Nuptec实验技术手册(蛋白方面)
实验一蛋白是否表达
1.1 实验步骤和所需时间
实验步骤所需时间
1、用15ml 离心管取5 ml LB培养基，加相应抗性，挑取4个转化子37℃过夜活化。
5-16h
工作时间或过夜
2、用15ml 离心管取5 ml LB培养基，加相应抗性，接种过夜活化的菌
液50ul，37℃摇菌至菌液OD600为0.8，加IPTG至最终浓度0.1mM诱
导4h。
8h
3、取40μl菌液于1.5ml EP管中加入20μl 3 × loading buffer，煮沸。 1h
4、将煮沸后样品跑SDS-PAGE胶，每个孔上样量10-20ul。若目的蛋白
分子量≥15KD，用浓度12%的SDS-PAGE胶；若目的蛋白分子量＜15KD，
用浓度15%的SDS-PAGE胶。
3h
5、SDS-PAGE胶用染色液染色30min。 0.5h
6、SDS-PAGE胶用脱色液脱色1h。 1h
7、将脱色好的SDS-PAGE胶拍照保存，分析结果。 10min
8、挑取表达量最高的转化子，保存甘油菌（800ul菌液加200ul 75%甘油）。总共时间：2-3天
1.2实验所需材料配方
LB培养基（+抗生素）：LB配方如下（1L），蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g。
IPTG：母液浓度为1mol/L。
SDS-PAGE相关试剂：
30 % 丙烯酰胺贮存液
称取29 g丙烯酰胺，1 g N-N’甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水溶解定容至100 ml（约加65ml），
过滤后装入棕色瓶中4 ℃保存；
1.5 M Tris-Cl (pH 8.8)
18.17 g Tris溶于90 ml去离子水，用浓盐酸调pH至8.8，定容至100 ml，4 ℃保存；
1 M Tris-Cl (pH 6.8)
12.1 g Tris溶于90 ml去离子水，用浓盐酸调pH至6.8，定容至100 ml，4℃保存；
10 %(w/v) 过硫酸铵(AP)
0.1g加入1.5mlEP管中，加水1ml溶解，4℃可保存两周。
10 %(w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）
称取100 g SDS溶于900 ml的无菌去离子水中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，用水
定容至1L。
3×loading buffer
2.5ml 1M Tris-HCl(pH6.8 同浓缩胶)、2mg溴酚蓝、2ml 10%SDS、4ml甘油，加水溶解
并稀释至10ml，此溶液用于非还原型SDS-PAGE，如用于还原型SDS-PAGE，则1ml再加
0.2ml β-巯基乙醇。
10×电泳缓冲液
30g Tris, 144g Glycine, 10g SDS, pH8.3
考马斯亮蓝染色液(1L)
考马斯亮蓝R-250 0.1 g
异丙醇250 ml
蒸馏水650 ml
冰醋酸100
ml
过滤，室温保存。
脱色液(1L)
乙醇50 ml
冰醋酸100 ml
蒸馏水700 ml
实验二蛋白表达在上清还是包涵体中
2.1 实验步骤和所需时间
实验步骤所需时间
1、配置50 ml LB培养基4瓶，121℃灭菌20min。 2h
2、用15ml 离心管取5 ml LB培养基，加相应抗性，接种保存好的甘油
菌50ul，37℃过夜活化。
12h
3、接种500ul活化菌液至50ml 培养基中。
37℃摇菌至菌液OD600为0.8之后，分别按下列条件诱导：
加IPTG至最终浓度0.2mM 37℃诱导4h。
加IPTG至最终浓度0.02mM 37℃诱导4h。
加IPTG至最终浓度0.2mM 16℃诱导16h。
加IPTG至最终浓度0.02mM 16℃诱导16h。
16h
4、取50ml 白色离心管，每次收集菌液25ml，分两次收集完毕。高速冷
冻离心机5000rpm离心5min收集菌体，然后40ml 10mM PBS洗涤菌体
两次，最后用20ml 10mM PBS悬浮菌体后超声破碎。超声条件为超声
3s，间隔7s，100次。
2h
5、高速冷冻离心机12000rpm离心破碎后的菌体，10min。分上清和包涵
体，包涵体用20ml 10mM PBS重新悬浮，然后上清和包涵体各取40ul，
加3×蛋白上样buffer 20ul，煮沸。
2h
6、将煮沸后样品跑SDS-PAGE胶，每个孔上样量20ul。若目的蛋白分
子量≥15KD，用浓度12%的SDS-PAGE胶；若目的蛋白分子量＜15KD，
用浓度15%的SDS-PAGE胶。
3h
7、SDS-PAGE胶用染色液染色30min。 0.5h
8、SDS-PAGE胶用脱色液脱色1h。 1h
9、将脱色好的SDS-PAGE胶拍照保存，分析结果。总共2-3天
2.2 实验所需材料同1.2中描述。
注：可以与实验一一起做，能缩短时间。
实验三镍柱纯化上清中目的蛋白（5d）
3.1 实验步骤和所需时间
实验步骤所需时间
1、配置2瓶500mL LB培养基，121℃灭菌20min。2h
2、用15ml 离心管取5 ml LB培养基，加相应抗性，
接种保存好的甘油菌50ul，37℃过夜活化2管。
12h
3、接种5ml活化菌液至500ml 培养基中。37℃摇菌
至菌液OD600为0.8之后，按照实验二中最优条件诱导。4h或者16h（根据实验二中条件）
4、取50ml 白色离心管10管，每管收集菌液100ml，分三次收集完毕。高速冷冻离心机5000rpm离心5min
收集菌体，然后每管用40ml 10mM PBS洗涤菌体两次，最后用40ml 10mM PBS悬浮菌体后超声破碎。超声条件为超声3s，间隔7s，100次。离菌时间：1h 破碎时间：5h
准备上清样品
5、高速冷冻离心机12000rpm离心破碎后的菌体，10min。上清用0.45um滤膜抽滤，抽滤后的样品准备上样。
1h
准备上清样品共需1-2天
1、镍琼脂糖凝胶 FF装针管柱（先堵住柱子，加水
至一半体积，然后用移液器吸取填料加入，等待让填
料自然沉降即可），柱床体积为 5ml。
0.5h
2、用缓冲液 1 平衡5 个柱床体积，流速为 2ml/min。5min
3、将 20ml上述抽滤后的样品上样，流速为 1ml/min。20min
4、用缓冲液 1 再洗 5 个床体积，流速为 2ml/min。5min
5、用分别含 10、20、50、100、200、300、400mM 咪
唑的缓冲液 3 进行梯度洗脱，每次洗脱5个柱床体
积，流速为 2ml/min，收集梯度洗脱液，每个样品取40ul，加3×蛋白上样buffer 20ul，煮沸后同时取20ul 进行 SDS-PAGE验证检测洗脱蛋白的分子量大小和纯度。
洗脱共40min SDS-PAGE 5.5h
摸索镍柱纯化上
清目的蛋白的条
件
6、用纯水流洗 5 个柱床体积，流速为 2ml/min。纯
