生物技术制药实验讲义新

Biotechnological Pharmaceutics

龙岩学院生物科学与技术系

生物技术教研室编

2008年9月

编写说明

自1982年第一个基因工程产品-人胰岛素投入市场以来，生物技术制药得到迅速发展，医药生物技术已成为整个生物技术中发展最快、效益最好、影响最大的重要分支。生物药物的种类和数量迅速增加，对人类的健康、疾病治疗产生很大的影响，并产生了巨大的社会效益和经济效益。

《生物技术制药实验》是为生物技术专业高年级本科学生开设的一门设计及研究性实验，课程的主要内容包括:基因工程菌的构建、基因工程菌的发酵培养条件的工艺的优化、工程菌发酵产物的检测、工程菌发酵产物的提取、分离与纯化、鉴定。

通过本课的教学，强化实验技能训练，使学生掌握生物技术新药的设计思路，学会以基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等现代生物技术研制生物药物的基本原理和方法，从而使学生更进一步加深理解和巩固所学的生物技术制药课程的理论知识。

本讲义编写的宗旨是简明、实用，结合了本实验室的实际条件，实验尽量避免使用昂贵的仪器和材料。本讲义可供本科生、专科生使用，可根据理论课程的实际教学进程安排实用项目。

基因工程菌发酵生产丙酮酸盐的综述

实验一丙酮酸盐的发酵培养基的配置和产量的测定

实验二丙酮酸盐高产菌株的快速筛选

实验三丙酮酸盐的液体发酵及其工艺条件的优化

实验四丙酮酸盐的提取与纯化

参考书

基因工程菌发酵生产丙酮酸盐的综述

1、丙酮酸盐项目介绍

1.1 课题研究背景

丙酮酸(Pyruvic acid)，又称α-氧代丙酸，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体，制药工业用于酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴;合成L-半胱氨酸、L-亮氨酸、维生素B6和B12等。生化研究用于伯醇及仲醇的检定;转氨酶的测定;是脂肪族胺的显色剂等。农用化学品用于合成乙烯系聚合物、氢化阿托酸、古物保护剂等多种农药的起始原料。细胞培养中与乳酸组成抗氧化剂，降低对细胞的伤害;是动物细胞培养的重要底物。

另外，丙酮酸及其盐类(丙酮酸钠、丙酮酸钙等)还可以作为食品添加剂广泛应用于食品和酿酒工业，特别是近年来丙酮酸盐在减肥方面的应用，受到西方消费者青睐，更是引起了丙酮酸盐生产和研究的热潮。

1.2 丙酮酸钠的生物药物功能

丙酮酸钠或酯是有效的抗氧化剂和自由基清除剂 ,被应用于防治心肌、肠和肝等组织器官的缺血/再灌注损伤。丙酮酸钠作为等渗的复苏液 ,较氯化钠明显延长了失血性休克动物的存活时间。在休克开始之初给予丙酮酸钠能够改善机体的氧化还原状态 ,防止重要抗氧化剂-谷胱甘肽(GSH)的损失 ,抑制肝细胞的凋

还能够改善脑的代谢和功能。在放血前和放血同时给予丙酮酸钠可以延长动

亡 ,

物的存活时间、推迟心血管系统衰竭的发生。另外，丙酮酸钠对失血性休克引起的全身性缺血/再灌注损伤起着重要的保护作用。

总之 ,丙酮酸钠作为抗氧化剂 ,能够直接清除氧自由基 ,减少中性粒细胞的浸润 ,减轻失血性休克引起的炎性反应 ,对缺血/再灌注损伤起保护作用。而且,丙酮酸钠是副作用较小的天然代谢底物 ,由微生物发酵生产,工艺日渐成熟，成本低廉 ,在防治休克及其他疾病引起的缺血/再灌注损伤方面 ,具有广阔的应用前景。

1.3 丙酮酸钙的生物药物功能

丙酮酸钙作为膳食补充剂，具有加速体内TCA循环，促进脂肪代谢、减轻体重、增强人体耐力、提高竞技成绩等功效;对心脏有特殊的保护作用，可增强心脏肌肉的效能，减少心脏病或心脏局部缺血造成的损伤;同时，丙酮酸钙具有吞噬体内自由基和抑制自由基的生成等显著效果。

