生物化学总结

生物化学（biochemistry）是研究生命化学的科学，它在分子水平上探讨生命的本质，即研究生物体的分子结构与功能，物质代谢与调节，遗传信息的传递与调控，及其在生命活动中的作用。

人们通常将研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的结构、功能及基因结构、表达与调控的内容，称为分子生物学。所以分子生物学是生物化学的重要组成部分。

一、生物化学发展简史

1．初期阶段(18世纪—20世记初)

生物化学的研究始于18世纪，但作为一门独立的科学是在20世纪初期。主要研究生物体的化学组成。

2．蓬勃发展阶段（从20世记初—20世记中期）

主要在营养学，内分泌学，酶学，物质代谢及其调控等方面取得了重大进展。

3．分子生物学发展阶段（从20世纪中期至今）

主要有物质代谢途径的研究继续发展，重点进入代谢调节与合成代谢的研究。

另外，显着特征是分子生物学的崛起。DAN双螺旋结构模型的提出，遗传密码的破译，重组DNA技术的建立等。

20世纪末始动的人类基因组计划（humangenomeproject）是人类生命科学中的又一伟大创举。

以基因编码蛋白质的结构与功能为重点之一的功能基因组研究已迅速崛起。当前出现的的蛋白质组学（proteomics）领域。

阐明人类基因组功能是一项多学科的任务，因而产生了一门前景广阔的新兴学科-----生物信息学（bioinformatics）。

我国科学家对生物化学的发展做出了重大的贡献。

二、生物化学研究的主要内容

1．生物分子的结构与功能

2．物质代谢及其调节

3．基因信息传递及其调控

三、生物化学与医学

生物化学是一门重要的医学基础课，与医学有着紧密的联系。

生物大分子通常都有一定的分子结构规律，即由一定的基本结构单位，按一定的排列顺序和连接方式而形成的多聚体。蛋白质和核酸是体内主要的生物大分子，各自有其结构特征，并分别行使不同的生理功能。

酶是一类重要的蛋白质分子，是生物体内的催化剂。

本篇将介绍蛋白质的结构、功能；核酸的结核与功能；酶等三章。重点掌握上述生物大分子物质的结构特性，重要功能及基本的理化性质与应用，这对理解生命的本质具有重要意义。

蛋白质是生物体含量最丰富的生物大分子物质，约占人体固体成分的45%，且分布广泛，所有细胞、组织都含有蛋白质。生物体结构越复杂，蛋白质的种类和功能也越繁多。蛋白质也是机体的功

能分子（workingmolecules）。它参与机体的一切生理活动，机体的各种生理功能几乎都是通过蛋白质来完成的，而且在其中起着关键作用，所以蛋白质是生命的物质基础。

第一节蛋白质的分子组成

ConformationofProteinMolecules

一、蛋白质的元素组成

组成蛋白质的元素除含有碳、氢、氧外都含有氮。有些蛋白质还含有少量硫、磷、铁、锰、锌、铜、碘等。

大多数蛋白质含氮量比较接近，平均为16%，这是蛋白质元素组成的一个特点。

蛋白质的元素组成中含有氮，是碳水化物、脂肪在营养上不能替代蛋白质的原因。

二、氨基酸

氨基酸（aminoacid）是组成蛋白质的基本单位。组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种。其化学结构式有一个共同特点，即在连接羧基的α碳原子上还有一个氨基，故称α氨基酸(除甘氨酸外)。（一）氨基酸的结构

组成人体蛋白质的20种氨基酸，

各种氨基酸在结构上有下列特点。

1．组成蛋白质的氨基酸，除甘氨酸外，均属L-α-氨基酸。

2．不同的L-α-氨基酸，其侧链（R）不同。

（二）氨基酸的分类

根据氨基酸侧链R基团的结构和性质，可将20种氨基酸分成四类。

1.非极性疏水性氨基酸

2．极性中性氨基

3．酸性氨基酸

4．碱性氨基酸

在蛋白质的修饰过程中，蛋白质分子中20种氨基酸残基的某些基团还可被甲基化、甲酰化、乙酰化、异戊二烯化和磷酸化等。

（三）氨基酸的理化性质

1.两性解离及等电点：所有氨基酸都含有碱性的α-氨基和酸性的α-羧基，因此氨基酸是一种两性电解质，具有两性解离的特性。

2.紫外吸收性质根据氨基酸的吸收光谱，含有共轭双键的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm 波长附近。

3.茚三酮反应：可作为氨基酸定量分析方法。

三、肽（peptides）

㈠肽(peptide)

在蛋白质分子中由一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸的α-氨基脱水生成的键称为肽键（p eptidebond）。肽键是蛋白质分子中基本的化学键。如由二个氨基酸以肽键相连形成的肽称为二肽，相互之间以肽键相连。二肽还可通过肽键与另一分子氨基酸相连生成三肽。此反应可继续进

行，依次生成四肽、五肽……。由10个以内的氨基酸由肽键相连生成的肽称为寡肽（oligopeptid e），由更多的氨基酸借肽键相连生成的肽称为多肽（polypeptide）。多肽是链状化合物，故称多肽链（polypeptidechain）。多肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不全，故称为氨基酸残基（r esidue）。多肽链中形成肽键的4个原子和两侧的α-碳原子成为多肽链的骨架或主链。构成多肽链骨架或主链的原子称为主链原子或骨架原子，而余下的R基团部分，称为侧链。多肽链的左端有自由氨基称为氨基末端（aminoterminal）或N-端，右端有自由羧基称为羧基末端（carboxyltermina l）或C-端。把含有51个氨基酸残基、分子量为5733的胰岛素称作蛋白质。这似乎是习惯上的多肽与蛋白质的分界线。

