第一章 1-4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.
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第六节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
一、基本知识
核酸不能自己进入细菌,而是需要帮助,并对细菌经过处理,才能穿过细胞的内、外膜进入,在里边表达和复制。
?感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Competent cells 。
?转化(Transformation :是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
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二、大肠杆菌感受态细胞的制备
常用CaCl 2成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA 产生5×106~2×l07个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒上进行的常规克隆的需要。适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。制备的感受态细胞可贮存于-70℃,数月至1年。但保存时间过长会使转化效率受到影响。新鲜细胞4 ℃保存可用5天。
用于电转化法的感受态细胞的制备使用低盐缓
冲液或水洗细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。(具体操作及参数,参考仪器说明
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?下列有3个因素对于获得持续高的转化频率来说
是至关重要的:
–转化缓冲液中试剂的纯度–细胞的生长状态
–玻璃和塑料器皿的清洁度
4例:
Cacl 2法制备感受态细胞(化学法步骤:
1从于37℃培养16~20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm ,转到一个含有100ml LB 或SOB 培养基的1L 烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约3小时。为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml ,可每隔20~30分钟测量OD 600值来监测培养物的生长情况。
2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。
3于4 ℃,离心10分钟,以回收细胞。
4倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养
液流尽。
55以10ml 用冰预冷的0.1mol /L Cacl 2重悬每份沉淀,放置于冰浴上。
6于4℃,离心10分钟.以回收细胞。
7倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的这量培
养液流尽。
8每50ml 初始培养物用2ml 用冰预冷的0.1mol /L CaCl 2重悬每份细胞沉淀。
9分装成200ul ,贮存于-70℃、4 ℃备用。?
转化
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三、转化方法:
?电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。
?化学方法(热激法:使用化学试剂(如CaCl 2制备的感受态细胞,通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞。
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?电转化法:
当大肠杆菌暴露在电场中时,细胞膜会不稳定而诱导形成暂时孔洞,于是DNA 分子进入细胞。电穿孔法最初用于将DNA 导入真核细胞,通过优化各个参数,每微克DNA 可以得到109~1010转化体。影响参数:
电场强度;电脉冲的长度;DNA 浓度;质粒的大小。一般电转化的效率是用化学方法制备的感受态细胞的转化率的10~20倍。而且,制备用于电穿孔的细胞要比制备感受态细胞更容易得多,低盐溶液或水洗,加10%的甘油,-70℃保存。8
?化学方法:
1用贮存于-70℃、4 ℃或新鲜的感受态细胞悬液中各
取200ul 转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA (体积<10ul ,DNA <50ng ,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30分钟。
2将管放到预加温到42℃的循环水浴中,恰恰放置90秒,不要摇动试管。
3快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2分钟。4每管加800ul SOC 培养基。用水浴将培养基加温至37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45分钟使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率,在复苏期中,应温和地摇动细胞。
95将适当体积(每个90mm 平板可达200ul 已转化的感受态细胞转移到含
20mmol /L MgS04和相应抗生素的SOB 琼脂培养基上。用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。
6将平板置于室温直至液体被吸收。
7倒置平皿,于37℃培养,12~16小时后可出现菌落。
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第七节含重组质粒的细菌菌落的鉴定
几种方法来鉴定含重组质粒的细菌菌落:1小规模提取质粒DNA 进行限制酶切分析;2α互补;3插入失活;4杂交筛选5菌落PCR 。
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一、小规模制备质粒DNA 进行限制酶切分析
要挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养,分离质粒DNA 后用限制酶进行消化,再通过凝胶电泳进行分析。该方案颇费气力,但这是首选的方法。在实际应用中,有可能在2~3小时内提取和分析36份小量制备的质粒DNA 。
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二、α互补
许多载体都带有Lac Z 基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补(α-互补。当这
种载体转入可编码β-半乳糖苷酶C 端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-β-D 硫代半乳糖苷(IPTG 的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。实现α-互补现象。
由互补产生的β-半乳糖苷酶(Lac Z 能够作用于生色底物(X -gal 而产生蓝色的菌落,当在载体的该基因编码序列之间的多克隆位点,插入一个外源DNA 片段时,会造成Lac Z (α基因的失活,破坏α-互补作用,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。