1.4 丙酮酸盐的代谢途径

丙酮酸盐的传统生产方法为化工合成，原料昂贵，污染严重。现已逐渐地转变成为了使用微生物发酵法生产，其基本思想是基于丙酮酸代谢途径考虑的。

细胞内丙酮酸的代谢途径如上图所示，葡萄糖进入细胞后经糖酵解途径生成磷

酸烯醇式丙酮酸，然后生成丙酮酸，在此过程中需要NAD作为质子H的受体。丙酮酸主要通过六条支路进一步代谢: (1)丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系〔PDH)的作+用下生成乙酞辅酶A，进入TCA循环，需要焦磷酸硫胺素(TPP)、硫辛酸、FAD, NAD、

2+辅酶A和Mg共六种辅助因子;(2)丙酮酸在丙酮酸脱羧酶(PDC)的作用下脱羧

生成乙醛，进而还原成乙醇，其中PDC需要TPP(VB1) 作为辅酶:(3)丙酮酸在厌氧+ 状态下由乳酸脱氢酶 (LDH)作用生成乳酸，此过程中需要NADH+H为其提供

质子H; (4)丙酮酸在丙酮酸羧化酶 (PC)作用下生成草酰乙酸 (OAA)，此过程需要

生物素 (Bio)为辅酶;(5)丙酮酸在谷一丙转氨酶 (以吡哆醛Pdx为辅酶)作用下生

成丙氨酸 (Ala); (6)丙酮酸经多步反应在转氨酶的作用下形成缬氨酸、异亮氨

酸。

1.5 丙酮酸盐的发酵机制

丙酮酸在发酵液中与一些离子(钙离子、钠离子等)相结合，形成了丙酮酸盐，因此我们要得到最大量的产物丙酮酸盐就必须通过控制丙酮酸的代谢合成途径，积累丙酮酸。

丙酮酸是机体代谢的中间产物，既处于糖酵解 (EMP)途径的末端，又是连接EMP途径和TCA循环的关键产物，它可经多条途径生成乙醇、乳酸、草酞乙酸、丙氨酸、撷氨酸和异亮氨酸等。因此其所处的位置极为特殊。根据代谢控制育种和发酵原理，要想在生物体内大量积累丙酮酸，就必须进一步切断或更确切地说是减弱丙酮酸的进一步代谢支路，加速丙酮酸的合成速度，去除代谢产物的反馈阻遏或反馈抑制。

目前，国内外微生物发酵法生产丙酮酸盐使用最为广泛的就是经基因工程菌改造的维生素营养缺陷型光滑球拟酵母()。该基因工程菌，Torulopsis glabrata经基因工程操作，敲除了丙酮酸脱羧酶(PDC)的合成基因，解除了代谢支路乙醇的合成，在不影响菌株正常生长代谢的情况下，增加了丙酮酸的积累。维生素在丙酮酸的合成和分解中起着重要的调节作用，该菌株同时还是盐酸硫胺素、烟酸、生物素和烟酸吡哆醇营养缺陷型菌株，可主要作用为减少丙酮酸进入TCA循环进行进一步的代谢分解，增加了丙酮酸的产物积累。但同时TCA 循环是为菌株的生长代谢提高了必须的能量，所以需要再发酵培养基中添加少量的维生素维持菌株的正常生长。

1.6 国内外研究水平

国内目前有关发酵法生产丙酮酸(盐)的论文、专利和生产情况报道较少。江南大学从1997年开始进行发酵法生产丙酮酸(盐)的研究，在选育出丙酮酸(盐)高产菌Torulopsis glabrata WSH-IP12的基础上，对发酵条件进行了优化，目前，在实验室5L发酵罐中，他们的研究水平已经达到产酸72g/l、生产率1.2g/l/h、对葡萄糖转化率70%，超过已报道的国际最高水平。该“发酵法生产丙酮酸(盐)中

试”项目列入江苏省“九五”工业重大科技攻关项目，已完成35m发酵罐中试，于2000年12月30日通过江苏省科技厅组织的鉴定和验收，认为达到国际先进水平，填补国内发酵法生产丙酮酸(盐)空白。此外，中国科学院微生物研究所以及天津科技大学等科研院所对丙酮酸(盐)发酵生产都在进行研究。

2、丙酮酸盐发酵工艺路线

原始菌种摇瓶活化涂布单菌落转接入斜面菌种保藏

(挑选高产菌株)