㈡生物活性肽

⒈谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH是由谷、半胱和甘氨酸组成的三肽。第一个肽键与一般不同，由谷氨酸γ-羧基与半胱氨酸的氨基组成，分子中半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基团。

⒉多肽类激素及神经肽

第二节蛋白质的分子结构

MolecularStructureofProtein

人体的蛋白质分子是由20种氨基酸借肽键相连形成的生物大分子。每种蛋白质都有其一定的氨基酸组成及氨基酸排列顺序，以及肽链特定的空间排布。从而体现了蛋白质的特性，是每种蛋白质具有独特生理功能的结构基础。蛋白质分子结构分成一级结构、二级结构、三级结构、四级结构4个层次，后三者统称为空间结构、高级结构或空间构象（conformation）。蛋白质的空间结构涵盖了蛋白质分子中的每一原子在三维空间的相对位置，它们是蛋白质特有性质和功能的结构基础。由一条肽链形成的蛋白质只有一级结构、二级结构和三级结构，由二条或二条以上肽链形成的蛋白质才可能有四级结构。

一、蛋白质的一级结构

蛋白质中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构（primarystructure）。肽键是一级结构的主要化学键。有些蛋白质还包含二硫键，即由两个半胱氨酸巯基脱氢氧化而成。

目前已知一级结构的蛋白质数量已相当可观，并且还以更快的速度增长。国际互联网有若干重要的蛋白质数据库（updatedproteindatabases），收集了大量最新的蛋白质一级结构及其他资料,为蛋白质结构与功能的深入研究提供了便利。

二、蛋白质的二级结构

蛋白质的二级结构（secandarystructure）是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置。不涉及氨基酸残基侧链的构象。蛋白质的二级结构主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。

（一）肽单元

构成肽键的4个原子和与其相邻的两个α碳原子（Cα）构成一个肽单元（peptideunit）。由于参与肽单元的6个原子——Cα1、C、O、N、H、Cα2位于同一平面，故又称为肽平面。

（二）α-螺旋

α-螺旋（α-helix）：蛋白质分子中多个肽单元通过氨基酸α-碳原子的旋转，使多肽链的主链围绕中心轴呈有规律的螺旋上升，盘旋成稳定的α-螺旋构象。α螺旋靠氢键维持。若氢键破坏，则α-螺旋构象即遭破坏。

（三）β-折叠（β-pleatedsheet）

每个肽单元以Cα为旋转点，依次折叠成锯齿状结构，氨基酸残基侧链交替地位于锯齿状结构的上下方，氢键是维持β-折叠结构的主要次级键。

（四）β-转角（β-turn）和无规卷曲（randomcoil）

β-转角伸展的肽链形成180°回折，即U形转角结构。无规卷曲系指没有确定规律性的那部分肽链构象。

（五）模体(motif)

在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体。一个模序总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。如在许多钙结合蛋白分子中通常有一个结合钙离子的模序。它由α-螺旋-环-α-螺旋三个肽段组成。锌指结构(zincfinger)也是一个常见的模体例子。此模体由1个α-螺旋和2个反平行的β-折叠三个肽段组成。由于Zn2+可稳固模体中α-螺旋结构，致使此α-螺旋能镶嵌于DNA的大沟中，因此含锌指结构的蛋白质都能与DNA或RNA结合。可见模体的特征性空间构象是其特殊功能的结构基础。

（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响

蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成α-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。

三、蛋白质的三级结构

(一)蛋白质的三级结构（tertiarystructure）是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。

例:Mb（肌红蛋白）是由153个氨基酸残基构成的单条肽链的蛋白质，含有1个血红素辅基。可进行可逆的氧合和脱氧。

蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠次级键——疏水键、离子键（盐键）、氢键和VanderWaals力等。疏水性氨基酸的侧链R基为疏水基团，有避开水，相互聚集而藏于蛋白质分子内部的自然趋势，这种结合力叫疏水键。

（二）结构域

分子量大的蛋白质三级结构常可分割成1个和数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域(domain)。如纤连蛋白(fibronectin)，它由二条多肽链通过近C-端的两个二硫键相连而成，含有6个结构域，各个结构域分别执行一种功能，有可与细胞、胶原、DNA和肝素等配体结合的结构域。

（三）分子伴侣

除一级结构为决定因素外，蛋白质空间构象的正确形成还需要一类称为分子伴侣(chaperon)的蛋白质参与。分子伴侣通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。分子伴侣广泛地存在于从细菌到人的生物体中，其中有很大一部分被称之为热休克蛋白（heatshockpro tein）。

四、蛋白质的四级结构

在体内有许多蛋白质分子含有二条或多条多肽链，才能全面地执行功能。每一条多肽链都有其完整的三级结构，称为蛋白质的亚基（subunit），这种蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构（quaternarystructure）。

在四级结构中，各个亚基间的结合力主要是氢键和离子键维持四级结构。含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四级结构寡聚体才有生物学功能。亚基分子结构相同,称之为同二聚体(homodimer),若亚基分子结构不同,则称之为异二聚体(heterodimer)。血红蛋白(hemoglobin,Hb)是由2个α亚基和2个β亚基组成的四聚体，两种亚基的三级结构颇为相似，且每个亚基都结合有1个血红素（heme）辅基。