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α-互补现象的检查:
1在一事先制备好的含相应抗生素的LB 琼脂平板上加40ul X —gal 贮存液(以20mg /ml 的浓度溶于二甲基甲酰胺中和4ul (IPTG 溶液(浓度为
200mg /ml 。溶液涂布在事先制备的琼脂平板表面。
X -gal 贮存液的配法:将X -gal 溶于二甲基甲酰胺中,
配成20mg /ml 浓度的溶液,装于玻璃或聚丙烯管中,装溶液的管应以锡铂包裹以防可见光使X -gal 受到破坏,应贮存于-20℃保存。该溶液不必过滤除菌。
IPTG 溶液的配法:将2g IPTG 溶于8ml 水中,用水调节体
积到10mL 。用0.22um 一次性滤器过滤除菌,分装成1ml 小份,贮存于-20℃
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2将待检细菌接种到平板上,用接菌环或牙签划线接种,也可将100ul 细菌悬液涂布在琼脂培养基表面。倒置平板于37℃培养12~16小时。
3于4℃将平板放置数小时,使蓝色充分显现。带有β-半乳糖苷酶活性蛋白的菌落中间为谈蓝色,外周为深蓝色。白色菌落偶尔也在中央出现一个淡蓝色斑点,但其外周无色。
α互补
蓝白斑选择
15三、插入失活
这种方法只能用于比较老的载体(如
pBR322,这些载体带有两个或更多个抗生素抗性基因和分布适宜的限制酶切位点。待插入的DNA 及已纯化的质粒DNA 都用限制酶消化,这些酶的识别位点只位于一个抗生素抗性基因区内。在适宜浓度下将两个DNA 连接后,用连接产物转化大肠杆菌,选择对第二种抗生素有抗性的转化体。
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17在氨苄青霉素存在下生长的菌落,一些含有重组质粒,而另一些可能含有无外源DNA 而在连接过程中自身环化的质粒DNA 。为区别两种转化体,用两种分别含有氨苄青霉素和四环素的平板,在互相对应的位置上,各自接入同一菌落。在四环素平板中存活并生长的菌落没有外源DNA 插入。在四环素平皿中不生长而在氨苄青
霉素平板中生长的菌落含有带失活的ter r 基因的质粒,这些质粒可能带有外源DNA 序列。
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通过灭活质粒所携带的抗生素抗性基因来筛选外源DNA 的插入
19?Figure 4.18. Recombinant selection with
pBR322. See text for details. The inset shows how replica plating is performed.
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四、杂交筛选
一种在硝酸纤维素滤膜上原位裂解细菌菌落并使释放出的DNA 非共价结合于滤膜的方法,结合于滤膜上
的DNA 可与相应的放射性标记核酸探针进行杂交。
是鉴定含目的DNA 的重组质粒最常用的技术。很容易同时筛选数十万个细菌菌落,从中找出带有含靶序列的重组质粒的菌落,最后,小量制备质粒DNA 进行限制酶切分析和Southern 杂交以证实这些质粒的结构。
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固体支持体及其特点:
1尼龙膜:最耐用,可以承受几轮杂交及高温洗膜操作,可用于不同的探针依次筛选的情况。
2Whatman 541滤纸:有很高的湿强度,主要用于筛选一些基因文库。(保存在微量滴定板各个孔内的单菌落复印菌落转移到滤纸上。裂解、固定,用于杂交。
3硝酸纤维素滤膜:与Whatman 541滤纸相比杂交信号较强,更适合常规的细菌筛选。
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?现有许多方法可用于放射性探针在溶液中与固定在滤
膜上的核酸的杂交,这些方法在以下方面有所不同:
1所用的溶剂和温度(如于68℃在水溶液中或于42℃在50%甲酰胺
中。2溶剂的体积和杂交的时间(体积大时可长达3天,或体积最小时,
短至4小时。3振摇的程度和方法(持续摇动或固定。
4阻断探针对固相基质表面的非特异性吸附的试剂,如Denhardt
试剂或BLOTID 。5标记探针的浓度及其比活度。
6可增进核酸重缔合率的化合物,如葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇的
使用情况。7杂交后洗膜的严格程度。
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(一将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上
适用于对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(100~200进行筛选。将这些菌落归并到一个琼脂主平板,和第二个琼脂平板表面的一张滤膜上。培养一段时间后,对菌落进行原位裂解。主平板贮存于4 ℃直至得到筛选结果。
1在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张滤膜。2用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含
有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。按一定的格子进行划线接种(或打点,划出长2~3mm 的短线。每一菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒(如pBR322的菌落。(阴性对照以区分放射性标记探针与重组质粒的特异性退火和非特异性的杂交背景。24
3倒置平板,于37℃培养.直至划线的细菌生长达到0.5~
1.0mm 的宽度。
4用针头穿透滤膜直达其下的琼脂,在硝酸纤维素滤膜3个以上的不对称位置作标记。在主平板相同的位置上也作上标记。
5用Parafilm 膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。
6裂解细菌,使DNA 结合于硝酸纤维素滤膜。
25(二将菌落影印在硝酸纤维素滤膜上?方法一:
适用于必须通过杂交来筛选大量菌落时,
如用质粒载体构建的cDNA 文库转化细菌并铺平板。这时直接用转化混合物将细菌铺于一张无去污剂的硝酸纤维素滤膜上,然后通过滤膜与滤膜之间的接触制备影印滤膜。
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?方法二:
适用于同时从琼脂平板表面把许多细菌菌落转到硝酸纤维滤素膜上。可用于任意大小的菌落,但小菌落(0.1~0.2mm 效果最佳,与较大的菌落相比,小菌落的杂交信息更清晰,而弥散程度更低。可用此技术在每张138mm 滤膜上筛选多达2×l04个菌落或在每张82mm 滤膜土筛选104个菌落。
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操作:
1、方法1
1用一支软铅笔或圆珠笔给干的无去污剂的硝酸纤维素
滤膜编号,然后用水浸湿,将其夹在于的Whatman 3mm 滤纸中间,用锡箔包裹整叠夹好的滤膜,高压蒸气灭菌151bf /in2(1.034x105Pa。准备足够的滤膜以便用每个平板制备1张主滤膜和2张影印滤膜。2用无菌平头镊子把一张无菌滤膜放到前一天制备的含相应抗生素的LB(或SOB琼脂平板上,编号的一面朝下,当滤膜彻底湿润后,将滤膜从琼脂平板上剥离,编号的一面朝上放到琼脂表面上。