种子摇瓶(测定菌株生长曲线)

摇瓶培养发酵罐发酵

(确定培养条件、产物测定方法)

产物的提取、分离与纯化

产量的测定与产物鉴定

3、测定的参数、曲线说明

需要测定的项目主要有:菌株生长曲线，产物生成曲线，糖耗曲线，产物生产率等。

实验一丙酮酸盐发酵培养基的配置和产量的测定

一实验目的

1. 掌握丙酮酸盐种子培养基、发酵培养基的配置

2. 掌握硝酸铁法测定丙酮酸盐产量

3. 熟悉DNS法的测定葡萄糖的原理

二实验原理

(1)培养基的配置原则

培养基通常指人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。培养基是微生物学尤其是工业微生物学研究的重要内容。一个恰当的培养基配方，对发酵产品的产量和质量有着极大的影响。

丙酮酸发酵培养基的配制原则:

1、营养物质应满足微生物的需要;

种子培养基(seed culture medium):是适合微生物菌体生长的培养基，目的是为下一步发酵提供数量较多，强壮而整齐的种子细胞。一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。

发酵培养基(fermentation medium):用于生产预定发酵产物的培养基。一般的发酵产物以碳为主要元素，所以，发酵培养基中的碳含量往往高于种子培养基。若产物的含氮量高，应增加氮源。在大规模生产时，原料应该价廉易得，还应有利于下游的分离提取工作。发酵培养基的确定需要根据目标产物以及菌种特殊的生理生化特性最终确定。

2、营养物的浓度及配比应恰当

丙酮酸盐发酵涉及的营养物质包括碳源、氮源、维生素和金属离子;适宜的碳氮源，最佳的碳氮比(C/N)、微量元素的种类及含量都会极大的影响发酵;如发酵培养基中氮源的选择，选择蛋白胨，还是铵盐对发酵结果明显存在差异;又如过高的糖浓度有明显的抑制发酵作用，还有对于维生素缺陷型的光滑球拟酵母而言过量的维生素只会引起菌体疯长而无益于丙酮酸盐的积累。

3、物理化学条件适宜

pH值:各大类微生物一般都有它们生长繁殖的最适pH。细菌的最适pH一般在7.0-8.0，放线菌在pH7.5-8.5间，酵母菌在pH3.8-6.0间，霉菌在pH4.0-5.8之间。

丙酮酸盐发酵中，光滑球拟酵母在发酵培养基中具有很强的产酸能力，如不适当地加以调节，就会抑制甚至杀死其自身。所以在设计它们的培养基时，就要考虑到培养基的pH调节能力。一般应该加入磷酸缓冲液或CaCO3，使培养液的pH 稳定。

CaCO3在水溶液中溶解度极低，加入液体或固体培养基中，不会使培养基pH升高。但是，当微生物生长过程中不断产生酸时，它被逐渐溶解，并与酸反应，最终以CO2形式释放到大气中，所以，它具有良好的稳定培养基pH的作用。

4、根据培养的目的

培养基的成分直接影响着培养的目标。在设计培养基时必须考虑是要培养菌体，还是要积累产物，是实验室培养还是大规模发酵等问题。用于培养菌体的种子培养基营养成分应丰富，尤其是氮源含量宜高。即碳氮比值低。相反，用于积累大量生产代谢产物的发酵培养基，它的氮源一般应比种子培养基稍低。当然，若发酵产物是含氮化合物时，有时还应该提高培养基的氮源含量。在设计培养基尤其是大规模发酵生产用的培养基时，还应重视培养基中各种成分的来源和价格，应该优先选择来源广泛、价格低廉的培养基，提倡“以粗代精”，“以废代好”。

(2)硝酸铁法测定丙酮酸盐

硝酸铁法测定丙酮酸盐质量浓度的实验原理:丙酮酸根离子能够与铁离子结合生成如下图1所示的黄色络合物，该物质在波长540nm下有最大的光吸收值。在一定范围内丙酮酸的量与黄色络合物的颜色深浅程度成一定的比例关系，在540nm下测定黄色络合物的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求出样品中丙酮酸盐的含量。

图1 硝酸铁络合物图

(3) DNS法的测定葡萄糖的原理

DNS试剂法测定葡萄糖浓度的实验原理:在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，还原糖则被氧化为糖酸或其它产物。棕红色物质在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量，DNS与还原糖的反应如图2所示。