化同样蛋白，镍柱用3次后需再生；纯化不同蛋白，镍柱用1次后需再生。摸索纯化条件共所需时间1天
1、用缓冲液 1 平衡5 个柱床体积，流速为 2ml/min。10min
2、将200ml上述抽滤后的样品上样，流速为 1ml/min。3h
3、用缓冲液 1 再洗 5 个床体积，流速为 2ml/min。10min
4、按照摸索好的条件用含咪唑缓冲液3洗脱目的蛋
白，收集洗脱液，每个样品取40ul，加3×蛋白上样buffer 20ul，煮沸后同时取20ul进行 SDS-PAGE验证检测洗脱蛋白的分子量大小和纯度。
洗脱10min SDS-PAGE 4.5h
大规模纯化目的
蛋白
5、用纯水流洗 5 个柱床体积，流速为 2ml/min。纯
化同样蛋白，镍柱用3次后需再生；纯化不同蛋白，镍柱用1次后需再生。纯化目的蛋白所需时间1天
1、洗脱后的目的蛋白用不少于10倍体积的PBS透析
去除咪唑。
12h
2、去除咪唑后的蛋白样品分别用Bradford和BCA方法测浓度。2h
目的蛋白的后续
处理
3、根据需要选择合适的条件浓缩蛋白（冷冻干燥、
PEG吸水、超滤浓缩）
2-48h不等
备注1：在位清洗
１、除去因离子交换作用吸附的蛋白，用 2-3倍柱床体积 2M 的NaCl 溶液淋洗柱子，或者将填料取出放于溶液中，再次填装填料。
2、除去强的疏水性蛋白和脂质等，用 4 倍柱床体积的 70%的乙醇或者 30%的异丙醇洗柱子，或者将填料取出放于溶液中，再次填装填料。
备注2：凝胶的再生
1、用100mM EDTA，5倍柱床体积去除填料中的镍离子。
2、用 1M 的 NaOH 以 2ml/min流速淋洗柱子。
2、加水将柱子洗干净后，直接加入50mM硫酸镍溶液 10ml，重生柱子。
备注3：保存在 20%乙醇中，4℃下长期保存。
3.2实验所需材料：
缓冲液1：50mM pH7.4 的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g, 加适量水溶解后定容到 1000ml。
缓冲液2： 50mM磷酸盐缓冲液， pH7.4，即pH7.4 的PBS溶液。配制： 0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑 34g, 加适量，水调pH后定容
到 1000ml。
缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液 B 配制：
咪唑浓度缓冲液 1 量(ml) 缓冲液 2 量(ml)
10 mM 98 2
20 mM 96 4
50 mM 90 10
100 mM 80 20
200 mM 60 40
300mM 40 60
400 mM 20 80
实验四镍柱纯化包涵体中目的蛋白
4.1 实验步骤和所需时间
实验步骤所需时间
1、取实验二中包涵体溶液1ml，冷冻离心机12000rpm
离心5min去除上清PBS。
5min
2、用1ml 含1M尿素的10mM PBS吹洗沉淀，放置10min后，再次12000rpm离心5min离心，取上清40ul 用于SDS-PAGE。10min
尿素梯度洗脱包涵体
3、沉淀再次用1ml含2M尿素的10mM PBS吹洗，依次增加尿素浓度3M，4M，6M，8M，取每次洗涤的上清40ul用于SDS-PAGE，以确定包涵体溶于几M尿素中最彻底。洗涤包涵体1h SDS-PAGE
5.5h
准备包涵体样品样品准备同实验三中步骤，只是最后离心保留包涵体，
并将包涵体用所确定的几M尿素溶解。
共需2天
摸索包涵体纯化条件实验步骤同实验三中步骤，只是溶液配方中均添加8M
尿素。
共需1天
大规模纯化目的蛋白实验步骤同实验三中步骤，只是溶液配方中均添加8M
尿素。
共需1天1、洗脱后的目的蛋白用不少于10倍体积的含尿素PBS
梯度透析去除咪唑。由8M-6M-4M-2M-1M-0M，每个尿
素梯度透析不少于6h
3天
目的蛋白后续处2、去除咪唑后的蛋白样品分别用Bradford和BCA方法2h
理
测浓度。
2-48h不等
3、根据需要选择合适的条件浓缩蛋白（冷冻干燥、PEG
吸水、超滤浓缩）
4.2实验所需材料
缓冲液1：50mM pH7.4 的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g 和脲 480 g，加热溶解后定容到 1000ml。
缓冲液2： 50mM磷酸盐缓冲液， pH7.4，即pH7.4 的PBS溶液。配制： 0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml， NaCl 29.3g，咪唑34g和脲480 g，加热溶解后
定容到1000ml。
缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液 B 配制：
咪唑浓度缓冲液 1 量(ml) 缓冲液 2 量(ml)
10 mM 98 2
20 mM 96 4
50 mM 90 10
100 mM 80 20
200 mM 60 40
300mM 40 60
400 mM 20 80
实验五 Bradford蛋白浓度的测定
5.1 实验步骤和所需时间
1、从冰箱取出Bradford工作液，平衡至室温并混匀。
2、取配置好浓度的各标准BSA。
3、标准曲线绘制。取8个玻璃试管分别编号为A-H，按以下表格数据加入试剂：
各标准蛋白浓度（mg/ml）00.20.40.8 1.2 1.6 2.0各蛋白标准（ul）50 50 50 50 50 50 50
去离子水（ul）50 50 50 50 50 50 50 Bradford工作液（ml） 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9
对应的蛋白浓度（ug/ml）0 5 10 20 30 40 50 最终体积 2.0ml
4、振荡混匀后，室温放置 5-10 分钟。
5、用分光光度计测定595nm处的吸光值，以不含BSA 的光吸收值为空白对照。
6、以蛋白含量（μg/ml）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
7、样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取50μl 样品，加入
1.9ml Bradford 工作液和50μl 的去离子水，混匀后放置5-10 分钟，然后以A号比色皿为对照，测定样品吸收值A595。
8、根据测得的吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。
9、计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量除以样品体积50μl，再乘以相应的稀释倍数即可得
到待测样品的实际浓度。
5.2 实验材料
标准蛋白溶液：用标准BSA配制成0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2mg/ml溶液.