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3将悬于体积较小的液体中的细菌放到位于琼脂平板表面的滤膜中央。用一无菌的玻璃涂布器均匀地将菌液涂布在滤膜表面,滤膜的边缘留出2~3mm 宽的无菌边界。平板(不倒置半开盖几分钟使接种物蒸发,盖好,倒置平皿。于37℃培养至小菌落(直径0.1~0.2mm 出现(约8~10小时。
4将滤膜(菌落面朝上转到含相应抗生素和25%甘油的LB (或SOB 琼脂平板上,于37℃培养2小时。
5用Parafilm 膜封好平板,倒置装在一密闭的塑料袋内,于-20℃贮存。于室温将主平板(仍倒置融化,即可制备影印滤膜。
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6按下述方法制各影印滤膜:
a.事先准备一叠Whatman 3MM 滤纸(每张滤膜1张,略有富余,切成比滤膜稍大一些,高压下蒸气灭菌10分钟b .从贮存平板剥下主滤膜,菌露面朝上放在湿的无菌3mm 滤纸上。
c .将一张湿的无菌硝酸纤维素滤膜编号,放在主滤膜上,注意防止两张滤膜间留有气泡。避免滤膜间相互发生移位。但使它们不致恰好重叠,分离两张滤膜时会容易些。d.用丝绒影印铺板器或一个重玻璃平皿(在玻璃和滤膜之间有一张3mm 滤纸将两张滤膜紧紧地压在一起。
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e. 针头在两张滤膜上制作一系列定位标记孔。
f.分开两张滤膜,把影印滤膜放到一新鲜的含相应抗生素的LB (或SOB 琼脂平板上,于37℃培养至出现菌落(4~6小时。
g.将主滤膜重新放回一新鲜的合相应抗生素和25%甘油的LB (或SOB 琼脂平板上。于37℃培养1小时,然后按步骤5进行冻存处理。
7裂解细菌,释放的DNA 结合到影印滤膜上。
维素滤膜上的细菌菌落用影印铺板器复印生长在硝酸纤 2．方法2 ．方法2 1）直接将细菌悬液铺于含相应抗生素的LB（或SOB）琼）直接将细菌悬液铺于含相应抗生素的LB（ SOB）脂平板培养表面。将平板半开盖放在层流式通风橱到琼脂表面完全干燥，盖好平皿倒置放于37℃培养12～14小脂表面完全干燥，盖好平皿倒置放于37℃培养12～14小时。于4℃放置30～60分钟。时。于4 放置30～60分钟。 2）用铅笔或圆珠笔将硝酸纤维滤膜编号。编号的一面超下，将滤膜放到LB（或SOB）琼脂培养基表面，与菌落下，将滤膜放到LB （ SOB）接触直到膜完全湿润。用针头穿透滤膜和下面的琼脂作 3个或3个以上的不对称标记。个或3 3）用平头镊子剥离滤膜。 31 32 4）有几种方法选择： a.使粘在滤膜上的细菌立即裂解，释放的DNA结合于滤膜上。 a.使粘在滤膜上的细菌立即裂解，释放的DNA结合于滤膜上。 b.菌落向上使膜放在新配制的含相应抗生素的LB（或SOB）琼脂平 b.菌落向上使膜放在新配制的含相应抗生素的LB
（ SOB）板的表面。培养几小时后细菌长到2～3mm时可裂解菌落。板的表面。培养几小时后细菌长到2 mm时可裂解菌落。 c.可将滤膜转移至含氯霉素（170～
200ug／ml）的琼脂平板上，于 c.可将滤膜转移至含氯霉素（170～ 200ug／ml）37℃培养12小时（扩增）。在正常情况下，不用扩增，就可以杂 37℃培养12小时（扩增）。在正常情况下，不用扩增，就可以杂交检出克隆化的DNA序列。只有当载体可进行松弛型复制时，才交检出克隆化的DNA序列。只有当载体可进行松弛型复制时，才能进行扩增。 d．可用滤膜来制备第二张影印滤膜，使带菌落的面朝上，将滤膜放在新鲜的含相应抗生素的LB（或SOB）琼脂平板表面，然后小放在新鲜的含相应抗生素的LB（ SOB）心地将第2张干的硝酸纤维素滤膜放到第1张滤膜上，并与之对准。心地将第2 张干的硝酸纤维素滤膜放到第1 将滤膜夹层一起放于37℃培养数小时。将滤膜夹层一起放于37℃培养数小时。（三）菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜（三）菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜介绍两种方法，都应尽力避免将任何溶液留在滤膜的上表面，尽力避免在滤膜下面留有气泡。 1.方法1： 1.方法1 1）切4张大小及形状适宜的Whatman 3mm 滤纸，端正地放）切4 张大小及形状适宜的Whatman 3mm滤纸，端正地放于4
个玻璃盘或塑料盘的底部，每张3mm滤纸用下面溶液个玻璃盘或塑料盘的底部，每张3 mm滤纸用下面溶液中的一种饱和： a.10％SDS（可用可不用）。 a.10％SDS（ b.变性液（0.5mol／L Na0H、1.5mol／L NaCl）。 b.变性液（0.5mol／
Na0H、 1.5mol／ NaCl）。 c.中和液[1.5mol／L Nacl 0.5mol／L Tris·Cl c.中和液[1.5mol／ 0.5mol／ Tris·（pH7.4）] pH7.4） d．2×SSC。 SSC。倒掉任何多余的
液体 34 5）于37℃培养主平板5～7小时直到菌落再生，用）于37℃培养主平板5 Parafilm膜封好，倒置贮放于4℃。 Parafilm膜封好，倒置贮放于4 33 2）用平头
镊子把硝酸纤维素滤膜从平板上剥离下来，菌落面朝上放于浸过SDS的滤纸上，可以限制质粒DNA在变落面朝上放于浸过SDS的滤纸上，可以限制质粒DNA在变性和中和期间发生扩散。 3）第1张滤膜在SDS溶液中暴露3分钟后将其转到第2张用）第1 张滤膜在SDS溶液中暴露3 分钟后将其转到第2 变性液饱和的滤纸上。按顺序进行转膜，使之暴露于变性液5分钟。性液5 4）将滤膜转到第3张用中和液饱和的滤纸上，放置5分钟。）将滤膜转到第3 张用中和液饱和的滤纸上，放置5 5）将滤膜转到一张用2×SSC饱和的滤纸上，作用5分钟。）将滤膜转到一张用2 SSC饱和的滤纸上，作用5 6）使菌落面朝上，将滤膜放到一张干的滤
纸上，于室温干燥至少30分钟。干燥至少30分钟。 7）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，于80℃干烤1～2小时，）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，于80℃干烤1 以固定DNA 。以固定DNA 8）将固定好的膜与32P标记的探针杂交 35 2．方法2：．方法2 1）每一张滤膜，在一包装膜上制作一个装有0.5mol／L ）每一张滤膜，在一包装膜上制作一个装有0.5mol／ NaOH的小洼（0.75ml），使菌落面朝上，将滤膜放到 NaOH的小洼（0.75ml），使菌落面朝上，将滤膜放到小洼上，展平Saran包装膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜小洼上，展平Saran包装膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜留于原处2～3分钟。留于原处2 2）用干的纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的Saran ）用干的纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的Saran 包装和新配制的0.5mol／L NaOH重复步骤1）。包装和新配制的0.5mol／NaOH重复步骤1 3）再次吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1mol／L ）再次吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有1 mol／ Tris·Cl （pH7.4）的Saran包装膜小洼上。5分钟后， Tris· pH7.4） Saran包装膜小洼上。5 吸干滤膜，用一张新的Saran包装膜和新的1mol／L 吸干滤膜，用一张新的Saran包装膜和新的1 mol／ Tris·Cl （pH7.4）重复该步骤。 Tris· pH7.4） 36 6