图2 DNS与还原糖的反应

三实验材料与设备

1. 实验材料

酵母抽提物蛋白胨葡萄糖(工业) 磷酸二氢钾

碳酸钙七水硫酸镁硫酸胺盐酸硫胺盐酸吡哆醇

生物素烟酸核黄素盐酸硫胺氯化钙七水硫酸铁

氯化锌氯化锰硫酸铜 3,5-二硝基水杨酸氢氧化钠

酒石酸钾钠结晶粉亚硫酸钠丙酮酸钠琼脂

砂布三角瓶离心管试管

2. 实验设备

灭菌锅 pH计电子天平紫外可见分光光度计

离心机移液器

四实验步骤

1、培养基配制

斜面培养基--YPD培养基(g/L):

酵母抽提物 10 蛋白胨 20 葡萄糖 20 蒸馏水 1000 琼脂 20-25 pH 5.0-5.5 种子培养基:(g/L)

葡萄糖 40 磷酸二氢钾 1 七水硫酸镁 0.3 蛋白胨 5 pH 5.0-5.5

发酵培养基:(g/L)

碳酸钙 40 葡萄糖 100 硫酸铵 8 磷酸二氢钾 2 七水硫酸镁 0.3 金属离子液pH 5-5.5 维生素母液

2、相关试剂的配制

(1)维生素母液的配制方法:(每1000mL)

表1 维生素母液配制及使用方法

维生素名称所需浓度(mg/L) 母液浓度(mg/L) 加量(mL)

盐酸硫胺 0.020 50 0.4

盐酸吡哆醇 0.5 500 1

生物素 0.020 50 0.4

烟酸 8 4 2

核黄素 0.1 100 1

注:维生素母液配制均需采用三蒸水

(2)金属离子混合液的配方:

CaCl 5g FeSO7HO 4g ZnCl 500mg 2422

MnCl 300mg CuSO5HO 400mg 242

用少许2mol/L的盐酸完全溶解后，用蒸馏水定容至500ml，使用时每1000ml 发酵培养基中加入5ml金属离子混合液即可满足发酵要求。

(3) 硝酸铁溶液(0.1mol/L):称取4.04g的 Fe(NO3)3 溶于100mL蒸

馏水中，棕色瓶保存。

(4) DNS试剂:将6.3g的3,5-二硝基水杨酸和262mL 2mol/L NaOH溶液，

加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶粉和

5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，盛于棕色

试剂瓶中。

(5)丙酮酸盐标准液:0.1mol/L，精确称取1.10g丙酮酸钠，蒸馏水溶解

定容至100ml。

(6) 标准葡萄糖溶液(1mg/mL):取无水葡萄糖0.5g，定容到500mL。

3、培养基灭菌

含维生素培养基灭菌条件为:0.07Mpa，15分钟;

碳酸钙单独灭菌，装入容器内，用时加入培养基中，灭菌条件为0.1 Mpa，60分钟;

维生素通常采用过滤除菌，但是用量较大时也可以按量加入发酵培养基中一同灭菌。

2. 绘制丙酮酸盐标准曲线

取七只10mL离心管，按下表2依次加入试剂;

表2 丙酮酸盐标准曲线的绘制

管号 1 2 3 4 5 6 7

丙酮酸钠(mL) 0 0.1 0.5 0.9 1.3 1.7 2.0

硝酸铁(mL) 2 2 2 2 2 2 2

蒸馏水(mL) 3.0 2.9 2.5 2.1 1.7 1.3 1.0

按上述表加好样品后，摇匀，于752型分光光度计上测定540nm下的OD值，记为OD540，做出标准曲线。

5. 绘制葡萄糖标准曲线

取7只试管，按下表3依次加入试剂:

表3 葡萄糖标准曲线的绘制

管号 1 2 3 4 5 6 7

Glc标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 3.5-二硝基水杨酸(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

上述试管装液后摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml，摇匀。在540nm波长下比色，用1号管调零，分别读取1-7号管的吸光度值，吸光度为纵标，Glc毫克数为横标做出标准曲线。

五思考题

1. 请计算本实验所配种子、发酵培养基的碳氮比是多少。

2. 整理数据，并绘制硝酸铁标准曲线、DNS标准曲线于坐标纸上

实验二丙酮酸盐高产菌株的快速筛选一实验目的

1、对丙酮酸盐发酵过程的复习总结;