五、蛋白质的分类

（一）根据蛋白质组成成分可分成单纯蛋白质和结合蛋白质，单纯蛋白质只含氨基酸；结合蛋白质，除蛋白质部分外，还含有非蛋白质部分，为蛋白质的生物活性或代谢所依赖。结合蛋白质中的非蛋白质部分被称为辅基，绝大部分辅基通过共价键方式与蛋白质部分相连。辅基的种类也很广，常见的有色素化合物、寡糖、脂类、磷酸、金属离子甚至分子量较大的核酸。

（二）蛋白质还可根据其形状分为纤维状蛋白质和球状蛋白质两大类。

第三节蛋白质的结构与功能的关系

RelationshipofProteinStructureandFunction

一、蛋白质的一级结构与功能的关系

（一）蛋白质的一级结构是空间构象的基础

Anfinsen在研究核糖核酸酶时已发现，蛋白质的功能与其三级结构密切相关，而特定三级结构是以氨基酸顺序为基础的。核糖核酸酶是由124个氨基酸残基组成的一条多肽链，分子中8个半胱氨酸的巯基构成四对二硫键(Cys26和Cys84,Cys40和Cys95,Cys58和Cys110,Cys65和Cys72)(图1-1 7A)。进而形成具有一定空间构象的球状蛋白质。用变性剂和还原剂β-巯基乙醇处理该酶溶液，分别破坏二硫键和次级键，使其空间结构被破坏。但肽键不受影响，一级结构仍保持完整，酶变性失去活性。如用透析方法除去尿素和β-巯基乙醇后，核糖核酸酶又从无序的多肽链卷曲折叠成天然酶的空间结构，酶从变性状态复性，酶的活性又恢复至原来水平。这充分证明，只要其一级结构未被破坏，就可能恢复原来的三级结构，功能依然存在，所以多肽链中氨基酸的排列顺序是蛋白质空间结构的基础。

（二）一级结构与功能的关系

已有大量的实验结果证明，一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。

例如不同哺乳类动物的胰岛素分子结构都由A和B两条链组成，且二硫键的配对和空间构象也极相似，它们都执行着相同的调节糖代谢等的生理功能。

又例如垂体前叶分泌的促肾上腺皮质激素(ACTH)和促黑激素(α-MSH,β-MSH)共有一段相同的氨基酸序列，因此，ACTH也可促进皮下黑色素生成，但作用较弱。

又例存在于生物界的蛋白质如细胞色素C(cytochromeC)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。

但有时蛋白质分子中起“关键”作用的氨基酸残基缺失或被替代，都会严重影响空间构象乃至生理功能，甚至导致疾病产生。例如正常人血红蛋白β亚基的第6位氨基酸是谷氨酸，而镰刀形贫血患者的血红蛋白中，谷氨酸变成了缬氨酸，即酸性氨基酸被中性氨基酸替代，仅此一个氨基酸之差，本是水溶性的血红蛋白，就聚集成丝，相互粘着，导致红细胞变形成为镰刀状而极易破碎，产生镰刀形红细胞性贫血（sicklecellanemia）。这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，被称之为“分子病”，其病因为基因突变所致。

二、蛋白质空间结构与功能的关系

体内蛋白质所具有的特定空间构象都与其发挥特殊的生理功能有着密切的关系。

（一）肌红蛋白和血红蛋白结构

肌红蛋白(myoglubin，Mb)与血红蛋白都是含有血红素辅基的蛋白质。血红素是铁卟啉化合物，它由4个吡咯环通过4个甲炔基相连成为一个环形，Fe2+居于环中。从X线衍射法分析获得的肌红蛋白的三维结构中，可见它是一个只有三级结构的单链蛋白质，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面，因此其水溶性较好。Mb分子内部有一个袋形空穴，血红素居于其中。

血红蛋白(hemoglubin，Hb)具有四个亚基组成的四级结构，每个亚基结构中间有一个疏水局部，可结合1个血红素并携带1分子氧，因此一分子Hb共结合4分子氧。成年人红细胞中的Hb主要由两条α肽链和两条β肽链(α2β2)组成，α链含141个氨基酸残基，β链含146个氨基酸残基。胎儿期主要为α2γ2，胚胎期为α2ε2。Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。Hb亚基之间通过8对盐键，使四个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。

（二）血红蛋白的构象变化与结合氧

Hb与Mb一样可逆地与O2结合，氧合Hb占总Hb的百分数(称百分饱和度)随O2浓度变化而变化。图1-22为Hb和Mb的氧解离曲线，前者为S状曲线，后者为直角双曲线。可见，Mb易与O2结合，而Hb与O2的结合在O2分压较低时较难。为什么？根据S形曲线的特征可知，Hb中第一个亚基与O 2结合以后，促进第二及第三个亚基与O2的结合，当前三个亚基与O2结合后，又大大促进第四个亚基与O2结合，这种效应称为正协同效应(positivecooperativity)。协同效应的定义是指一个亚基与其配体(Hb中的配体为O2)结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力。如果是促进作用则称为正协同效应;反之则为负协同效应。还可根据Perutz等利用X线衍射技术分析Hb和氧合Hb结晶的三维结构图谱，提出了解释O2与Hb结合的正协同效应的理论。未结合O2时，Hb的α1/β1和α2/β2呈对角排列，结构较为紧密，称为紧张态(tensestate,T态)，T态Hb与O2的亲和力小。随着O2的结合，4个亚基羧基末端之间的盐键断裂，其二级、三级和四级结构也发生变化，使α1/β1和α2/β2的长轴形成15°的夹角，结构显得相对松弛，称为松弛态(relaxedstate,R 态)。Hb氧合与脱氧时T态和R态相互转换的可能方式有多种。此种一个氧分子与Hb亚基结合后引起亚基构象变化，称为变构效应(allostericeffect)。小分子O2称为变构剂或效应剂，Hb则被称为变构蛋白。变构效应具有普遍生物学意义。