（四）杂交 4）吸干滤膜，把它转到新的带有1.5mol／L NaCL 0.5mol ）吸干滤膜，把它转到新的带有1.5mol／／L Tris·C1（pH7.4）的包装膜小洼上，5分钟后，吸 Tris· C1（ pH7.4）的包装膜小洼上，5 干滤膜，把它转移到一张干的滤纸上，于室温晾至少20～干滤膜，把它转移到一张干的滤纸上，于室温晾至少20～30分钟，使滤膜干燥。 30分钟，使滤膜干燥。 5）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，于80干烤2小时，以固）将滤膜夹在两张干的滤纸之间，于80干烤2 定DNA。 DNA。 6）将固定在膜上的DNA与32P标记的探针杂交。将固定在膜上的DNA与该方案可用于30张直径为82mm的圆形硝酸纤维素滤膜。可该方案可用于30张直径为82mm的圆形硝酸纤维素滤膜。可根据杂交反应中所用滤膜的数量和大小适当调整体积。 37 1）盘内盛有2×SSC，将烤干的滤膜飘浮在液面上，直到）盘内盛有2 SSC，滤膜从下到上彻底浸湿。浸泡5分钟。滤膜从下到上彻底浸湿。浸泡5 2）将滤膜转到一个盛有200ml预洗液的玻璃皿中，将滤膜）将滤膜转到一个盛有200ml预洗液的玻璃皿中，将滤膜一张张叠在一起，放于溶液
中。用Saran包装膜盖住结一张张叠在一起，放于溶液中。用Saran包装膜盖住结晶皿，放到位于培养箱内的旋转平台上。在这一步及以后的所有步骤中，应缓缓摇动滤膜，防止它们粘在一起，于50℃温育30分钟。 50℃温育30分钟。预洗液： 5×SSC 0.5％SDS 0.5％ 38 1mmol／L EDTA（pH8.0） 1mmol／ EDTA
（ pH8.0） 3）用泡过预洗液的纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片，这样可以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度或清晰度。 4）将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃皿中，在适宜温）将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃皿中，在适宜温度（即在水溶液中杂交时用68℃而在50％甲酰胺中杂交度（即在水溶液中杂交时用68℃而在50％甲酰胺中杂交时用42℃）下，温育1～2小时。时用42℃）下，温育1 5）将32P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟，使其变标记的双链DNA探针于100℃加热5 性。迅速将探针放冰浴中冷却。单链探针不必变性。将探针加入覆盖滤膜的预杂交液中，在适当温度下，温育直至达到1～
3×Cot1/2 杂交期间,盛滤膜的容器应温育直至达到1 杂交期间, 盖严以防液体蒸发。 6）杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300～
500ml）的2×SSC和0.1％SDS溶液中，轻体积（300～500ml） SSC和 0.1％ SDS 溶液中，轻轻振摇。在洗膜过程中，至少将滤膜翻转1次。5分钟轻振摇。在洗膜过程中，至少将滤膜翻转1 次。5 后，将滤膜转到新的洗液中，继续轻轻振摇，反复洗两遍，在洗膜过程中应避免使膜干涸。 7）于68 ℃用300～500ml 1×SSC 和0.1％SDS溶液洗膜两）于68 ℃用300～500ml 1× SSC和 0.1％ SDS溶液洗膜两次，约1～1.5小时。将滤膜放到x光片上去。如背景次，约1 1.5小时。将滤膜放到x 仍很高，可用300～500ml 0.2×SSC和0.1％SDS的溶仍很高，可用300～
500ml 0.2× SSC和 0.1％ SDS的溶 40 液于68 ℃将滤膜浸泡60分钟。液于68 ℃将滤膜浸泡60分钟。预杂交液： 50％甲酰胺 50％甲酰胺 6×SSC(或6×SSPE SSC(或0.05×BLOTTO 0.05× BLOTTO （Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer，Optimizer，牛乳转移技术优化剂） 39 8）把滤膜放在纸巾上于室温晾干，把滤膜（编号面朝上）放在一张Saran包装膜上，使用以放射性墨水制作的放在一张Saran包装膜上，使用以放射性墨水制作的粘性圆点标签在Saran包装膜上作几个不对称的标记，粘性圆点标签在Saran包装膜上作几个不对称的标记， 9）用第2
张Saran包装膜包住滤膜。加x光片，并加上增）用第2 Saran包装膜包住滤膜。加x 感屏于-70℃曝光12～16小时。感屏于- 70℃曝光12～16小时。 10）底片显影后，利用放射性墨水所留下的标记对准滤 10）底片显影后，利用放射性墨水所留下的标记对准滤膜与底片的位置。在底片上按编号的滤膜上不对称分布的点的位置作出标记。并标记阳性杂交信号的位置，同时也在不对称分布点的位置上以不同颜色作出标记。通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。 11）用牙签挑取每个阳性菌落，放到1～2ml含相应抗生素 11）用牙签挑取每个阳性菌落，放到1 ml含相应抗生素的LB培养液中。在不能甄别单独的一个杂交菌落时， LB 培养液中。在不能甄别单独的一个杂交菌落时，应合并数个邻近菌落，培养物生长几个小时后，稀释并重新铺于平扳上，使每个平板大约可获得500个菌并重新铺于平扳上，使每个平板大约可获得500个菌 41 落。然后通过杂交进行第二次筛选，进一步分析。 42 7
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 原理： 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。 准备： 1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油(可用0.1mol/L CaCl2和30％甘油等体积混合) 混合溶液，高温高压灭菌； 注：CaCl2必须为分析纯以上。 2、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净， 高温高压灭菌； 注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。 3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液 体培养基 （ ）中，37℃振荡培养过 夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。 实验步骤： 1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。 注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。 2、用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟。 注：（1）洗去细菌碎片和残留的培养液；（2）洗涤时间宜短不宜长。 3、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分 钟，4℃5000g离心5分钟。 注：此时可见细菌沉淀为白色，体积也胀大为最初沉淀体积的数倍。 4、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感 受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。
