植物组织培养技术的研究进展_梁一池
福建林学院学报 2002,22(1):1～3
J o urnal of Fujian Colleg e of Fo restr y
植物组织培养技术的研究进展
梁一池,杨 华
(福建农林大学林学院,福建南平353001)
摘要:植物组织培养技术作为一种科研手段,发展异常迅猛.从组织培养的原理、组织培养方法及培养过程中遇到的问题这3方面综述了近5a国内植物组织培养的新研究.
关键词:组织培养;愈伤组织;原生质体
中图分类号:S682.3 文献标识码:A 文章编号:1001-389X(2002)01-0093-04
Advances of Plant Tissue Culture
LIAN G Yi-chi,YAN G Hua
(Fores try Colleg e of Fujian Ag riculture and Forestry University,Nanping353001,China)
Abstract:Tissue culture,as a w ay o f science r esea rch,has dev elo ped rapidly.In this paper new adv ances in the principle and m etho d o f tissue cultur e,and th e pr oblem during tissue cultur e within r ecent fiv e yea rs w ere described.
Key words:tissue cultur e;callus;pr oto plast
20世纪后半叶,植物组织培养发展十分迅速,利用组织培养,不仅可以生产大量的优良无性系,并可获得人类需要的多种代谢物质;细胞融合可打破种属间的界限,克服远缘杂交不亲和性障碍,在植物新品种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力;还可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体;组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料.因此,植物组织细胞培养广泛应用于植物科学的各个分支,如植物学、植物生理学、遗传学、育种学、栽培学、胚胎学、解剖学、病理学等等.
1 组织培养的基本原理
植物组织细胞培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”.1902年,德国著名植物学家G.Haberlanclt根据细胞学理论,大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直到单个细胞,即植物体细胞,在适当的条件下,具有不断分裂和繁殖,发育成完整植株的潜力的观点.1943年,美国White 在烟草愈伤组织培养中,偶然发现形成一个芽,证实了G.H aberlanclt的论点.
组织培养选用的基础培养基有M T、M S、SH、White、N6等,由于不同种类植物所需要的生长条件有所不同,有的培养基要作一些改良,有的要选择专用培养基,但是一般采用较多的是M S.组织培养采用固体培养基的比较多,但固体培养基只有在植物的周围的营养物和激素被吸收,而大多数的物质还残留在培养基里,如果这些培养基还能被利用,对工厂化生产的减少成本方面有很大的帮助.董雁等[1]利用回收转换后废弃的继代培养基,加入原继代培养基30%浓度母液的培养基,丛生状苗分化情况和抽茎苗生长发育与原继代培养基的基本相同,说明继代培养基再利用的试验是可行的.这为规模化组培育苗开辟了新的途径.杜勤[2]等在无外源激素条件下,研究液体和固体培养基对黄瓜子叶培养器官分化的影响,结果用液体培养基直接诱导花芽率更高,分化高峰期出现的时间也更早.这也说明了液体培养基对外植体的生长更有利,只是固体培养基在操作上更方便,被较广泛应用.
在基础培养基里添加一定浓度的外源激素,可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官,最终可获得再生植株或者次生产物.常用的激素类型有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素等.赵建萍[3]等使用多效唑诱导生根,使试管苗矮化,茎杆粗壮,叶色浓绿,对移栽成活有明显效果,提高抗逆性.Sabala[4]
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(B9910020).
第1作者简介:梁一池(1952-),男,福建福鼎人,教授,从事林木遗传育种研究.
收稿日期:2001-03-19;修回日期:2001-09-26
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等发现ABA能诱导和降低一些蛋白的合成和分泌,这使欧洲云杉胚发生细胞系分泌出了一种抗寒类蛋白.激素浓度和组合对组培成功的影响很大,因此,在决定激素浓度过程中,采用了试验设计方法,如均匀设计法、单因素试验设计、正交试验设计等,通过统计计算,更能求出最佳的激素组合和比例.
同时还有人研究了外源激素的添加对内源激素的影响,陶静[5]等人在对白桦组培再生系统的研究中发现,加入不同的外源激素对内源激素的影响各不相同,但对IAA的影响最大.当单独加入BA时,其浓度对愈伤组织的IAA含量影响很小;当BA和N AA配合使用时,愈伤组织中IAA的含量随N AA浓度的增加而显著增加.这说明激素间的协同作用效果要远大于一种激素的单独使用的效果.而且不同的外源激素极有可能引起内源的多胺的不同变化.多胺对植物的许多生理生化过程都有影响,它的变化影响可溶性蛋白、过氧化物酶,进而导致不同的形态发生[6].Yolande等[7]在研究橡胶树无性系复壮试验时指出,内源玉米素类细胞分裂素水平可以作为橡胶树复壮处理后试管内芽和根器官发生恢复的可靠指标.
