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药 品微生物检验中的重要环节， 药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则 1106）中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法” （通则 1101） 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则（通则 9203）建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在 药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中， 对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法，某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关， 未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户
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2015版药典表面微生物检测操作规程
题目：洁净区（室）表面微生物监测标准操作规程 编码：颁发部门：质量部 起草：日期：2015年月日修订日期：年月日 审核：日期：2015年月日生效日期：2016年月日 批准：日期：2015年月日发放份数：版次：第1版 分发部门：质量部、中心化验室 1.目的：建立表面微生物测试标准操作规程，保证测试人员操作规范化、标准化。 2.范围：适用于洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物量的测试。 3.责任：表面微生物检测员。 4.内容： 4.1基本概念： 4.1.1菌落:细菌培养后,由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落,简称CFU.通常用个数表示。 4.1.2表面微生物： 4.1.3表面微生物菌落数: 规定面积的洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面，用接触平皿法或擦拭法检测的微生物的菌落数目，以个/皿表示。 4.2测试原理: 本测试方法利用接触平皿法或擦拭法收集洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物，经若干时间，在适宜的方法和条件下让其繁殖到可见的菌落数，以平板培养皿中的菌落数来评定洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。 4.3测试方法： 4.3.1使用的仪器设备和培养基: 高压消毒锅:使用时应严格按照操作规程进行。 恒温培养箱:必须定期对培养箱的温度计进行检定。 培养皿:一般采用φ90mm×15mm玻璃培养皿。使用前将培养皿置于160℃干热灭菌120min。 接触碟：一般采用φ55mm无菌接触碟。 培养基:胰酪大豆胨琼脂培养基。 将培养基加热熔化，冷却至约45℃在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入32℃恒温培养箱中培养
VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用
VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。VITEK已被许多国家定为细菌最终鉴定设备，并获美国药品食品管理局（FDA）认可。该系统有高度的特异性、敏感性和重复性，还具有操作简便、检测速度快的特点，绝大多数细菌的鉴定在2～18 h内可得出结果。现将该系统的工作原理、主要结构、功能并结合我们使用后的一些体会介绍如下。 1工作原理 VITEK对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的VITEK试卡（检测卡）含有多种的生化反应孔，可达30种。将手工分离的待检菌的纯菌落制成符合一定浊度要求的菌悬液，经充填机将菌悬液注入试卡内，封口后放入读数器/恒温培养箱，根据试卡各生化反应孔中的生长变化情况，由读数器按光学扫描原理，定时测定各生化介质中指示剂的显色(或浊度反应，然后把读出信息输入电脑储存并进行分析，再和预定的阈值进行比较，判定反应，再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较，最后鉴定报告将在显示器上自动显示)并在打印机上自动打印。 2VITEK系统的结构组成 2.1检测卡 目前VITEK系统的检测卡有14种，微生物常用的有7种，即：革兰氏阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰氏阴性菌卡（GNI+）、非发酵菌卡（NFC）、酵母菌卡（YBC）、厌氧菌卡（ANI）、芽胞杆菌卡（BAC）、奈瑟氏菌嗜血杆菌卡（NHI），以及药敏检测卡等。每张检测卡对应接种1份标本，检测卡为一次性消耗品。 2.2充填机将待测菌的菌悬液注入试卡内。 2.3读数器/恒温箱可在培养过程中定时读出细菌在试卡内培养基中的生长变化值。 2.4电脑主机/显示器/键盘/打印机用于储存和分析资料、系统的操作和结果分析鉴定，实验结果的自动显示报告和打印。 2.5电源稳压器和UPS在外围断电的情况下提供电脑主机约10 min持续电源。 3VITEK系统的功能
微生物分类鉴定
第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平； 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。 （一）、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )
BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 （二）、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。 图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图
洁净室(区)表面微生物的检验操作规程
洁净室(区）表面微生物的检验操作规程 目的：建立一个洁净室(区）表面微生物的检验操作规程。 范围：适用于本公司的洁净室（区）表面微生物的测定。 责任：洁净室（区）表面微生物的检测人员、化验室主任及质量部部长对实施本规程负责。 内容： 1.标准依据 《药品生产质量管理规范》（2010版） 2.洁净区测试点选择 表面微生物监测的采样点数目及布局根据以下几个方面设置: 2.1 空调系统验证的结果 2.2 房间的大小和布局 2.3房间的用途 2.4与产品的距离 2.5 人流物流方向 对于同一洁净区，每个相同的取样物体在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点。 3.洁净区微生物测试频率和限度 3.1 日常监控一月一次 3.2接触碟（φ55mm）50cfu/25cm2,警戒40cfu/25cm2纠偏45 cfu/25cm2。
4.洁净区表面微生物测试方法（接触平皿法） 4.1洁净区表面微生物测试必须在动态下监测。 4.2 取样：取样时打开碟盖，无菌培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样点表面均匀充分接触，接触约5秒钟，再盖上碟盖。 4.3 取样后，应立即用75%酒精喷洒被取样表面，以除去残留琼脂。 4.4 培养：收好的营养琼脂接触碟在30-35℃培养3天，以所有采样点的平均值加和报告最终结果。 5.偏差纠正 一旦发现表面微生物检测结果超标，可以采用以下行动进行调查和评估： 5.1 检查取样和样品的处理是否正确，包括取样人员的资质是否确认； 5.2 回顾最近一次的悬浮粒子数的检测结果； 5.3 回顾最近一次的沉降菌的检测结果； 5.4 检查人员的更衣程序是否正确； 5.5 检查清洁设备和消毒剂的质量； 5.6 查看操作员工的培训记录。 6.洁净区表面微生物的趋势分析 每年应对洁净区表面微生物进行趋势分析。如果发现表面微生物有增加的趋势，应立即通知质量部，展开调查。根据调查结果采取相应的行动对系统进行纠正。 合格标准： 级别b浮游菌沉降碟接触碟5指手套