Bradford 工作液：取100mg 考马斯亮蓝G250染料，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1L 。 5.3所需时间 2小时
实验六 蛋白A 柱纯化抗血清
6.1实验步骤和所需时间
实验步骤
所需时间 1、重组蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 装针管柱（先堵住柱子，加水至一半体积，然后用移液器吸取填料加入，等待让填料自然沉降即可），柱床体积为10ml 。 0.5h 2、 用缓冲液 A 平衡 5 个柱床体积，流速为 1ml/min 。 1h 3、 将 10ml 抗血清用缓冲液 A 稀释到100ml ， 0.45μm 滤膜抽滤后上样。流速为 1ml/min 。
2h
4、 用缓冲液 A 再洗 5个柱床体积，流速为 1ml/min 。 1h
5、 用pH 6.0缓冲液 B 洗脱杂蛋白，洗 5个柱床体积，流速为 1ml/min 。
1h 6、用pH 3.0缓冲液 B 洗脱目的蛋白，洗 5个柱床体积，流速为 1ml/min ，用蛋白检测仪检测，收集洗脱峰。洗脱样品用1M Tris 中和酸，用pH 试纸将样品pH 值调至7.4。 1h 7、 用纯水流洗 10 个柱床体积，再用 20%的乙醇流洗 10 个柱床体积，流速为 2ml/min ，将柱子置于+4~8℃环境中保存。 1h
第一次纯化抗血清中IgG （大部分IgG 被纯化出）
8、 将pH 3.0 缓冲液洗脱的IgG 样品，取80ul ，加5×蛋白上样buffer 20ul ，煮沸后同时取20ul 进行 SDS-PAGE 验证分子量大小和纯度。
SDS-PAGE 5.5h
第二次纯化抗血清中IgG （剩余部分IgG 被纯化出） 1、将步骤3-8重复一次，用pH 3.0缓冲液 B 洗脱目的蛋白，若蛋白检测仪2A 值＜15，可不用重复第三次；若蛋白检测仪2A 值≥15，需要重复步骤3-8第三次以将抗血清中的IgG 全部纯化出。
时间同上 1、洗脱后的目的蛋白含有Tris 和柠檬酸，需用不少于10倍体积10mM PBS 透析去除。
12h 2、去除Tris 和柠檬酸后的IgG 分别用Bradford 和BCA 方法测浓度。
2h
纯化出的IgG 后续处理
3、根据需要选择合适的条件浓缩蛋白（冷冻干燥、PEG 吸水、超滤浓缩）
2-48h 不等备注：柱子每使用5次后应该用以缓冲液 C 流洗 3 个柱床体积，以便将吸附更牢的蛋 白去除，然后再用纯水流洗 10 个柱床体积，再用 20%的乙醇流洗 10 个柱床体积，流速 为 2ml/min ，柱子置于+4~8℃环境中保存。 6.2实验所用到的材料： 缓冲液A ： 20 mM 磷酸盐缓冲液， pH7.4， 即pH7.4 的PBS 溶液。 配制： 0.2 M NaH2PO4
19ml ，0.2 M Na2HPO4 81ml ，NaCl 9g 加水至 1000ml 。
缓冲液 B ：100mM 柠檬酸缓冲液，pH4.0。配制：柠檬酸 21g 加水950ml ，用 5M NaOH
调至 pH 4.0，加水至 1000ml 。
缓冲液C：0.5M 醋酸缓冲液，pH3.0。配制：0.5M醋酸溶液用固体 NaOH 调至 pH 3.0。缓冲液D：1M Tris-HCl 缓冲液，pH9.0。配制：Tris 盐 121.14g，加水至 950ml，浓盐酸调 pH至 9.0，加水至 1000ml。
实验七用蛋白活化NHS琼脂糖凝胶
7.1 实验步骤和所需时间（以偶联抗体为例）
实验步骤所需时间1、取 100mg IgG加 pH8.0 0.2M 碳酸钠缓冲液 10ml 溶解，留 80ul以便测
定偶联效率。1h
2、取 1gNHS 活化琼脂糖凝胶(溶胀后 5ml)加到上面溶液中，4 度，震荡反
应 16 小时。16h 3、用水洗干净填料得到偶联抗体的填料，然后用 10mM 乙醇胺，pH8.0，0.2M
16h
碳酸钠缓冲液 20ml,室温震荡 4 小时或者过夜封闭未偶联的基团.洗干净即
可。
备注
1、活化的填料现取现用，免时间过长造成活性降低。-20度密封保存，这样可以存放 2 年。如果要偶联的蛋白不稳定，可在摇床上4℃振摇偶联 16-24 小时，以维持配基的活性。如果是偶联小分子的物质可以室温反应，pH和温度可以适当提高，这样会得到更高的偶联
效果。如果配基的稳定性不了解，可以用配基配相应浓度的溶液 0.5-1ml，分别选择不同 pH 及温度然后不加填料模拟偶联条件，观察溶液是否有沉淀，有沉淀偶联效果就不好，可
以稍微降低 pH或温度，同时可以加 5%左右的甘油或 PEG保护蛋白，避免沉淀，总之对于任何配基最好能了解其溶解性及稳定性，避免实验失败导致损失。
2、此填料只能用于带氨基的物质，因为反应效率高而且温和，特别适合偶联大分子物质如抗体等。
3、偶联配基后尽快清洗填料，避免在高 pH条件中，配基失活。
4、更稳定的配基可以直接溶解于 0.2M 碳酸氢钠或 pH10 的碳酸钠缓冲液中进行偶联，温度可适当提高，偶联时间则相应缩短至 6-12 小时。
5、偶联蛋白的最适 pH为可以在 7.5-8.0左右，在室温或4℃均可，温度提高能增加配基的偶联效率，根据蛋白的稳定选择合适的 pH和温度，偶联蛋白溶液的浓度为 5-15mg/ml。填料体积和配基溶液的体积为1：1.5 或者为1：2。
6、偶联的缓冲液包括碳酸盐、硼酸盐和磷酸盐缓冲液，但绝对不能使用氨基的缓冲体系或者如 Tris-HCl 缓冲液。
7、在偶联中可以用磁力搅拌器或者别的机械搅拌，但是需要速度慢些，只要把填料能混匀完全悬浮起来即可，避免剧烈搅拌使填料有小颗粒降低流速。
8、NHS活化琼脂糖凝胶 FF 在-20 度长期保存。
7.2实验所用到的材料
pH8.0 0.2M 碳酸钠缓冲液
10mM 乙醇胺
实验八 western blot
8.1实验步骤和所需时间（以一块胶的量为准）
实验步骤
所需时间 SDS-PAGE 1、取合适量的总蛋白（25ug ）或者目的蛋白（0.5ug ）进行
SDS-PAGE 电泳。 5.5h 2、剪下所需大小的PVDF 膜（比一块胶长宽多1毫米），浸入
100% 甲醇中15-20 s ，将膜转入20ml 去离子水中5 min ，然后将膜转入20ml 转移缓冲液中至少5 min ；同时也将凝胶浸入转移缓冲液中。 转膜 3、在电转仪上负极依次铺上三层滤纸（比一块胶长宽少1毫米）、
PVDF 膜、凝胶、滤纸，用玻璃棒赶去气泡，以200 mA 的恒定电流转印1.5 h 。 2h
4、取出转印好的膜，放入20ml TBS 中轻轻摇动室温洗膜10 min 。 封闭
5、倾去TBS ，加20ml 封闭液4 ℃静置过夜。
16h 一抗孵育 6、将膜浸入20ml 含一抗抗体的封闭液中，室温轻摇2 h 。 2h
7、将膜放入20ml 洗涤液中轻轻摇动洗膜3次，每次10 min 。
二抗孵育 8、将膜转入20ml 含羊抗兔二抗-HRP 的洗涤液中，室温轻摇2 h 。 3h 9、将膜放入20ml 洗涤液中轻轻摇动洗膜3次， 每次10 min 。 10、将膜转入20ml TBS 中，轻摇洗膜2次，每次5 min ，再用去离子水漂洗。
11、放入10ml DAB 显色液中避光显色15 min 。
显色和终止
12、待条带显示出用20ml 双蒸水终止反应。
1h 8.2 实验所需材料