2、设计出高产丙酮酸盐菌种的快速筛选法并进行试验达到预期目的。

3、锻炼自行设计实验解决问题的能力。

下面示例为预习报告格式，试验前提交预习实验报告。

预习实验报告交教师批改后实验并完成正式实验报告。

二、实验设计举例

方案一 CaCO固体平板法筛选丙酮酸盐高产菌株 3

1、实验目的:

设计出一种方案快速的筛选到高产菌株。

2、实验意义:

在发酵工厂中菌种复壮工作非常重要，但是工作量大，效率不高，因此选择一种省时省力的种筛选方法，在短时间内完成大量菌株的初筛，获得产酸多的菌株，节约大量物料、能源及劳动力，对工业生产意义重大。

3、实验设计原理:

该方法可以在平板培养阶段就可以直观的分辨出高产菌株，省去了发酵摇瓶培养以及产物检测阶段;同时也筛选到单菌落，便于菌种保存。 4、实验材料及设备CaCO固体培养基: 3

Glc 40g (NH)SO 3g KHPO 1g MgSO?7HO 0.5g 4242442

ZnCl 5mg CaCl 50mg FeSO 40mg CuSO 4mg MnCl 3mg 22442

盐酸硫铵素 0.02mg 盐酸吡哆醇 0.50mg

生物素 0.02mg 烟酸 8.00mg

CaCO3 5g 蒸馏水 1000mL 琼脂 20g pH5.5

设备:灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台等。

5、实验步骤

流程如下:

原始菌株?梯度稀释?CaCO固体平板分离单菌落?恒温培养20小时?观察3

透明圈大小?选择圈最大的菌落接种保藏斜面

此过程需要24小时左右，比常规方法快30小时左右，工作量也大大减轻。

附常规流程:

原始菌株?种子摇瓶培养24小时?发酵摇瓶培养24小时?丙酮酸检测?菌种保藏

6、日程安排

第一天:培养基的配制灭菌，倒平板，静置过夜;

第二天:梯度稀释分离，恒温培养;

第三天:观察透明圈大小，保存菌种。

7、预期实验结果。

方案二 TTC平板法用于丙酮酸盐菌株的筛选

1、实验目的:

设计出一种方案快速筛选到低副产物的菌株。

2、实验意义:

发酵液中副产物越少越有利于主要产品的提纯，有助于减少物料，能源的消耗，同时提高产物纯度，提高产品质量。通过实验确定出一种可以筛选出低副产物菌株的方法对于发酵生产意义重大。

3、实验设计原理:

光滑球拟酵母在发酵培养基中可以发酵产生丙酮酸，同时也产生乙醇，乙醇是一种副产物，不利于丙酮酸的提纯，所以我们的的目的菌株应是地乙醇浓度的菌株。

TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)是一种显色剂，能与乙醇脱氢酶(ADH)作用使其失活，同时产生红色物质。在丙酮酸通向乙醇的代谢过程中，乙醇产量受此酶活性影响。产酒精能力强的酵母ADH活性强且与TTC作用呈深红色，次之显粉红色，微红色或不显色。用于发酵产丙酮酸的菌种在理论上应该是选择,,,酶活力较弱的，这样可以减少丙酮酸向乙醇的转化，发酵副产物少也有利于产品的分离提纯，因此白色或粉红色菌株可能是我们的目的菌株。

该方法可以在平板培养阶段就可以通过菌落颜色直观的分辨出低产乙醇菌株。

4、实验材料及设备

上层显色培养基(TTC培养基):

葡萄糖5,，琼脂20,，TTC 0.5,，pH自然，加水至1000mL。

下层固体培养基:

Glc 40g (NH)SO3g KHPO 1g MgSO?7HO 0.5g 424 2442

ZnCl 5mg CaCl 50mg FeSO 40mg CuSO 4mg MnCl 3mg 盐酸硫铵素 22442

0.02mg 盐酸吡哆醇 0.50mg 生物素 0.02mg

烟酸 8.00mg 蒸馏水 1000mL 琼脂 20g pH5.5

设备:灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台等。

5、实验步骤

流程如下:

原始菌株?梯度稀释?平板分离单菌落?恒温培养20小时?倾倒显色培养基?避光培养2小时?选择浅色或白色的菌株接种保藏斜面

6、日程安排

第一天:培养基的配制灭菌，倒平板，静置过夜;