（三）蛋白质构象改变与疾病

若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生，有人将此类疾病称为蛋白构象疾病。有些蛋白质错折叠后相互聚集，常形

成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变，这类疾病包括人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨丁顿舞蹈病（Huntingtondisease）、疯牛病等。

第四节蛋白质的理化性质及其分离纯化

TheCharactersofProteinanditsPurification

一、蛋白质的理化性质

（一）蛋白质的两性电离

蛋白质是由氨基酸组成，其分子末端除有自由的α-NH2和α-COOH外，许多氨基酸残基的侧链上尚有可解离的基因，这些基团在溶液一定pH条件下可以解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液在某一pH时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，即成兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点（isoelectricpoint,PI）。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，小于等电点时则带正电荷。

（二）蛋白质的胶体性质

蛋白质是生物大分子，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。

（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固

在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性(denaturation)。

1．蛋白质变性的特征：蛋白质变性的主要特征是生物活性丧失。

2．蛋白质变性的本质：一般认为蛋白质的变性主要发生二硫键和非共价键的破坏，蛋白质变性是蛋白质空间构象的改变或破坏，不涉及一级结构中氨基酸序列的改变。

3．蛋白质变性的意义：在临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂(如疫苗等)的必要条件。

4.若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。但是许多蛋白质变性后，空间构象严重被破坏，不能复原，称为不可逆性变性。

5.蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用(proteinco agulation)。

（四）蛋白质的紫外吸收

蛋白质在280nm波长处有特征性的紫外吸收，可作蛋白质定量测定。

（五）蛋白质的呈色反应

⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应，详见本章第一节。

⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应。氨基酸不出现此反应。

二、蛋白质的分离和纯化

（一）透析及超滤法

（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀

（三）电泳

（四）层析

（五）分子筛

（六）超速离心

小结

Summary

蛋白质是重要的生物大分子，在体内分布广泛，含量丰富，种类繁多。每一种蛋白质都有其特定的空间构象和生物学功能。

组成蛋白质的基本单位为L-α-氨基酸，共有20种，可分为非极性疏水性氨基酸、极性中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸四类。氨基酸属于两性电解质，在溶液的pH等于其pI时，氨基酸呈兼性离子。氨基酸可通过肽键相连而成肽。小于10个氨基酸组成的肽称为寡肽，大于10个则称为多肽。体内存在许多如GSH、促甲状腺释放激素和神经肽等重要的生物活性肽。

复杂的蛋白质结构可分成一级、二级、三级和四级结构四个层次。蛋白质一级结构是指蛋白质分子中氨基酸自N端至C端的排列顺序，即氨基酸序列，其连接键为肽键，还包括二硫键的位置。形成肽键的6个原子处于同一平面，构成了所谓的肽单元。二级结构是指蛋白质主链局部的空间结构，不涉及氨基酸残基侧链构象。主要为α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲，以氢键维持其稳定性。在蛋白质分子中，空间上相互邻近的二个或三个具有二级结构的肽段，完成特定的生物学功能，称之为模体。三级结构是指多肽链主链和侧链的全部原子的空间排布位置。三级结构的形成和稳定主要靠次级键。一些蛋白质的三级结构可形成1个或数个球状或纤维状的区域，各行其功能，称为结构域。四级结构是指蛋白质亚基之间的缔合，也主要靠次级键维系。根据蛋白质的形状，可分成球状蛋白质和纤维状蛋白质。根据组成成分，还可分成单纯蛋白质和结合蛋白质，前者仅含有氨基酸，后者除氨基酸外，还含有非蛋白质的辅基成分。

一级结构是空间构象的基础，也是功能的基础。一级结构相似的蛋白质，其空间构象及功能也相近。若蛋白质的一级结构发生改变则影响其正常功能，由此引起的疾病称为分子病。

生物体内蛋白质的合成、加工和成熟是一个复杂的过程，其中多肽链的正确折叠对其正确构象形成和功能发挥至关重要。蛋白质折叠成正确的空间构象过程，除一级结构是其决定因素外，还需要分子伴侣参与。若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生，有人将此类疾病称为蛋白构象疾病。

蛋白质空间构象与功能有着密切关系。血红蛋白亚基与O2结合可引起另一亚基构象变化，使之更

易与O2结合，所以血红蛋白的氧解离曲线呈S型。这种变构效应是蛋白质中普遍存在的功能调节方式之一。蛋白质的空间构象发生改变，可导致其理化性质变化和生物活性的丧失，称之为蛋白质变性。蛋白质发生变性后，只要其一级结构未遭破坏，仍可在一定条件下复性，恢复原有的空间构象和功能。

分离、纯化蛋白质是研究单个蛋白质结构与功能的先决条件。通常利用蛋白质的理化性质，采取不损伤蛋白质结构和功能的物理方法来纯化蛋白质。常用的技术有电泳法、层析法、超速离心法等。概述

Introduction

核酸（nucleicacid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。核酸可以分为脱氧核糖核酸（d eoxyribonucleicacid，DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）两大类。

第一节核酸的化学组成及一级结构

Chemicalconstitutionandprimaryconstructionofnucleicacid

核酸的基本组成单位是核苷酸（nucleotide），而核苷酸则由碱基、戊糖和磷酸三种成分连接而成。DNA的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide或deoxynucleotide），RNA的基本组成单位是核糖核苷酸（ribonucleotide）。