转膜液：25mM Tris ，192 mM 甘氨酸，20%（V/V ）甲醇，pH8.3； TBS ：20 mM Tris-HCL ，500 mM NaCl （pH7.5）； 封闭液：脱脂奶粉溶于TBS 中至终浓度5%； 洗涤液（TBST ）：含0.5％Tween-20的TBS ；
一抗溶液：一抗抗体用TBS 按适当比稀释，根据说明书上作适当调整； 二抗溶液（羊抗兔IgG-HRP 抗体）：羊抗兔IgG-HRP 抗体用TBS 按适当比稀释，根据说明书做适当调整。
DAB 溶液：溶解50mgDAB 于100ml TBS 溶液中。再加100ul 3%过氧化氢，立即使用。
实验九硫酸铵盐析浓缩纯化蛋白质
9.1原理
水溶液中的蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围内（0.15~0.2mol/kg ）最大，而低于或高于此范围是溶解度均降低。向蛋白质的水溶液逐渐加入电解质时，开始阶段蛋白质的活度系数降低，并且蛋白质吸附盐离子后，带电表层使蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却越强，因而蛋白质的溶解度增大，这种现象称为盐溶。随着离子强度的增大，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥，而且盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出疏水区域，从而增大蛋白质表面疏水区之间的疏水作用，容易发生凝集，产生沉淀，这就是盐析的原理。
硫酸铵价格便宜、溶解度大、溶解度随温度变化小、溶解吸热等特点，并且具有稳定蛋白质的作用，因此是最常用的盐析盐。硫酸铵的添加方式主要有两种，1、向溶液中加固体硫酸铵：这种添加方式形成的沉淀颗粒较细，硫酸铵用量少，但要分次缓慢添加避免局部浓度过高产生沉淀，常用于较大规模的纯化；2、与饱和硫酸铵兑比：这种方式形成的沉淀颗
粒较大，但硫酸铵用量大，体积变化大，主要用于小规模的盐析。本次采用加固体硫酸铵的方式盐析。
9.2 主要试剂与仪器
(NH 4)2SO 4，BaCl 2，离心管，离心机，电子天平，冰箱 9.3 操作流程 操作步骤
时间 1.取适当稀释的细胞破碎上清液（蛋白含量0.2~1.5mg/mL ）180mL ，用0.45μm 过滤，分装到9个50mL 离心管，每管20mL ，冰箱保存。
1h
2.取适量硫酸铵固体，用研钵研磨成细粉，分别称取1.12g 、2.28g 、
3.52g 、
4.86g 、6.26g 、7.80g 、9.44g 、11.22g 和13.24g ，缓慢加入到上述离心管中，充分溶解，使各管的硫酸铵浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，作好标记，放入冰箱静置4h 以上或过夜。
≥6h 或过夜 3.上述样品取出用蒸馏水作平衡（切忌向盐析管中加蒸馏水），离心12000rpm ，10min ，上清保存，沉淀用10mL 10mM pH7.4 磷酸缓冲液溶解，保存。
1h
4.SDS-PAGE 分析盐析结果，参考结果，选择合适的浓度做分级盐析 （取100ul ，加5×上样buffer 25ul ，煮沸后同时取20ul 进行 SDS-PAGE 验证）。 1天
5.以SOD t2为例，30%除杂蛋白，70%盐析目的蛋白，取适当稀释的上清100mL ，加入17.6mL 硫酸铵细粉（研磨）使浓度达到30%，充分溶解后，冰箱静置4h 以上。
≥5h
6.取出盐析溶液离心12000rpm ，10min ，如果离心难以分离，可以用滤纸过滤。弃沉淀保留上清，上清中继续加硫酸铵细粉29.60g 至浓度70%（若体积损失较大，按附表添加硫酸铵），调节pH 至pI 值左右，冰箱静置4h 以上。
≥5h
7.取出溶液离心12000rpm ，10min ，弃上清，沉淀用50mL 10mM pH7.4 磷酸缓冲液溶解，取100ul 做SDS-PAGE ，其余用透析袋透析（可根据后续处理需要选择缓冲液），8h 更换一次透析液，用氯化钡溶液鉴定硫酸铵是否透析完毕。 1~2天 附：硫酸饱和度表和温度影响表
调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）
在 25℃ 硫 酸 铵 终 浓 度 ，% 饱 和 度
10 20 25 30 33 354045505560657075 80 90 100每 1000ml 溶 液 加 固 体 硫 酸 铵 的 克 数
0 56 114 144 176 196 209243277313351390430472516 561 662 76710 57 86 118 137 150183216251288326365406449 494 592 69420 29 59 78 91123155189225262300340382 424 520 61925 30 49 6193125158193230267307348 390 485 583
30 19 30
6294127162198235273314 356 449 54633 12
4374107142177214252292 333 426 52235 31
6394129164200238278 319 411 50640 31
6397132168205245 285 375 46945 32
6599134171210 250 339 43150 33
66101137176 214 302 392硫 酸 铵 初 浓 度 ， ％ 饱
和 度
55
33
67103141 179 264 353
60 3469105 143 227 314
190
275
107
65 3470
153
237
72
70 35
198
115
75 36
157
80 77
90 79
实验十离子交换柱层析纯化蛋白质
10.1、原理
离子交换法提取生化物质是采用人工合成的离子交换树脂或多糖类交换剂作为吸着剂，
利用库仑静电引力将生化物质选择性地吸着到交换剂上，然后，在适宜的条件下洗脱，达到
分离提纯的目的。离子交换树脂在抗生素、有机酸、氨基酸、核苷酸等小分子的回收和提纯
中广泛应用，但是由于其疏水性高、交联度大、孔隙小、电荷密度大等特点，不太适合应用
于蛋白质之类的生物大分子的分离纯化。多糖类交换剂具有很高的亲水性和较大的孔径，使
蛋白质能保持较好的稳定性，并且容易进入交换剂内部，提高交换容量，减少非特异性吸附。
阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。
待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进
行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结
合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗
脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负
电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负
电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这