第二天:梯度稀释分离，恒温培养;

第三天:倾倒显色培养基，选择圈浅色或白色的菌株接种保藏斜面。 7、预期实验结果。

方案三 TTC-CaCO复合平板法用于丙酮酸盐菌株的筛选 3

1、实验目的:

设计出一种方案即能快速筛选到低副产物的菌株，又能高产丙酮酸的菌株。2、实验意义:

在发酵工厂中菌种复壮工作非常重要，但是工作量大，效率不高，因此选择一种省时省力的种筛选方法，在短时间内完成大量菌株的初筛，获得产酸多且副产物越少菌株，节约大量物料、能源及劳动力，对工业生产意义重大。 3、实验设计原理:

光滑球拟酵母在发酵培养基中可以发酵产生丙酮酸，此酸是一种强酸，能与CaCO反应，形成可溶性的丙酮酸钙，所以在发酵培养基中加入CaCO并制成固体33培养基平板，微生物生长过程中产生的酸就可以溶解CaCO，在菌落周围形成透3 明圈，由于菌是涂布上去的，形成的菌落均是由单细胞经同样时间发展而来，所以每个菌落里的菌数量上可以认为是一样的，既然每个菌落菌数相等，那么菌落周围的透明圈直径大小就可以表示该菌落菌株产酸能力的大小，同时TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)是一种显色剂，能与乙醇脱氢酶(ADH)作用使其失活，同时产生红色物质。在丙酮酸通向乙醇的代谢过程中，乙醇产量受此酶活性影响。产酒精能力强的酵母ADH活性强且与TTC作用呈深红色，次之显粉红色，微红色或不显色。用于发酵产丙酮酸的菌种在理论上应该是选择ADH酶活力较弱的，这样可以减少丙酮酸向乙醇的转化，发酵副产物少也有利于产品的分离提纯，因此白色或粉红色且透明圈大的菌株是我们的目的菌株。

4、实验材料及设备

上层显色培养基(TTC培养基):

葡萄糖5,，琼脂20,，TTC 0.5,，pH自然，加水至1000mL。

下层CaCO固体培养基: 3

Glc 40g (NH)SO 3g KHPO1g MgSO?7HO 0.5g 42424 42

ZnCl5mg CaCl 50mg FeSO 40mg CuSO 4mg MnCl 3mg 盐酸硫铵素 2 2442

0.02mg 盐酸吡哆醇 0.50mg

生物素 0.02mg 烟酸 8.00mg CaCO 5g 3

蒸馏水 1000mL 琼脂 20g pH5.5

设备:灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台等。

5、实验步骤

流程如下:

原始菌株?梯度稀释?CaCO平板分离单菌落?恒温培养20小时?倾倒显色3

培养基?避光培养2小时?选择圈大且浅色或白色的菌株接种保藏斜面 6、日程安排

第一天:培养基的配制灭菌，倒平板，静置过夜;

第二天:梯度稀释分离，恒温培养;

第三天:倾倒显色培养基，选择圈浅色或白色的菌株接种保藏斜面。 7、预期实验结果。

实验三丙酮酸盐的液体发酵及其工艺条件的优化

一实验目的

1. 掌握摇瓶发酵与摇瓶柜的使用

2. 掌握工业用发酵培养基的特点及配制方法

3. 熟悉发酵罐的使用及发酵过程的在线监测

二实验原理

(1)摇瓶发酵丙酮酸盐的原理

摇瓶培养法(shaking culture): 又称振荡培养法。在盛有液体培养基的振荡玻璃瓶中进行的一种发酵培养方法。适用于需氧性微生物。在室温下将无菌空气通入液体培养基中，使微生物能充分与氧气接触而迅速繁殖。

工业化的发酵一般都是在发酵罐中进行的，丙酮酸盐的摇瓶发酵是指光滑球拟酵母在三角瓶中进行发酵产生丙酮酸盐，摇瓶发酵是发酵的微缩形态，但是摇瓶发酵的控制参数，技术指标均对大规模的发酵具备积极的参考意义;工业发酵首先采取摇瓶发酵模拟以积累数据以及经验，然后对取得数据加以分析改进才能进入下一步的扩大实验，这样操作一方面可以使发酵更加具有方向性，另一方面也极大地节约了物料及能源。