一、核苷酸的结构

（一）碱基的种类：构成核苷酸的五种碱基（base）分别属于嘌呤（purine）和嘧啶（pyrimidine）两类含氮杂环化合物（见图2-1）。DNA分子中的碱基成分为A、G、C和T四种；而RNA分子则主要由A、G、C和U四种碱基组成。

图2-1参与组成核酸的主要碱基

（二）戊糖与核苷：是核苷酸的另一重要成分。脱氧核糖核苷酸中的戊糖是b–D–2–脱氧核糖；核糖核苷酸中的戊糖为b–D–核糖。这一结构上的差异使得DNA分子较RNA分子在化学上更为稳定，从而被自然选择作为生物遗传信息的储存载体。为区别于碱基中的碳原子编号，核糖或脱氧核糖中的碳原子标以C–1´、C–2´（图2–2）等。

碱基和核糖或脱氧核糖通过糖苷键（glycosidicbond）缩合形成核苷或脱氧核苷，连接位置是C–1 ´。DNA和RNA中的核苷组成及其中英文对照见表2–1。

（三）核苷与磷酸通过酯键结合即构成核苷酸或脱氧核苷酸。生物体内多数核苷酸都是5´核苷酸，即磷酸基团位于核糖的第五位碳原子C–5´上（图2–3）。根据磷酸基团的数目不同，有核苷一磷酸（nucleosidemonophosphate，NMP）、核苷二磷酸（nucleosidediphosphate，NDP）、核苷三磷酸（nucleosidetriphosphate，NTP）的命名方式；根据碱基成分的不同，有AMP（adenos inemonophosphate）、ADP（adenosinediphosphate）、ATP（adenosinetriphosphate）等命名。图2–2核糖和核苷

（四）核苷酸除了构成核酸大分子以外，还参加各种物质代谢的调控和多种蛋白质功能的调节。例如ATP和UTP在能量代谢中均为重要的底物或中间产物；环腺苷酸（cyclicAMP，cAMP）和环鸟苷酸（cyclicGMP，cGMP）等则在细胞信号转导过程中具有重要调控作用。

图2–3不同类型核苷酸的结构

二、核酸的一级结构

(一)定义:核酸的一级结构是指DNA和RNA分子中核苷酸的排列顺序，也称核苷酸序列。由于核酸分子中不同核苷酸之间的差异仅在于碱基的不同，因此也称为碱基序列。

(二)连接方式:磷酸二酯键。四种脱氧核苷酸按照一定的排列顺序以化学键：3′,5′磷酸二酯键（p hosphodiesterlinkage）相连形成的多聚脱氧核苷酸（polydeoxynucleotides）链称为DNA。多聚核苷酸（polynucleotides）链则称为RNA。这些脱氧核苷酸或核苷酸的连接具有严格的方向性，由前一位核苷酸的3´–OH与下一位核苷酸的5´位磷酸基之间形成3´,5´磷酸二酯键，从而构成一个没有分支的线性大分子（图2-4）。它们的两个末端分别称为5´末端（游离磷酸基）和3´末端（游离羟基）。书写规则应从5´末端到3´末端。（见六版教材图2-4）

图2–4DNA的一级结构及其书写方式

(三)DNA和RNA一级结构的差异：

RNA是生物体内另一大类核酸。它与DNA的差别是：①组成它的核苷酸的戊糖不是脱氧核糖而是核糖；②RNA中的嘧啶成分为胞嘧啶和尿嘧啶，而不含有胸腺嘧啶，所以构成RNA的基本四种核苷酸是AMP、GMP、CMP和UMP，其中U代替了DNA中的T。

DNA和RNA对遗传信息的携带和传递，是依靠碱基排列顺序变化而实现的。

第二节DNA的空间结构与功能

SpacestructureandfunctionofDNA

一、DNA的二级结构——双螺旋结构模型

（一）双螺旋结构的研究背景

1．碱基组成的Chargaff规则：①A=T，C=G；②不同种属的DNA碱基组成不同；③同一个体不同器官、不同组织的DNA具有相同的碱基组成。

2．DNA纤维的X线图谱分析显示DNA是螺旋型分子，且为双链分子。

3．RosalindFranklin获得了高质量的DNA的X线衍射照片，显示出DNA是螺旋形分子，而且从密度上提示DNA是双链分子。1953年Watson和Crick总结前人的研究成果，提出了DNA的双螺旋结构模型。

（二）DNA双螺旋结构模型的要点

1．DNA是一反向平行的互补双链结构:DNA分子是由两条反向平行的脱氧多核苷酸链组成，一条链的走向是5′→3′，另一条链的走向是3′→5′。在DNA双链结构中，外侧是由亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成的骨架，内侧是碱基，两条链的碱基之间以氢键结合即A与T配对；C与G配对。两个配对的碱基结构几乎在一个平面上，并且此平面与线性分子的长轴相垂直（图2–5）。2．DNA是右手螺旋结构DNA线性长分子通过初始的折叠形成一个右手螺旋式结构，螺旋直径为2n m，螺旋一周包含了10对碱基，螺距为。外观上，DNA双螺旋分子存在一个大沟和一个小沟，此沟状结构可能与蛋白质和DNA间的识别有关(图2–5）。

图2–5DNA双螺旋结构示意图

3．疏水力和氢键维系DNA双螺旋结构的稳定DNA双螺旋结构的稳定性横向靠两条链间互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持，由以后者更为重要。