样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分
离目的。
蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大
关系。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下，等电点pI 负电，不能与阳离子交换剂结合；等电点pI>pH的蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合， 一般pI越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响， 一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索。 10.2、主要试剂与仪器 NaCl，NaOH，HCl，AgNO3，蠕动泵，层析柱，核酸蛋白检测器，记录仪，部分收集器。 10.3、操作流程 步骤操作说明时间 3h 1、装柱空柱子（1.0cm*20cm）用蒸馏水洗干净后，加少量蒸馏水，让其 流出至液面高约2cm，关闭流出，用剪去尖头的1mL移液器加入 调和的DEAE凝胶悬液至适当高，自然沉降1h；打开流出，添加 蒸馏水将柱壁上粘附的凝胶洗下，添加蒸馏水时应避免将凝胶冲 起，保持凝胶面水平、凝胶层内不能有气泡。蒸馏水自然流速清 洗>5个体积后，关闭流出，冰箱静置过夜，备用。 2、缓冲液平衡次日，装好的柱子（填料1.0cm*10cm）用20mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液平衡，流速1mL/min，至流出液与初始相同，约1h。 1h 2、上样 30mL细胞破碎上清的样品（以SOD t2为例）用0.1M NaOH调 节pH至8.0，15000rpm离心10min，0.45μm膜过滤后用泵上样， 1mL/min；样品上完后，用20mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液平衡至 流出液的280nm与初始相似。 1h 3、线性洗脱梯度混合器浓缩杯装200mL 含20mM pH8.0 Tris-HCl和1.0M NaCl溶液，混合杯装200mL 20mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液，磁力 搅拌混合；出口接蠕动泵-柱子-检测仪-收集器，洗脱流速约 1.5mL/min，收集5min/管，走纸记录6cm/h。 4.5h 4、再生洗脱（1）用含缓冲液的1.5M NaCl洗柱再生，1.5mL/min，约0.5h， 再用缓冲液清洗0.5h。 （2）如果柱子使用多次可用含0.5M NaOH 0.5M NaCl溶液清洗 0.5h，再用含缓冲液的1M NaCl清洗至pH流出与流入一样，最 后用缓冲液清洗0.5h。1h或2h 5、柱子保存如果柱子两天内不再使用，用20%乙醇清洗柱子0.5h，4℃冰箱保 存。 0.5h 6、凝胶保存长期不用的柱子用20%乙醇清洗后将凝胶取出，闭光密封，4℃冰 箱湿态保存。 0.5h 7、样品检测根据记录选择峰值处样品进行SDS-PAGE检测，含目的蛋白且纯 度较为满意的收集管合并，透析除去NaCl，透析外液取少量于试 管中，滴加2~3滴0.5% AgNO3溶液，定性检测透析程度，透析 4h以上未出现白色沉淀可认为氯离子除完，透析完毕。取样 SDS-PAGE检测，判断透析结果，蛋白是否降解、渗出。 2天 实验十一阳离子交换层析纯化SOD t2 11.1 实验步骤和所需时间 实验步骤所需时间1、样品准备：1L发酵液离心后，菌体用缓冲液A清洗一次，再用240mL缓 冲液A悬浮后超声破碎，破碎后15000rpm离心10min取上清，用缓冲液A稀 释至蛋白含量为1mg/mL，用0.45μm过滤后即为上柱样品。 2天 2、装柱：空柱(1.6cm×30cm)用蒸馏水洗干净后，柱下端流出口用注射器向柱 内注入加少量蒸馏水，排除死体积的空气，关闭流出口；缓慢加入调和成匀浆 状的CM琼脂糖凝胶，自然沉降1h；用蒸馏水清洗5个体积后，用缓冲液A3h 平衡至流出液pH为5.1，关闭流出口，填料1.6cm×12cm（25mL），准备上样。 3、上样：上述样品上样200mL，流速1.5mL/min，用缓冲液A平衡至洗出液 A280nm与上样前一致。 3h 4、线性梯度洗脱：浓缩杯装200mL 含0.6M NaCl的缓冲液A，混合杯装200mL 含0.1M NaCl的缓冲液A；洗脱流速2.0mL/min，收集5min/管。 2h 5、再生洗脱：用含1.5M NaCl的缓冲液A再生洗脱30min，流速2.0mL/min； 使用超过3次需用含1M NaCl的0.5M NaOH再生洗脱30min。再生后用缓冲 液A平衡1h，NaOH再生需测定洗出pH至5.1。 4h 6、保存：2天内不再使用的柱子用20%乙醇洗柱1h，4℃保存。长期不用的填 料需取出用20%乙醇湿态保存。1h 7、检测与分析：取有紫外吸收的样品作SDS-PAGE检测，根据纯度和浓度合 并收集的溶液，用20mM pH7.4 磷酸缓冲液作外液透析除掉NaCl，取5mL透析外液滴加2~3滴0.5% AgNO3，无明显白色沉淀即可停止透析。透析后的样品和上柱前的样品作蛋白浓度和活性测定，计算收率。SDS-PAGE 5.5h 透析 12h 11.2 所需材料 缓冲液A：20mM pH5.1醋酸钠缓冲液。 20%乙醇。 CM-Sepharose F.F.阳离子交换填料。 缓冲液B：20mM pH7.4磷酸缓冲液。 实验十二分子筛凝胶过滤层析 12.1 实验步骤和所需时间 实验步骤所需时间1、样品准备：离子交换并透析后的样品用超滤浓缩（或PEG浓缩）至蛋白浓 度为2~5mg/mL，120000rpm离心10min。 2天 2、装柱：Sephadex G-75凝胶称取13.4g，加入到蒸馏水中充分溶胀（2~3天）， 调和成匀浆状。空柱（1.6cm×100cm）下端流出口用注射器向柱内注入加少量 蒸馏水，排除死体积的空气，关闭流出口；缓慢加入调和成匀浆状的凝胶，自 然沉降过夜。保证流出口始终不低于柱床高度的75%，用蒸馏水0.5mL/min洗 3个柱体积后用缓冲液B洗5个柱体积，柱床高度80cm，柱体积160mL，准 备上样。 1天 3、上样与洗脱：将柱子中的缓冲液放出至与凝胶面水平，再缓慢加入样品5mL， 保持凝胶面水平，切勿将凝胶冲起。待样品全部进入凝胶层后用缓冲液B清洗 柱子并收集，流速0.5mL/min，收集10min/管。 2-3天 4、保存：用完的柱子用蒸馏水洗5个柱体积，再用0.04% NaN3溶液洗3个柱 体积，4℃保存。长期不用取出保存于20%乙醇。 2h 5、检测：取有紫外吸收的样品作SDS-PAGE检测，根据纯度和浓度合并收集 的溶液。并超滤浓缩至1mg/mL。 2天 12.2 材料 Sephadex G-75 缓冲液B：20mM pH7.4磷酸缓冲液。 