在组织培养中,愈伤组织和胚状体的形成是能否培育出新植株的关键一步.胚性愈伤组织比非胚性愈伤组织具有更强的生长能力、胚胎发生能力和相对较高的同工酶活性,而形成胚状体再分化出植株比形成愈伤组织再形成植株要更容易.近年来,人们不仅研究再生植株的培育[8～11],还重点研究愈伤组织的一些特性,较多的是利用愈伤组织鉴别植物抗性.如张立钦等在研究杨树和湿地松愈伤组织耐盐性时发现,杨树不同器官外植体的愈伤组织的耐盐性有所不同,而且杨树继代愈伤组织的耐盐能力显著高于湿地松,与植株水平的耐盐性相一致.但同一种植物的离体培养细胞与整体植株耐盐性不一定一致.成静等[12]在水稻“种子植株——愈伤组织——再生植株”系统中的耐盐性研究中,也认为在应用组培技术筛选完整耐盐性植株时,应注意耐盐指标的选择,需要寻找能反映耐盐性遗传潜力的筛选指标,利用一些直观的反映愈伤组织生长状况的耐盐指标进行组培技术比较水稻品种的耐盐性不大可靠.接着他们又发现在种子植株和再生植株水平时,水稻耐盐基因型的地上部钠离子含量大都显著低于其对应的盐敏感基因型,证实了水稻植株地上部的钠离子含量可作为判别水稻耐盐性的一个生理指标.但在愈伤组织中,水稻不同基因型的钠离子含量没有显著差异,这暗示了植株水平与细胞水平的钠离子吸收机理可能不一致.Kavikishor在对水稻盐适应细胞的研究中,认为ABA可促进初次生长在盐胁迫下的愈伤组织对盐的适应能力.陆卫等[13]分析了外源ABA可使谷子胚性愈伤组织生长减缓,使正常胚性愈伤组织在Na Cl胁迫下与耐盐胚性愈伤组织的生长差异消失.也许这是由于细胞在适应盐胁迫的生理过程中调整蛋白质的合成与降解以适应新的环境.
李玲[14]通过百草枯和苯甲酸钠对渗透胁迫下抗旱性不同玉米品种愈伤组织的影响的研究,得出了抗旱性强的品种愈伤组织抗氧化胁迫和渗透胁迫能力强于抗旱性弱品种,并且这是与含高活力抗氧化系统密切相关的一个结论.
同时,还有人研究了病菌对愈伤组织的影响.汪国平等[15]发现番茄愈伤组织的离体抗性与田间抗性呈相反趋势,因此在愈伤组织上进行番茄抗青枯病突变体筛选的难度较大.有人[16,17]研究了愈伤组织的保存问题,对各种影响愈伤组织超低温保存的因素进行比较,这为愈伤组织的长期保存打下基础,成为一种种质保存和贮藏的新方法.
2 组织培养的方法
组织培养的材料称为外植体(ex plant),主要形式有器官、胚胎、单细胞、原生质体等等[18].近年来,利用各种外植体进行组织培养[19～23],在筛选突变体、获得次生代谢产物等方面取得了一定的成绩.
吴元立等[24]用成熟胚乳培养银杏,认为胚乳愈伤组织的诱导无需胚存在,而Bhojw ani[25]曾强调胚乳培养中胚的重要性.在后来的La kshmi等研究也表明:无论诱导胚乳产生愈伤组织或分化器官均无需胚的存在.Fo ntanel等[26]从银杏雌配子体中诱导胚状体发生,指出诱导的最佳时期是授粉后8～11周.因此,胚乳的发育时期也是银杏胚乳培养中存在的一个影响因素.