（三）DNA结构的多样性

不同的环境条件下，DNA的结构不同，自然界存在的DNA有：

B-DNA右手螺旋（Watson-Crick模型结构）

Z-DNA左手螺旋

A-DNA右手螺旋

体内不同构象的DNA在功能上有所差异，可能参与基因表达的调节和控制。（见六版教材图2-6）图2-6不同类型的DNA双螺旋结构

二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装

DNA是十分巨大的信息高分子，DNA的长度要求其必须形成紧密折叠扭转的方式才能够存在于很小的细胞核内。

（一）DNA的超螺旋结构

DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构（superhelix或supercoil）。盘绕方向与DNA双螺旋方同相同为正超螺旋（positivesupercoil）；盘绕方向与DNA双螺旋方向相反则为负超螺旋（negativ esupercoil）。自然界的闭合双链DNA主要是以负超螺旋形式存在。

（二）原核生物DNA的高级结构

绝大部分原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋分子。在细胞内进一步盘绕，并形成类核（nu cleoid）结构，以保证其以较致密的形式存在于细胞内。在细菌基因组中，超螺旋可以相互独立存在，形成超螺旋区（图2–7），各区域间的DNA可以有不同程度的超螺旋结构。

图2–7环状DNA的超螺旋结构示

（三）DNA在真核生物细胞核内的组装

在真核生物，DNA以非常致密的形式存在于细胞核内。在细胞周期的大部分时间里以分散存在的染色质（chromatin）形式出现，在细胞分裂期形成高度组织有序的染色体（chromosome）染色质的基本组成单位被称为核小体（nucleosome），由DNA和5种组蛋白（histone，H）共同构成。核小体中的组蛋白分别称为H1，H2A，H2B，H3和H4。各两分子的H2A，H2B，H3和H4共同构成八聚体的核心组蛋白，DNA双螺旋链缠绕在这一核心上形成核小体的核心颗粒（coreparticle）。核小体的核心颗粒之间再由DNA（约60bp）和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠样的结构（图2–8）。图2–8核小体的结构示意图

核小体是DNA在核内形成致密结构的第一层次折叠，使得DNA的整体体积减少约6倍。第二层次的折叠是核小体卷曲（每周6个核小体）形成直径30nm、在染色质和间期染色体中都可以见到的纤维状结构和襻状结构，DNA的致密程度增加约40倍。第三层次的折叠是30nm纤维再折叠形成柱状结构，致密程度增加约1000倍，在分裂期染色体中增加约10000倍，从而将约1米长的DNA分子压缩，容纳于直径只有数微米的细胞核中（图2-9）。

图2-9DNA在染色质中的组装

人类的基因组×109bp

DNA的结构特点是具有高度的复杂性和稳定性，可以满足遗传多样性和稳定性的需要。

第三节RNA的空间结构与功能

SpacestructureandfunctionofRNA

RNA在生命活动中同样具有重要作用。它和蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。

RNA分子远小于DNA分子，分子大小的差异变化大，小的仅有数十个核苷酸，大的由数千个核苷酸组成。

RNA分子通常以单链形式存在，局部有二级结构或三级结构。

RNA的种类具有多样性，同时RNA的功能也是多样性的。（表2－2）

表2-2动物细胞内主要RNA的种类及功能

一、信使RNA（messengerRNA，mRNA）的结构与功能

mRNA的长短差异很大，半期最短，由几分钟到数小时不等,在细胞核内合成的mRNA初级产物比成熟的mRNA分子大得多，此种初级产物称为不均一RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA),经过剪接成为成熟的mRNA并移位至细胞质。

图2-10真核细胞mRNA的结构示意图

结构特点：

1．5′端具有帽子结构：大多数真核生物的mRNA在转录后5´–末端以7-甲基鸟嘌呤-三磷酸鸟苷为起始结构，这种m7GpppN结构被称为帽结构（capsequence）。5´–帽结构是由鸟苷酸转移酶加到转录后的mRNA分子上的，与mRNA中所有其他核苷酸呈相反方向。帽结构中的鸟苷酸及相邻的A或G都可以发生甲基化，由于甲基化位置的差别可产生数种不同的帽结构。

mRNA的帽结构可以与一类称为帽结合蛋白（capbindingproteins，CBPs）的分子结合。这种mRNA 和CBPs复合物对于mRNA从细胞核向细胞质的转运、与核蛋白体的结合、与翻译起始因子的结合、以及mRNA稳定性的维系等均有重要作用。

2．3′末端有polyA尾巴：真核生物mRNA3′末端有数十至一百多个腺苷酸连接而成，称为多聚A 尾[poly(A)]。。poly（A）结构也是在mRNA转录完成以后额外加入的，催化这一反应的酶为poly(A)转移酶。poly(A)在细胞内与poly(A)结合蛋白（poly(A)-bindingprotein，PABP）相结合而存在。这种3´-末端多聚A尾结构和5´–帽结构共同负责mRNA从核内向胞质的转位、mRNA 的稳定性维系以及翻译起始的调控。去除多聚A尾和帽结构是细胞内mRNA降解的重要步骤。

的功能：是转录核内DNA遗传信息的碱基排列顺序，并携带至细胞质，指导蛋白质合成中的氨基酸排列顺序。mRNA分子从5´–末端的AUG开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上一个氨基酸，称为三联体密码（tripletcode）或密码子（codon）。