实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析实验材料：牛奶 小组成员： 实验时间： 一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析 二：报告撰写者 三、小组成员 实验仪器 温度计、布氏漏斗（*）、pH试纸（*）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（*）、电子天平（*）、2个1000ml的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm×8cm 厚度120nm）成品（*）、培养皿9—10cm（*）、毛细管（*）、尺子、铅笔、单面刀片（*）、镊子、普通滤纸（*）、电泳槽、玻璃板8cm ×12cm（*）、752型分光光度计（*）、细布（*）、、、的移液管、试管、试管架、 四、实验材料 牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典） 五、实验试剂 特仑苏400ml、金典200ml、巴比妥（*）、巴比妥钠（*）、氨基黑10B（*）、50ml甲醇AR（*）、100ml冰醋酸AR（*）、95%的乙醇250ml（*)、95%的乙醚100ml（*）、L的乙酸100ml（*）、L的乙酸钠100ml（*）、25g氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg五水硫酸铜（*）、60mg酒石酸钾钠（*）所需试剂配制方法： 乙醇乙醚混合液的配制： 10ml95%的乙醇 10ml95%的乙醚 乙醇钠缓冲液的配制： 配制乙醇乙醚1:1的混 L 的乙酸51ml L 的乙酸钠49ml 巴比妥钠缓冲液的配制： 巴比妥 巴比妥钠 染色液的配制： 氨基黑10B 50ml 甲醇AR 10ml 冰醋酸AR 漂洗液的配制： 45ml95%乙醇AR 5ml 冰醋酸AR 蒸馏水 透明液的配制： 25ml 的冰醋酸AR 75ml 的无水乙醇AR L 氢氧化钠溶液的配制： 16g 的氢氧化钠固体定容至1000ml 10%氢氧化钠溶液的配制： 5g 的氢氧化钠固体定容至50ml 双缩脲试剂的配制： 15mg 五水硫酸铜 配制巴比妥钠缓冲液（,./L ）, 将上 +40ml 蒸馏水， 混匀既得染 配制的乙酸钠缓冲液（l ） 混匀得染色液 混匀得透明液 溶于5ml 蒸馏水，在搅拌情况下，加入10%氢氧化钠溶液3ml ，用 发酵工程学实验报告实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作 学院生命科学学院 专业应用生物教育 班级12应生A班 姓名李顺昌 学号124120218 实验课程乳酸菌的分离和酸奶的制作 指导教师许波 开课学期2014—2015学年下学期 实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤 一、实验目的 1.掌握分离纯化微生物的基本方法 2.掌握酸奶制作的基本原理 3.学会酸奶的制作方法 二、实验设备与材料 1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。 2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。 3、培养基：乳酸菌分离用 乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。 配制250mL/组，装于2个三角瓶 三、实验原理 1、酸奶制作的基本原理 （1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。 （2）生理生化原理 牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶 2、提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。 3、酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。 四、实验方法步骤 （一）乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法 1、倒平板（约6块/100ml） 2、制备酸奶稀释液 （1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min； （2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液； （3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液； （4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。 3、涂布 用无菌吸管分别吸取10-3、10-4和10-5稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀（每个稀释度涂2块平板）。 4、培养：37℃倒置培养2-3d 5、观察菌落特征（周二中午） 扁平型菌落：大小为2-3mm，边缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为细杆状； 半球状隆起菌落：大小为1-2mm隆起成半球状，高约0.5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状； 礼帽形突起菌落：大小为1-2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，有酪蛋白水解透明圈，染色镜检亦为链球状。 6、分离纯化：（周二）挑取符合上述特征的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养约2d（下周四中午）；如发现杂菌需重复上述步骤（纯化）直到获得纯培养。 （二）酸奶的制作 1、菌种的制备 （1）将分离纯化所得到的乳酸菌分别接种于LB培养基中（30ml/瓶）（下周4早上）； （2）37℃、200r/min摇瓶培养约48h （下周5晚）。 2、牛奶的配制 实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用 事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。 TjpgDec技术手册 -------R0.01b版 前言 相信大家对FATFS文件系统都不陌生了，2012年FATFS的作者推出了JPG/JPEG图片的解码函数库TJpgDec的R0.01b版，使用方法和FATFS文件系统的使用一样，仅仅调用2个简单的库函数就能完成对JPG/JPEG图片的解码，而且输出的数据格式为RGB888或RGB565。 本文档是根据ChaN的专用网页提供的英文版技术手册翻译而来，因个人水平有限以及时间仓促，错误之处在所难免。本文档原始版权归TJpgDec的作者所有，本人只是做了一下翻译的工作，把这篇文档献给所有嵌入式开发人员，希望能够帮到你们。 嵌入式奋勇前进 2013-10-20 一．前言： TJpgDec是一款为小型嵌入式系统服务的高效且完善的JPEG图片解码模块。它占用内存极少，因此可以移植入像AVR,8051，PIC,Z80，Cortex-M0等等小型单片机中。 二．特点： ?库函数是按照ANSI-C规范编写的，所以应用平台不受 约束。 ?易于使用的主模式操作方式。 ?完全可重入的架构。 ?非常小的内存占用： o RAM仅占用3KB，而不受图片大小的影响。 