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大肠杆菌感受态细胞的制备 标签： tr..,Ca..,co.. 分类：细胞技术> 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2 法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经 CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体 中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转 以移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，摄取外源 DNA 。 转化（ Transformation）是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 （R-,M- ），它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些 特殊方法（如电击法， CaCl2 ，RbCl(KCl) 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生 了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞（ Compenent cells ）。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant ，即带有异 源 DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和 RbCl(KCl) 法，RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可 以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70 ℃保存（半年），因此CaCl2 法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB 液体培养基
大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明
大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并
感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)
感受态细胞的制备（DH5α） 一、准备工作 所有试剂、容器均需提前预冷。 1、实验器械 4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。 2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧） ① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。 ② SOB培养基（Super Optimal Broth） ③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。（装在50ml离心管，封口4度保存） ④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。
配制量 1 L 配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。 6.滴加NaOH小块，调节pH值至 7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至l L。 8.高温高压灭菌后，4℃保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。 LB培养基 配制量 1 L 配制方法 3.滴加固体NaOH，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4度保存。
实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备(新)
实验三大肠杆菌感受态细胞的制备 【课前预习】 1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？ 2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？ 【目的要求】 1、了解感受态细胞生理特性及制备条件； 2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法； 【基本原理】 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。 基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖，重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小，转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。CaCl2转化法的优点是：简单快速，重复性好，菌株适用范围广。 另外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部，转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效
感受态细胞制备
感受态细胞制备 实验目的 1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术； 2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法； 3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。 实验原理 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的 状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态, 如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0 C, CaCI2的低渗溶 液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 C短时 间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是CaCI2 能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化
学法高出1 到2 个数量级，达到1x108转化子每1 卩gDNA甚至1x109转化子每1卩gDNA所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围 广，感受态细菌可以在-70 C保存，因此被广泛用于外源基因的转化。 物理制备法： 电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109?1010转化子/卩g 闭环DNA因操作简便，愈来愈为人们所接受。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化率（转化子数/每卩g质粒DNA =转化子总数/ 质粒DNA加入量（卩g） 理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数 为1*10 10 实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB 液体培养基、 实验试剂：溶液、含10%甘油的溶液、GYT三蒸水、10% 甘油的水