二、转运RNA（transferRNA，tRNA）的结构与功能

细胞内分子量最小的一类核酸，由74到95个核苷酸构成。

1．结构特点：

（1）tRNA分子中含有10%—20%的稀有碱基如：双氢尿嘧啶（DUH）、假尿嘧啶（ψ，pseudouridi ne）、甲基化的嘌呤（mG，mA）

（2）tRNA能形成茎环结构：组成tRNA的几十个核苷酸中存在着一些能局部互补配对的区域，可以形成局部的双链。这些局部双链呈茎状，中间不能配对的部分则膨出形成环或襻状结构，称为茎环（stem-loop）结构或发夹结构。由于这些茎环结构的存在，使得tRNA整个分子的形状类似于三叶草形（cloverleafpattern）。此结构称为三叶草结构。

（3）tRNA分子末端有氨基酸接纳茎：所有tRNA的3´端的最后3个核苷酸序列均为CCA，是氨基酸的结合部位，称为氨基酸接纳茎（acceptorstem）。

（4）tRNA序列中有反密码子：每个tRNA分子中都有3个碱基与mRNA上编码相应氨基酸的密码子具有碱基反向互补关系，可以配对结合，这3个碱基被称为反密码子（anticodon），位于反密码环内。

tRNA的三级结构：X射线衍射结构分析表明，tRNA的共同三级结构是倒L型。（图2–11b）

图2–11tRNA的结构示意图

的功能：在蛋白质合成过程中作为氨基酸的载体并将其转呈给mRNA

三、核蛋白体RNA（ribosomalRNA，rRNA）的结构与功能

核蛋白体RNA（ribosomalRNA，rRNA）是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上。rRNA 与核蛋白体蛋白（ribosomalprotein）共同构成核蛋白体或称为核糖体（ribosome）。原核生物和真核生物的核蛋白体均由易于解聚的大、小两个亚基组成。

原核生物的rRNA共有5S，16S，23S三种；而真核生物的rRNA有18S，5S，，28S四种，它们分别与蛋白质一起组成核蛋白体的大亚基和小亚基，然后由大小亚基共同构成核蛋白体完成其功能。真核生物的18SrRNA的二级结构成花状（图2-12）

图2-12真核生物18SrRNA的二级结构示意图

rRNA的功能:rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核蛋白体,为蛋白质的合成提供场所。

四、其他小分子RNA及RNA组学

除了上述三种RNA外，细胞的不同部位还存在着许多其他种类的小分子RNA，这些小RNA被统称为非mRNA小RNA（smallnon-messengerRNA，snmRNAs）。有关snmRNAs的研究近年来受到广泛重视，并由此产生了RNA组学（RNomics）的概念。

SnmRNAs主要包括核内小RNA（smallnuclearRNA，snRNA）、核仁小RNA（smallnucleolarRNA，sno RNA）、胞质小RNA（smallcytoplasmicRNA，scRNA）、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）等。这些小RNA在hnRNA和rRNA的转录后加工、转运以及基因表达过程的调控等方面具有非常重要的生理作用

核酶：某些小RNA分子具有催化特定RNA降解的活性，在RNA合成后的剪接修饰中具有重要作用。这种具有催化作用的小RNA亦被称为核酶（ribozyme）或催化性RNA（catalyticRNA）。

小片段干扰RNA：近年siRNA的研究受到了特别关注。siRNA是生物宿主对于外源侵入的基因所表达的双链RNA进行切割所产生的、具有特定长度（21个核苷酸）和序列的小片段RNA。它可以与外源基因表达的mRNA相结合，并诱发这些mRNA的降解。

第四节核酸的理化性质

Phisicochemicalpropertyofnucleicacid

一、核酸的一般理化性质：

1．核酸是多元酸，有较强的酸性

2．DNA是线性高分子，机械作用下易发生断裂，而RNA分子远小于DNA

3．DNA粘度较大，而RNA的粘度要小得多

4．DNA和RNA溶液均具有260nm紫外吸收峰（图2–13），因此可进行定量分析。

图2–13几种碱基的紫外吸收光谱图

二、DNA的变性：

1．变性：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。DNA变性只改变其二级结构，不改变它的核苷酸排列。

变性的方法：强酸、强碱、加热以及变性试剂（如尿素、乙醇、丙酮等）

变性的本质：双链间氢键的断裂，即空间结构的破坏，不涉及一级结构的变化。

理化因素的变化：A260的值增加、粘度下降、比旋度下降、浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、

生物活性丧失

2．增色效应（hyperchromiceffect）：在DNA解链过程中，由于更多的共轭双键得以暴露，DNA在紫外区260nm处的吸光值增加，并与解链程度有一定的比例关系，这种关系称为DNA的增色效应（h yperchromiceffect）。(可通过测A260的变化来监测DNA是否发生变性)

3．解链曲线：在连续加热DNA的过程中以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线（图2–14）。

图2-14DNA的解链曲线

从曲线中可以看出，DNA的变性从开始解链到完全解链，是在一个相当窄的温度内完成的。在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度（meltingtemperature，Tm）又称融解温度。

4．Tm值：核酸分子内的50%双链结构被解开时的温度

Tm值的大小与碱基中的G+C比例有关，G+C比例越高，Tm值越大。

计算公式为：Tm=4（G+C）+2(A+T)

三、DNA的复性与分子杂交

1．复性：变性的DNA分子在适当条件下,两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象,称为复性。DNA 的复性速度受温度的影响，只有温度缓慢下降才可使其重新配对复性。一般认为，比Tm低25℃的温度是DNA复性的最佳条件。