o ROM 占用3.5-8.5KB，主要用于存储代码和const 常量。 ?输出格式: o输出图片比例: 1/1, 1/2, 1/4 ，1/8 可选 o输出像素格式: RGB888/RGB565（可预设） 三．应用程序接口： 共有2个应用程序接口函数，用于分析和解码JPEG图片（译者注：移植TJpgDec时需要在主程序中调用这两个库函数） ?jd_prepare –为解码一个JPEG图片做准备 ?jd_decomp –解码JPEG图片 四．I/O接口函数： TJpgDec需要用户自定义2个I/O接口函数，用于输入JPEG数据和输出解码后得到的像素数据。 ?Input funciotn - 从输入的数据流中读取JPEG的数据 ?Output function –把解码后得到的像素数据发送到输出设备 五．备注说明： TJpgDec应用模块是一款可用于教育和研发的开源软件。你完全可以根据自己的项目需要或者商业产品的需要，自由更改本软件，而不用担负任何个人责任。 六．ChaN的个人网页：（即TjpgDec库函数下载地址）https://www.360docs.net/doc/dd18492929.html,/fsw/tjpg/00index.html 注：其他信息，如各版本信息，在此不作翻译了。 目录 第一章、施工现场实验员工作管理 (1) 一、委托制度 (1) 二、标准养护室测试检查记录 (1) 三、工地实验管理 (1) 四、见证管理 (6) 第二章、水泥与钢筋材料试验 (10) 第一节、水泥 (10) 第二节、钢筋 (14) 第三章、其它原材料试验 (20) 第一节、砂子 (20) 第二节、石子 (24) 第四章、混凝土性能试验 (24) 第一节、普通砼 (27) 第二节、抗渗抗冻砼 (32) 第三节、泵送砼 (33) 第四节、大体积砼 (34) 第五章、建筑砂浆 (34) 一、砌筑砂浆 (35) 第六章、土工试验分析 (37) 第一节、土工试验概述 (37) 第二节、土工的工程分类 (37) 第三节、土的基本物理指标 (37) 第四节、含水率试验 (38) 第五节、密度试验 (39) 第六节、回填土试验 (43) 第七节、灰土 (44) 第八节、压实系数 (44) 第一章施工现场试验工作管理 、委托制度 1．凡送试各种原材料检验的单位，必须认真填写试验委托单。试验委托单要写明编号、试验名称、委托单位、取样地点、试件数量、产地、用于工程的部位、送样日期、需用日期和要求试验项目、需用试验报告份数及其他必须注明的内容。委托单必须有工地技术负责人和送试人签名或盖章。 2．各种配合比试验委托必须填写委托单。委托单要写明使用工程名称和部位、强度等级、各种原材料的产地、鉴定情况及掺合料、外加剂等。必须根据工程进度提前提出申请。 3．混凝土和砂浆试验报告、配合比申请单、工程部位等由委托单位填写。试验室负责填写收样日期、试验编号、试验结果，办理签字盖章手续 4．试样要和委托单对号无误 、标准养护室测试检查制度 1．标准养护室要设置混凝土养护架，砂浆和水泥试件养护箱。养护温度和湿度采用自动控制装置和喷淋式控制。 2?标准养护室的温度应保持在20 C 士2 C，相对湿度在90 %以上。记录温湿度分别用温度记录仪和湿度计。 3．进入标准养护室的试件应根据编号、龄期，并按顺序连续摆放进行养护。试件要摆放整齐，出入养护室要按编号、龄期有条不紊地进行。 牛奶中酪蛋白的提取及含量测定 一、实验原理 1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂类（4%）、蛋白质（3.5%）、维生素、微量元素（Ca、P等矿物质）、水（87%） 牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖，它由D?半乳糖分子和D?葡萄糖分子通过P -1,4-糖昔键连接而成。乳糖溶于水，不溶于乙醇，当乙醇混入乳糖水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。 牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白两种，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。而乳清蛋白水合能力强，分散性强，在牛乳中呈高分子状态。 2、等电点沉淀法： 在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零（即正负电荷相等），此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等电点为4.7左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同），本实验中将牛乳的pH调值4.7时，酪蛋白就沉淀出來。 市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂來增加粘稠度，以致即使pH调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将pH稍微调过多一点再调回等电点。同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使pl偏离了 4.7,通常偏酸。3、酪蛋白的提纯 根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙瞇洗涤，由于乙瞇很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。 4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法） 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G520的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm o当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为595nm o在一定范围内，考马斯亮蓝G520- 蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。 二、实验器材与试剂 1、器材：恒温水浴锅、离心机、抽滤装置、蒸发皿、精密pH试纸、旋涡混合器、紫外分光光度计、试管四、5mL吸管、50mL容量瓶、100mL ft筒、电子分析天平 2、试剂：鲜牛奶、pH4.7醋酸■醋酸钠缓冲溶液、乙醇■乙艇混合液（95%乙醇、无水乙瞇体积比1： 1）、0.9%NaCl溶液、标准蛋白液（0.1mg/mL牛血清蛋白）、考马斯亮蓝G520染液 三、实验操作记录 1、酪蛋白的制备 将20mL牛奶盛于100mL的烧杯中加热到40*C,在搅拌下慢慢加入预热至40?C、pH4.7的醋酸缓冲溶液20mLo用冰醋酸调节溶液pH至4.7,此时即有大量的酪蛋白沉淀析出。将上述悬浮液冷却至室温，离心Smin (4000r/min),弃去上清液，沉淀即为酪蛋白粗品。 牛奶中提取酪蛋白 [目的与要求] 1、了解等电点沉淀法 2、学习从牛奶中制备酪蛋白的方法 3、加深对蛋白质等电点性质的理解 [原理] 蛋白质是一种亲水胶体，在水溶液中蛋白质分子表面形成一个水化层。