高效感受态细胞的制备
感受态细胞的制备 一、实验原理 受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。 本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。 二、材料及准备工作 一）材料准备
二)试剂配制 1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用） 蛋白胨 2.0g 酵母提取物 1.0g 氯化钠（NaCl） 2.0g 2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌） 蛋白胨2×1.0g 酵母提取物2×0.5g 氯化钠（NaCl）2×1.0g 琼脂粉2×1.5g 温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。 3、TSS液（100ml）（有效期2周） 聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10% DMSO 5ml 终浓度5%
MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/L LB 85ml 终浓度85% 去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用 注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000 4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用） KCl（2mol/L） 2.5ml CaCl2(1mol/L) 1.5ml MgCl2(1mol/L) 2.5ml 水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒） 5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml） 取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃ 保存备用 三）仪器设备 1、低温大容量离心机 2、恒温水浴锅 3、超净台 4、高压锅 5、37℃孵育箱 6、恒温摇床 7、制冰机 8、分光光度计
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项 1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6个月 。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法 ，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5× 106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高 100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便愈来愈为人们所接受。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理） 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100--1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
感受态细胞的制备步骤和原理
感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。 [让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来） [使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2中，轻吹，4℃30min，4000rpm离心5min弃上清。 [ 细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）] 5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细 胞壁打开，十分脆弱）] GAGGAGAGGAFFFFAFAF
感受态细胞的制备步骤和原理
感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细 胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能 获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细 胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。实验原理及过程实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37C, 180rpm培养过夜。［让菌复苏， 进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。］ 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37C 250rpm大约2.5小时。 ［减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。］ 3取培养物置于40m L的灭菌离心管中，冰浴10min , 4000rpm 4C离心10min，弃上清。（将所 有上清倒光，可以将离心管倒过来） ［使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。］ 4菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2中，轻吹，4 C 30min , 4000rpm离心5min弃上 ［细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基 -钙磷 酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA ）,经短时 间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）］ 5 菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 ［除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。 （一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）］ 6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL, 加入2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 ［第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶 液和pET-21a质粒未被污染。］［冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。］ 7热激42度，90s 【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB, 37 C复苏1h 【用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使 转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin（短节西林）的LB培养基上铺平板，将平皿放置 37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜，出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌 落。用短节西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活，所以应等到LB600C时（热而不烫），加入抗生素。】
