生物化学(19.6)--作业基因重组与基因工程(附答案)

第十四章 基因重组与基因工程

名词解释

转化作用(transformation)

转导作用(transduction)

转座作用(transposition)

同源重组(homologous recombination)

限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)

基因工程(genetic engineering)

基因载体(vector)

基因组DNA文库(genomic DNA library)

质粒(plasmid)

启动子(promotor)

感受态细胞(competent cell)

黏性末端(sticky end)

问答题

1. 基因工程技术中的载体应该具备哪些基本条件?

2. 简述聚合酶链式反应(PCR)的基本过程，并举出应用实例。

3. 列表比较常见的工具酶及其功能。

3. 如何将重组DNA导人受体菌，目的为何?解释转化、转染及感染。

4. 简述基因工程过程。

5. 简述原核和真核表达体系各自的优、缺点。

参考答案：

名词解释

转化作用(transformation)

[答案] 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的方式。

转导作用(transduction)

[答案] 病毒从被感染的细胞释放出来，再次感染另一个细胞时，发生在供体细胞与体细胞间的DNA转移及基因重组的方式。

转座作用(transposition)

[答案] 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排。

同源重组(homologous recombination)

[答案] 是指两个DNA的同源序列之间进行单链或双链的交换。同源重组不需要特异的DNA 序列，而是依靠两个DNA分子之间序列的相同或相似就可进行的一种重组方式。

转座作用(transposition)

[答案] 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排。

限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)

[答案] 识别DNA的特异序列，并在识别位点或周围切割双链DNA的一类内切酶。

基因工程(genetic engineering)

[答案] 是指将不同的基因片段(DNA序列)按人们的设计而定向地连接起来，在受体细胞中与载体一起复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性。

基因载体(vector)

[答案] 为携带目的基因实现外源基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一类特殊DNA分子。

基因组DNA文库(genomic DNA library)

[答案] 利用限制性内切酶将细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后装入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，称为基因组DNA文库。

质粒(plasmid)

[答案] 存在于细菌染色体外的可自我复制的小型双链环状DNA分子。

启动子(promotor)

[答案] 指RNA聚合酶结合位点及周围的DNA序列，至少包括起始点及一个以上的机能组件。

感受态细胞(competent cell)

[答案] 经用低温CaCl2处理，使之易导人外源DNA分子的受体细胞。

黏性末端(sticky end)

[答案] 限制性核酸内切酶的识别和切割位点通常含4—个碱基对，并具有回文序列。由于大部分限制性核酸内切酶是错位切割其所识别的双链DNA，切割后产生的两个互补的单链DNA末端即为黏性末端。

简答题

基因工程技术中的载体应该具备哪些基本条件?

[答案] 载体应具备的基本条件是：①能够自主稳定复制；②分子上带有多克隆位点；③有遗传标记；④插入容量大；⑤分子量小、复制多；⑥安全。

简述聚合酶链式反应(PCR)的基本过程，并举出应用实例。

[答案] (1)PCR工作原理：以DNA分子为模板，以一对与模板序列相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的催化下，完成DNA的合成，并不断重复合成过程，使目的DNA 片段得到大量扩增。

(2)PCR的基本反应步骤：变性、退火、延伸，此三步为一个循环，一般进行30次循环。PCR反应可以用于基因工程和遗传病的检测等领域。

列表比较常见的工具酶及其功能。

如何将重组DNA导人受体菌，目的为何?解释转化、转染及感染。

[答案] 外源DNA(含目的DNA)与载体在体外连接成重组DNA分子(嵌合DNA)后，必须将其导入受体菌。随受体菌生长、繁殖，重组DNA分子得以复制、扩增，这一过程即为无性繁殖；筛选出的含目的DNA的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。进行无性繁殖时所采用的受体菌多为从大肠杆菌K—12所改造的安全宿主菌，在人的肠道几乎无存活率或存活率极低。除安全标准，所采用的宿主菌应为限制酶和重组酶缺陷型。

在选择适当的受体菌后，经特殊方法处理，使之成感受态细胞，即具备接受外源DNA 的能力。根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导人重组DNA分子有转化、转染和感染等不同方式。

简述基因工程过程。

[答案] (1)目的基因获取：体外操作DNA的主要步骤之一是提取载体DNA和所需要的外源目的基因。在细胞中DNA并非以游离态分子存在，而是和RNA及蛋白质结合在一起形成复合体，所以DNA需纯化。

(2)载体选择：外源DNA片段(目的基因)要进入受体细胞，必须有一个适当的运载工具将其带人细胞内，并载着外源DNA一起进行复制与表达，这种运载工具称为载体。载体必须具备下列条件：①在受体细胞中，载体可以独立地进行复制；②易于鉴定、筛选；③易于引入受体细胞。

(3)连接：外源DNA与载体DNA之间可以通过多种方式相连接，主要有以下几种：①黏性末端连接；②平头末端连接；③接头连接等。

(4)转化：任何外源DNA重组到载体上，然后转入受体细胞中复制繁殖，这一过程称为DNA的克隆。外源DNA进入受体细胞并使它获得新遗传特性的过程称为转化。转化作用是将外源DNA引入细胞的过程。

(5)筛选：由于细胞转化的效率较低，所以从大量的宿主细胞中筛选出带有重组体的细胞并不是很容易的。当前，在实验室中，常用的筛选手段有以下几种：①插入失活；②菌落原位杂交；③免疫学方法。

(6)表达：导人的外源基因利用宿主的遗传信息表达系统复制、转录，表达有活性的目的蛋

简述原核和真核表达体系各自的优、缺点。

[答案] 原核表达体系如E. coli是当前采用最多的原核表达体系，其优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺；缺点是只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA；表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰；表达的蛋白质常常形成不溶合性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理；在E. coli表达体系不易获得大量的可溶合性蛋白质。

真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物表达体系，不仅可表达克隆的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；哺乳类动物细胞表达的蛋白质通常总是被适当修饰，因此表达产物直接就有功能。其缺点是操作技术难、费时、不经济。