(2)丙酮酸盐发酵的放大-丙酮酸盐在7L发酵罐中的发酵

丙酮酸盐发酵的放大是把摇瓶中进行科学实验所获得的结果在较大一级生产设备—7升发酵罐中予以再现的手段，它不是简单的等比例放大，而是以相似论的方法进行放大。发酵罐中的调控参数以摇瓶的数据为参考，但是也发生了许多变化，由于发酵设备自身的特点，发酵设备对发酵也有巨大的影响，所以发酵的放大，增加了许多摇瓶发酵所无法检测的参数，这就要求我们在掌握微生物生理特性的基础上，还要考虑到酵设备的特点，掌握设备的构造特点，掌握发酵过程中的参数监控与调节。

实验室自控发酵罐采用的是由美国NBS公司制造的BioFlo4000型自控发酵罐，为多用途生物反应器，适合微生物发酵及用于动物、植物和细胞规模化培养，整套系统适用于工艺研究和开发。控制器可控制16个过程回路，参数矫正，X-Y 轴趋向图表，级联控制，蒸汽消毒和报警等。可进行pH、转速、溶氧、液位、温度、蒸汽、排气和补料等测定。具有灵活、智能、直观、简便的特点。

发酵罐中的培养基条件较摇瓶培养基有所改变，主要是为了适应工业生产的需要，如葡萄糖采用工业级，pH调控也要根据发酵设备的改变而发生改变。

三实验材料与设备

1. 实验材料

氨水氢氧化钠碳酸钙种子培养基发酵培养基

2. 实验设备

无菌操作台卧式灭菌锅摇瓶柜 BioFlow4000型发酵罐空压机

四实验步骤

(1)摇瓶发酵步骤

第一日

1、于无菌工作台上用接种铲接种斜面里的光滑球拟酵母入种子摇瓶中，接种量一铲，大约每只斜面接种两个种子瓶;将瓶用通气塞束好;

2、将种子瓶放入摇瓶柜中，固定好，摇瓶培养;培养条件为200rpm，30?，培养时间20小时。

第二日

1、于无菌工作台接种种子瓶入发酵瓶，然后加入CaCO3，接种量每发酵瓶5mL 种子液。

2、将发酵瓶放入摇瓶柜中，固定好，摇瓶培养;培养条件为200rpm，30?，培养时间44小时。

第四/五日

测定发酵液中丙酮酸根的质量浓度以及残余的葡萄糖浓度;

硝酸铁标准曲线法测定发酵液中丙酮酸根的质量浓度:

发酵液离心后取上清，稀释10倍，试管中每1mL稀释液加水2mL，再加入

0.01mol/L硝酸铁溶液2mL，摇匀，于752型分光光度计上测定540nm下的OD

值，记为OD540。对照标准曲线，计算相应的丙酮酸根含量，记为CPYR。 DNS 试剂标准曲线法测定残余的葡萄糖浓度:

取2mL的样品液加入25mL容量瓶中，再加入1.5mL 3.5-二硝基水杨酸，沸水浴中加热5min，取出迅速冷却至室温，加蒸馏水定容至25mL，于波长540nm处测其吸光度值，对照标准曲线，计算残余糖浓度，记为CGLC。

(2) 丙酮酸盐发酵发酵罐发酵步骤

第一日

1、预备培养基及试剂，

所需培养基有:一级种子培养基，二级种子培养基

所需试剂有:5mol/L NaOH溶液、DNS试剂、硝酸铁试剂

2、培养基灭菌，条件与摇瓶发酵相同;

第二日

接种一级种子瓶(30mL装量)，30?培养16小时;

第三日

接种二级种子瓶(200mL装量)，接种量10%，30?培养24小时。第四日

1、配制发酵罐用发酵培养基

基本上同摇瓶用发酵培养基;不同之处在于葡萄糖采用工业级。

不用准备CaCO3控制pH，采用5mol/L NaOH调节;准备0.01%的消泡剂，并灭菌，条件121?，20min。

2、在配制培养基的同时，打开蒸汽发生器，加水冲洗蒸汽发生器水箱，排尽污水，然后加水至需要刻度，打开开关，加热，制备灭菌所需高温高压蒸汽。

3、发酵罐的拆装，洗涤，然后打开发酵罐电源;

4、pH电极的校正与使用: