流胶病原物分离步骤

果树流胶病病原细菌的分离鉴定

1、样品处理

将病组织用75% 酒精表面消毒，然后用无菌水冲洗3 次，再用灭菌手术刀切取病健交界处的植物组织，切成碎片后放入等量无菌水中浸泡30 min，然后在LB 平板培养基上划线分离，置28℃恒温箱中培养48 h。

2、菌落纯化

挑取代表性单菌落进行划线分离纯化，在KB 培养基上置365 nm 波长紫外光下观察菌落是否产生荧光。

LB培养基配方：胰蛋白胨(Tryptone) 10g

酵母提取物(Yeast extract) 5g

氯化钠(NaCl) 10g

加水至1000 ml. 固体培养基需按1.5%比例加入琼脂粉。

KB培养基：蛋白胨20 g,

甘油10 mL

K2HP04 1.5 g

MgS04．7H20 1.5 g,

加至水1000 mL. 固体培养基需按1.5%比例加入琼脂粉。

3、菌落形态特征

挑取典型菌落进行分离纯化，获得的N 个菌株，依次编号为1---N-。并记录

在LB 培养基上培养48 h菌落形态特征，包括：菌落？形状，？色，其边缘是否完整，是否透明，菌落表面光滑或者粗糙，菌落是否黏稠，紫外灯下( 365nm)（避光观察也可）能否产生？色荧光。

4、生理生化特性测定

依据病原细菌鉴定指导进行。

5、病原菌的ITS 序列测定

将供试菌株接种在LB液体培养基中，28℃摇瓶培养( 160 r·min ) 48 h，提取基因组DNA。根据已发表的植物病原细菌ITS 序列设计引

物进行PCR 扩增，特异引物为: P1 ( 5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTTC-

3') 和P2 ( 5'-GCTTTACGCCCAGTAATTCCC-3') 。PCR 反应条件:94℃变性5 min; 94℃ 50 s，55℃ 1 min，72℃ 1min， 35 个循环; 最后72℃延伸10 min。PCR 产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，将目标片段进行回收和连接，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR 检测后挑取阳性菌落送交上海生工生物公司测序。

测序结果在GenBank 上进行BLAST 搜索，应用DNAMAN 进行同源比对，并用MegAlign 构建系统发育树，分析其亲缘关系。

六、病原菌syrB 基因的PCR 检测

为检测分离菌株中是否存在编码环式脂肽毒素的syrB 基因，合成特异性引物B1 ( 5'-CTTTCCGTGGTCTTGATGAGG-3') 和B2 ( 5'-TCGATTTTGCCGTGATGAGTC-3') ，PCR反应条件: 94℃变性5 min; 94℃ 50 s， 55℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环; 最后72℃延伸10 min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

七．致病性测定

将28℃下培养48 h 的菌株用无菌水稀释成108CFU·mL/1 的菌悬液用于所有接种试验。健康的离体枝条表面用75% 酒精消毒，用注射器在枝条表面和叶芽基部针刺造成微伤口，将稀释好的菌悬液接种于伤口处，每处理接种5 个枝条，重复3 次，以接种无菌水作为对照，用塑料袋保湿，定期观察记录; 花芽萌发前5 d 采用喷雾法，接种离体带花芽的甜樱桃枝条3 条，以接种无菌水作为对照，重复3 次，定期观察记录; 果实成熟前采集果实离体接种，用注射器接种后放在有浸湿滤纸的培养皿中，以接种无菌水作为对照，定期记录观察结果。

蛋白胨 1

牛肉浸膏 1

放线菌酮 1

L-苯丙氨酸

KH2P04（注意：二氢钾，可带结晶水）1

硼砂 1

CK0.250.5124菌株

株菌