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化解析
一、目的 1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。 二、原理 （一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子 的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。 目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说： 1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： （1）发芽的芽孢杆菌容易转化； （2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化； （3）适量的溶菌酶能提高转化率。 2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；
（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。 目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12X1776菌株的转化结果，认为： 近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。 （二）重组DNA 的转化原理 我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600 或DH5α，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA 分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷（rk- mk- rec-）同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感（Ap）。 在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素（Ap）基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Ap 抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ，我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化 采用改进的Spizizen法进行，详述如下： A，试剂 SPI-A Salts Solution： % 硫酸铵（NH4）2SO4 132 % K2HPO4·3H2O 228 % KH2PO4 136 % Trisodium Citrate Dihydrate（柠檬酸三钠-2-水）即二水合柠檬酸三钠 210 121° 20min灭菌（每次用完要灭菌） SPI-B Salts Solution：%MgSO4*7H2O 120 121° 20min灭菌（每次用完要灭菌） 100×CAYE solution : 2% Casamino acid（酪蛋白水解物） 10% Yeast Extract 121° 20min灭菌（灭菌一次，每次在超净台取样） 100×EGTA solution：10mMol/L EGTA (NaOH调pH 至
B 感受态细胞的制备和转化 1.前一天晚上挑取宿主菌（单菌落）接种于一支5mlLB液体摇瓶，37°摇床过夜 2. 第二天早上取100ul过夜培养的菌液，接种于50ml离心管配好的5ml SPI Medium中，37°摇床培养，3h后开始测OD600（一般不用测），当培养物声场到对数末期时，快速取200ul接种到2ml SPII Medium中， 37°100rpm 3. 加20ul100×EGTA溶液，37°100rpm 10min，用离心管分装成500ul每管 4. 向管中加入适当的质粒，5-10ul，轻轻混匀与37°100rpm 30min 5. 将离心管转移到250rpm，37°， 6. 以4000rpm离心收集菌体。弃部分上清，留100ul重悬菌体，涂布于响应的抗性平板。37°过夜。 离心管选用10ml或者50ml带螺帽的底部尖的离心管。 感受态细胞不能保存，因此，需要现做现用 大肠的抗性（Amp），枯草的（Kan） 枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布 人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889 一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm）储液：125mg/ml 0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。 一．农杆菌感受态细胞的制备 二．双元载体转化农杆菌EHA105 三．杆菌转化子的鉴定 A．农杆菌转化子的PCR鉴定 B．农杆菌转化子的酶切鉴定 关键词：农杆菌感受态细胞转化子 一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。挑单 菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH 2 PO 4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO 4,0.3 g/L Yeast extract,PH 7 .0）液体培养基中，220rpm， 28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中， 28℃,220rpm,振荡培养至OD 600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min, 去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl 2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min， 4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。 二．双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800μl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