利用细胞培养的方法,可以获得次生代谢产物,如色素、紫杉醇、人参皂甙、生物碱、萜内酯等.中国林科院对东北红豆杉叶愈伤组织进行细胞克隆及悬浮磁头研究获得了生长量高达0.49Fw/g·Fw·d 的细胞系,每升细胞培养物紫杉醇的产量可达0.25mg.一般致密的、聚集组织的细胞培养物比松散的、
无组织的细胞培养物积累更多的次生代谢产物.这可能是由于培养物细胞的组织化,使细胞间紧密接触,有利细胞间的联络,形成光照、营养物质、机械压力等物理、化学上的梯度,接近于整体植物细胞代谢环境,从而有利于次生代谢产物的积累[27].刘长军等[28]使用真菌诱导子,促进新疆紫草的紫草素的合成.真菌诱导子是一类在植物超敏反应中能引起植物细胞合成和积累稳定产物的活性物质.作为一种特定的化学信号,在植物与微生物的相互作用中,它们可以快速、专一和有选择地诱导植物代谢过程中特定基因的表达.荆迎军等[29]用红豆杉细胞与赤霉菌交互诱导,结果与未受植物来源物质作用的单向诱导相比,可提高紫杉醇含量5倍,在诱导物是红豆杉细胞壁和赤霉菌细胞壁时,交互诱导效果最好.在细胞培养过程中,细胞生长是很慢的,大部分合成的次生代谢产物是疏水物质,在培养液里溶解度很低,产物的反馈抑制作用和被培养液中的催化酶分解作用,致使产物产率更低,因此就需要在培养过程中将合成的次生代谢产物及时取走,以提高产率.
原生质体的培养较其它外植体培养复杂得多,必须解决像细胞壁降解酶的制备、体细胞原生质体的分离和培养等问题.Tseng 等[30]曾报道用酶处理分离竹子原生质体,但没有报道是否有活力.原生质体不仅具有活细胞的性质,而且可以融合形成杂种细胞,由于去掉了细胞壁,所以获得了易于摄取外来的遗传物质、细胞器以及病毒、细菌等微生物等特性,因此对原生质体的研究也很多.董晋江等[31]将谷子胚性愈伤组织粘液提取物添加到谷子原生质体培养基上,对原生质体培养的影响表明该提取物有助于原生质体形成细胞壁,并且该类有粘液分泌的愈伤组织的原生质体游离所需的酶液浓度低,处理时间短.3 植株再生过程中遇到的问题
在组培过程中,部分外植体会产生褐变现象,这主要是由PPO 作用于天然底物酚类物质而引起的[32].影响组培外植体褐变的因子,主要有外植体酚类物质的含量及PPO 活性上的差异、外植体的大小、酶促因子对外植体褐变的影响,以及培养基成分、激素类型.为解决这个问题,可以采取以下几种方法:将易于褐变的外植体放在黑暗条件下培养一段时间;连续转移;进行预处理;在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂来抑制褐变.陈学森等[33]在银杏组织培养中应用了植酸作抗氧化剂,取得一定成效.
植物离体培养及大量快繁过程中,试管苗常会产生玻璃化现象,吴若菁等在香石竹组培中,发现影响组培苗玻璃化的原因有以下几种类型:激素的种类、浓度;琼脂的浓度;外植体的取材部位;不适宜的培养条件.因此采取的克服方法也要因原因的不同而决定[34].
在组培中,还会形成白化苗.白苗的形成原因并不是无质体,而是质体结构不完整,不能正常合成叶绿素,因此这种苗一般是不能遗传的[35].
通过愈伤组织培养植株时,常会出现染色体数目的变异,包括倍性变异和非倍性变异
[36].这种变异普
遍认为是有丝分裂异常现象,可视为染色体数目变异和结构变异最直接的细胞学证据.4 组织培养的前景及问题
组织培养技术已为人们广泛的应用在各个领域,它为许多学科研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好试材和有效途径.由于组织培养在人工控制的条件下进行的,容易掌握花芽分化和开花的成因,在试管内人工受精,获得杂种或自交种;通过分离单倍体细胞,能培育纯合的二倍体优良品系,缩短育种时间;通过选择突变体,提高植物的品质,增强抗盐、抗旱、抗寒等方面的能力,扩大植物的生长范围;将体细胞冷藏在低温下,建立基因库,达到保存物种的目的;获得药用价值高和工业生产所需的次生产品,解决部分获得难度大的问题,等等这些应用已引起广大的关注.但是长期以来,组织培养多数还停留在试验研究上,在应用生产方面还有一定不足,因此今后需要有一套可行的措施,将研究成果转化为有经济价值的大规模生产实践.
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(责任编校:江 英)