微生物鉴别方法
微生物鉴别方法 一、微生物鉴别方法——传统方法 在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。 1、形态学特征 （1）细胞形态 在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。（2）群体形态 群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。 2、生理生化反应特征 （1）利用物质的能力
包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。 （2）代谢产物的特殊性 这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。 （3）与温度和氧气的关系 测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。 3、生态学特征 生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。 4、血清学反应 很多细菌有十分相似的外表结构（如鞭毛）或有作用相同的酶（如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶）。虽然它们的蛋白质分子结构各异，但在普通技术下
2015版药典表面微生物检测操作规程
1.目的：建立表面微生物测试标准操作规程，保证测试人员操作规范化、标准化。 2.范围：适用于洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物量的测试。 3.责任：表面微生物检测员。 4.内容： 4.1基本概念： 4.1.1菌落:细菌培养后,由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落,简称CFU.通常用个数表示。 4.1.2表面微生物： 4.1.3表面微生物菌落数: 规定面积的洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面，用接触平皿法或擦拭法检测的微生物的菌落数目，以个/皿表示。 4.2测试原理: 本测试方法利用接触平皿法或擦拭法收集洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物，经若干时间，在适宜的方法和条件下让其繁殖到可见
的菌落数，以平板培养皿中的菌落数来评定洁净室（区）表面、设备以及与产品接触表面的微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。 4.3测试方法： 4.3.1使用的仪器设备和培养基: 高压消毒锅:使用时应严格按照操作规程进行。 恒温培养箱:必须定期对培养箱的温度计进行检定。 培养皿:一般采用φ90mm×15mm玻璃培养皿。使用前将培养皿置于160℃干热灭菌120min。 接触碟：一般采用φ55mm无菌接触碟。 培养基:胰酪大豆胨琼脂培养基。 将培养基加热熔化，冷却至约45℃在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入32℃恒温培养箱中培养72小时若培养基平皿上确无菌落生长即可供采样用，制备好的培养基平皿应在2-8℃的坏境中存放。 4.3.2采样点选择： 洁净区微生物测试点选择表面微生物监测的采样点数目及其布局根据以下几个方面设置： 空调系统验证的结果 房间的用途 与产品的距离 人流物流方向 如何布点：对于同一洁净区，每个相同的取样物体在其不同的地方采2个样。如墙面2个采样点，地面2个采样点，洁净区主要设备2个采样点。 注：表面微生物监测的取样点数应依下列因素确定： 1.洁净区（室）的大小；
微生物鉴定指导原则
9204 微生物鉴定指导原则 本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中检出微生物的鉴定提供指导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的重要环节，药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则1106）中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法”（通则1101）的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（通则9203）中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革兰染色或其它染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与方法和数据库的局限性息息相关，未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户
微生物的快速检测与鉴定
微生物的快速检测与鉴定 微生物论文 学院：食品科学与工程学院 班级：生工091 学生：彭彩连 学号：42号
【关键词】微生物快速检测 随着人们生活水平不断提高，各种安全问题越来越受到人们的重视，微生物的污染问题也相应地备受关注。在食品和环境等各个方面都有微生物污染的可能，一旦污染，微生物将大量繁殖而导致食源性疾病或环境污染甚至医院内感染。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，导致感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。传统的检验方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高，但涉及的实验较多、操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，而且要有大量人员参与［1，2］。所以，迫切需要准确、省时、省力和省成本的快速检验方法。本文对微生物快速检测方法的进展情况及实际应用进行综述，以利于预防食源性疾病及公共卫生突发事件的发生。 1 即用型纸片法 3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数［3］。由RCP Scientific Inc 公司开发上市的Regdigel系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的产品［4］，这两个系列的产品与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，已经被列为国标方法。使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果［5］。美国3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36℃培养，不需要低温设备；快速，仅需2 d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短3～5 d，大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无统计学意义，且菌落典型，易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶—底物反应法。只需检测时纸片可高压灭菌处理，4℃保存，简化了实验准备、操作和判断［6］。但由于它们价格昂贵，限制了在基层单位的实际应用。 2 生物化学技术 2.1 PCR技术PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间，但PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果，扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。由于以上原因，PCR技术对操作者的自身素质要求很高，对于基层单位而言难以做到。短时间内也不会有经济效益和社会效益，因此影响了这项技术在基层的应用。