2．退火(annealing)：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,此过程称为退火。

注意：DNA受热变性后,温度缓慢冷却才能复性,如迅速冷却至4℃以下，则几乎不能复性。一般认为，比Tm值低25℃的温度是DNA复性的最佳条件。

3．分子杂交（hybridization）：在DNA复性过程中，不同来源的DNA单链分子或者DNA和RNA分子之间，序列完全互补或者不完全互补的两个单链核酸分子之间能形成双链，这种现象称为分子杂交。（见六版教材图2-15）

图2-15核酸分子杂交原理示意图

第五节核酸酶

nucleases

一、核酸酶（nucleases）是指所有可以水解核酸的酶。常用于DNA重组技术中。

二、分类：

1．按作用的底物分：DNA酶（DNase）和RNA酶（RNase）

2．按作用的部位分：

核酸外切酶：作用于多核苷酸链的5′末端或3′末端（5′末端外切酶和3′末端外切酶）

核酸内切酶：作用于多核苷酸链的内部，如有严格的序列依赖性则称为限制性核酸内切酶。

核酶的底物是核酸，因此从功能上来讲也属于核酸内切酶，且为序列特异性的核酸内切酶。人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段也具有序列特异性降解RNA的作用，称为催化性DNA（DNAzyme）。催化性DNA与催化性RNA相比，具有更好的化学稳定性和生物学稳定性，在疾病治疗方面的将有更好的前景。尚未发现天然的催化性DNA的存在。

小结

Summary

核酸是以核苷酸为组成单位的线性多聚生物信息分子，分为DNA和RNA两大类。DNA由脱氧核糖核苷酸连接而形成，RNA的基本组成单位则是核糖核苷酸。DNA分子中的脱氧核糖核苷酸的碱基成分为A、G、C和T四种；而RNA分子中核糖核苷酸的则由A、G、C和U四种碱基组成。碱基与戊糖结合形成核苷。脱氧核苷中的戊糖是b–D–2–脱氧核糖；核苷中的戊糖为b–D–核糖。核苷与磷酸通过酯键连接形成核苷酸。

DNA的一级结构是指DNA分子中的核苷酸的碱基排列顺序，DNA对遗传信息的贮存正是利用碱基排列方式变化而实现的。DNA是双链结构，两条链呈反向平行走向。DNA双链中的腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对存在，形成两个氢键；鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对存在，形成三个氢键。DNA双链是右手螺旋结构。DNA在形成双链螺旋式结构的基础上在细胞内还将进一步折叠成为超螺旋结构，并且在蛋白质的参与下构成核小体。DNA的基本功能是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板。RNA是生物体内的另一大类核酸。mRNA以DNA为模板合成后转位至胞质，在胞质中作为蛋白质合成的模板。成熟的mRNA的结构特点是含有特殊5´–末端帽和3´–末端的多聚A尾结构。mRNA分子上每3个核苷酸为一组，决定肽链上一个氨基酸，称为三联体密码或密码子。tRNA 的结构特点包括存在反密码子、茎环结构和含有稀有碱基等。tRNA的功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的运载体并将其转呈给mRNA。rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核蛋白体，核蛋白体是细胞合成蛋白质的场所。核蛋白体中的rRNA和蛋白质共同为mRNA、tRNA和肽链合成所需要的多种蛋白因子提供结合位点和相互作用所需要的空间环境。RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一种细胞在不同时间、不同状态下SnmRNAs的表达具有时间和空间特异性。

核酸具有多种重要理化性质。核酸的紫外吸收特性被广泛用来对核酸、核苷酸、核苷和碱基进行定性定量分析。核酸的沉降特性用于超速离心法纯化核酸。DNA的变性和复性是核酸最重要的理化性质之一。

DNA变性的本质是双链的解链。DNA的变性从开始解链到完全解链，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度（Tm）。在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被解开。热变性的DNA 在适当条件下，两条互补链可重新配对而复性。在DNA变性后的复性过程中，只要不同的单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可以在不同的分子间杂交形成杂化双链。DNA与DNA及RN A与DNA间的分子杂交在核酸研究中的应用十分广泛。

核酸酶是可以降解核酸的酶。依据核酸酶底物的不同可以将其分为DNA酶和RNA酶两类；依据切割的部位分为核酸内切酶和核酸外切酶；具有序列特异性的核酸酶称为限制性核酸内切酶。

概述

Introduction

一．酶的生物学重要性

一切生物都须不断地进行新陈代谢过程，以维持它们的生命活动，而酶是生物用以进行代谢过程的工具。因为物质代谢过程都需要酶的催化作用，在体内只有极少数不需酶参加而自发进行的化学反应。有些在体外能自发进行的化学反应例：H2O+CO2=H2CO3。在体内也要依赖特殊的酶---碳酸酐酶的催化。在酶的作用下，生物体内复杂的化学反应，能在温和的条件下迅速，准确，平稳而且有规律的进行。

我们来看看食物蛋白质在体内外的分解情况：在体内温和的条件（近中性pH。37℃）下食物蛋白质就能迅速彻底水解成AA，而且AA不会遭破坏。而在体外实验室中食物蛋白质需加入30%的硫酸，1 00℃，24h，才能彻底水解成氨基酸，但在这一过程中有些AA会遭破坏，因而不能得到全部AA。因为物质代谢过程都需要酶的催化作用，所以从总体来说：没有酶催化就没有新陈代谢。

酶不仅是生物进行代谢过程的工具，而且酶也是生物自身产生的特殊蛋白质，所以还可以通过改变酶的活性，控制和调节代谢过程的强度，使代谢过程能经常地与周围环境保持平衡。