感受态细胞的制备方法 1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理 2、感受态细胞不好用的原因 3、影响转化效率的原因 4、为何要低温环境制备 1.感受态 定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。 作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。 优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。 常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157. 2.感受态细胞做得不好的原因 一．菌液OD值偏大或偏小 二．原始菌株不好 三．试剂超纯程度不够 四．操作时对菌体伤害过大 3.影响转化效率的原因 1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株OD600为时细胞密度是5×107/ml）； 2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3．经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； 4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7．一定范围内,转化效率与外源DNA的浓度呈正比； 4．为何要低温环境制备 在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡. 如果放于-20℃保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。所以要放于-80摄氏度。
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 【实验目的】 法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 掌握用 CaCl 2 【实验原理】 常态细胞不能摄入外部溶液中的DNA分子，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌，首先必须制备感受态大肠杆菌细胞。 受体细胞经一定方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能够允许外源DNA载体分子通过的感受态细胞。 【材料和试剂】 溶液、75%的甘油（以上试DH 5α菌株、液体LB培养基、0.1mol/L的CaCl 2 剂均需高压灭菌） 【仪器设备】 振荡培养箱、低温离心机、分光光度计、冰盒、不同型号的枪头及微量移液器等 【实验步骤】 1、将 1ml新鲜的16h过夜培养物，转到 100ml LB培养基中。于 37℃振荡摇 =0.314。 匀 3h（旋转摇床200～300r/min），测量 OD 600nm 2、在无菌条件下，将1.5ml细菌培养液转移到冰预冷的Eppendorf管中，在冰上放置10min。 3、于 4℃用 4000r/min 离心10min。 4、弃去上清液，将 Eppendorf管倒置 1min，使残留培养液流尽。 溶液重悬细胞，合并两管，冰浴10min。 5、各加 150μL冰预冷的 0.1mM CaCl 2 6、于4℃用 4000r/min离心 10min。 7、弃上清，将 Eppendorf管倒置 1min，使残留的痕量培养液流尽。 溶液重悬细胞，再加入 25μL预冷的8、先加入 800μL冰预冷的0.1M CaCl 2 75% 的甘油，之后于 -80℃贮存备用。 【注意事项】 1、制备过程均需在低温（4℃）下进行，应尽量避免处理的细胞升温或于室温
实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化
实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化 【实验目的】 1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 【实验原理】 质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。 微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1．LB液体培养基: 参见附录 每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）: 配1L LB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。 每组制备LB平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。 3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。 4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。 5．1 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。 7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。 〈二〉器材 1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等 2. 高速冷冻离心机 3. 微量移液器等
大肠杆菌感受态的制备
大肠杆菌感受态的制备 原理: 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。 材料： Top10、pcDNA3.0, TB buffer（现用现配）、超纯水、碎冰。 LB液体培养基200 ml（不含AMP）、LB固体培养基（含AMP）、LB 固体培养基（不含AMP） 10ml圆底离心管（玻璃或塑料）、100ml锥形瓶、2.0 ml离心管、各型号枪头, 刻度移液管均需灭菌处理 甘油：100ml (高压灭菌) 氨苄（母液100mg/ml，终浓度为100ug/ml）：1ml母液需氨苄100mg 过滤除菌。 仪器：滤器、0.22um微孔滤膜、刻度吸量管、恒温摇床、恒温培养箱, 分光光度计、比色杯、低温离心机、制冰机、超净工作台, 移液器。 步骤：1）从冻存的E.coli.Top 10, 划线接种至LB固体培养基（不含AMP）. 37℃培养O/N, 16h左右。 2) 从新活化的E.coli.Top 10菌平板上挑取一单菌落，接种与 2ml LB液体培养基（10ml圆底离心管）中，37℃振荡培养 O/N, 16h左右。备注: E.coli. Top 10, 20%无菌甘油, －70℃保 存。
3)将该菌悬液以(400UL)1:100～1:50转接于20 ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液明显混浊后，2.5~3小时后测一次OD(600nm)，至OD600nm≤0.6时停止培养. 摇菌期间, 配TB buffer，开制冰机。TB buffer置于冰上预冷 (20~30分钟). 低温离心机预冷(20~30分钟) 以下步骤需在超净工作台和冰上操作； 4）细菌置于冰上,10min。 5）取12管, 1.5 ml细菌培养液3000 g 4℃离心5min,弃上清。 6) 每管加200 ul 预冷的LB，轻轻混匀, 均成2管, 置冰上20~30分钟，3000 g 4℃离心5min,弃上清。 备注:5)和6)是为浓缩细菌. 细菌置于冰上,10min。 7）每管加1 ml 预冷的TB buffer，轻轻混匀，置冰上20~30分钟。 8) 3000 g 4℃离心5min,弃上清。 重复7)和8) 9）加入50 ul预冷的TB buffer，不要重悬或轻轻重悬，置4℃ 过夜备用。提高转化效率吗？ 10) (可选)添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后, 超低温冷冻贮存备用（-70℃） 转化 1.50ul感受态+1ul质粒 2.冰浴30min。此时打开水浴锅预热。