另外，蛋白质又是一种两性离子，在一定pH溶液能够维持一个稳定的状态。但是调节蛋白质溶液的pH值至等电点时，蛋白质会因失去电荷而变得不稳定，此时若再加脱水剂或加热，水化层被破坏，蛋白质分子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法主要利用两性电解质分子在等电点时溶解度最低的原理，而多种两性电解质具有不同等电点而进行分离的一种方法。 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀，除去脂类杂质后便可得到较纯的酪蛋白。 但单独利用等电点沉淀法来分离生化产品效果并不太理想，因为即使在等电点时，有些两性物质仍有一定的溶解度，并不是所有的蛋白质在等电点时都能沉淀下来，特别是同一类两性物质的等电点十分接近时。生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法并用，这样沉淀的效果较好。 本实验目的是使学生运用等电点沉淀法制备酪蛋白，从中加深对蛋白质等电点性质的理解。 [方法和步骤] 1、取预先放冰箱中冷却的消毒牛奶6mL，3 000r/min离心10min，除去脂肪层的乳液置50毫升烧杯内，加热至40℃左右，在搅拌下慢慢加入10mL左右预热的醋酸-醋酸钠缓冲液，此时混浊液中有大量絮状物沉下。冷至室温，3 000r/min离心10min，弃去上清液，得酪蛋白粗品。 2、用蒸馏水洗沉淀三次（每次5mL左右），3 000r/min离心10min，弃去上清液。 3、将沉淀置研钵中，研碎后，渐加5mL 95%乙醇，静置片刻，将全部悬浮液转移至布氏漏斗抽滤，抽干后的制品，用乙醇-乙醚混合液洗沉淀二次（每次5mL），最后用无水乙醚洗沉淀二次（每次5mL），抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白制品（称重，记录）。 5、酪蛋白溶液的配制：称取酪蛋白0.1g，置10毫升烧杯中，加5mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液，搅匀，隔水加热，溶解后转移至10毫升容量瓶中，用少量蒸馏水洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度处，摇匀，置冰箱中保存备用。 [结果与计算] 计算酪蛋白含量和得率： 1、含量：酪蛋白克数/100mL牛奶 2、 100 %? = 理论含量 测得含量 得率 式中理论含量3.5g/100mL牛奶 微生物试验操作步骤 1.前期准备工作（红色字体需要购买） 10ml离心管（80管）、培养皿（预实验36板，正式试验648板，共计684板）、EP管（预实验36管，正式试验108管，144管）、枪头（5ml、1ml、200ul）、生理盐水现配现用（0.85）2.，灭菌处理 将离心管、枪头、生理盐水、培养基放入高压灭菌锅中灭菌处理后待用。 3.制备不同梯度的样品溶液 预实验 a.梯度稀释试验前一天晚上取置于-80℃盲肠食糜样品于4℃冰箱融化，将需要用到的离心管和EP管分别编号待用。试验期间取盲肠食糜0.5~1g于灭菌后的10ml离心管中，按1：10比例加入生理盐水，制成10-1浓度的样品溶液。然后取0.5ml10-1浓度的样品溶液于下一离心管，按1：10比例加入生理盐水，制成10-2浓度的样品溶液。然后然后取0.1ml10-2浓度的样品溶液于EP管中，按1：1010-3比例加入生理盐水，制成10-3浓度的样品溶液。然后依次如上分别配制10-4、10-5、10-6、10-7、10-8样品溶液。每一次取样前离心管和EP管都要在微型振荡器上震荡混匀。 b.接种和培养：按照平板涂布法进行。分别取各稀释管溶液100μl接种到选择性培养基，大肠杆菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。乳酸菌选择性培养基置5%CO2培养箱，37℃培养48h。双歧杆菌选择性培养基置厌氧发酵罐内，37℃培养48h。沙门氏菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。 c. 微生物计数与鉴定：采用常规微生物平板菌落计数法，选择长有30-300个菌落的平板较为合适，用每克肠道内容物中细菌个数的对数表示( 1gCFU /g) 正式试验 按照预实验操作步骤及适宜梯度进行试验。 4.培养基 总需氧菌营养琼脂（NA）34567 乳酸菌MRS琼脂碱性厌氧234567 双歧杆菌BL琼脂厌氧234567产气袋 大肠杆菌麦康凯需氧234567 沙门氏菌XLD 需氧2345 实验四酪蛋白的制备 一、目的要求 学习和掌握从牛乳中制备蛋白的原理和方法；掌握等电点沉淀法提取蛋白质的原理和方法；掌握离心方法。 二、实验原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7.利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、材料、器材与试剂 1〉材料 鲜牛奶。 2〉器材 离心机、抽滤装置、精密pH试纸、电炉、烧杯、温度计、玻棒、漏斗、滤纸、滴管。3〉试剂 (1) 95%乙醇。 (2) 无水乙醚。 (3) 0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。 A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称取CH3COON a·3H2O 54.44g，用蒸馏水定容至2000ml。 B液：0.2mol/L醋酸溶液，称取优级纯醋酸(含量大于99.8%)24.0g，定容至2000ml。 取A液1770ml，B液1230ml混合即可得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。 (4)乙醇-乙醚混合液的配制：乙醇-乙醚=1:1(体积分数)。 四、实验步骤 (1)将20ml牛奶加热至40°C，在搅拌下慢慢加入预热至40°C、pH4.7的醋酸缓冲液20ml。用精密pH试纸调pH至4.7，将上述悬浮液冷却至室温，离心15min(3000r/min)，弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。 (2)用水洗1次，离心10min，弃去上清液。 (3)在沉淀中加30ml乙醇，搅拌片刻，将全部悬浮液转移至布氏漏斗中离心10min，弃上清液，用乙醇-乙醚混合液洗1次。最后用乙醚洗沉淀1次，抽干或滤纸过滤得到湿的酪蛋白。 (4)将沉淀摊开，风干；得到酪蛋白纯品。 五、结果及处理 准确称重，得20ml牛乳中酪蛋白含量(g)，按下式计算酪蛋白的得率： 测得含量 得率(%)= 理论含量×100 式中，理论含量为3.5g/100ml牛乳。 实验结果： (1.426-0.795) ×5 得率(%)= 3.5 ×100=90.14% 生物实验操作步骤 一、安装显微镜和对光： A 、操作步骤： 1.一手握住镜臂，一手托住镜座，把显微镜轻轻地放在实验台上，镜臂靠近身体略偏左，镜座距实验台边缘约5厘米。安装好目镜和物镜。 2.转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。转动遮光器，使最大的光圈对准通光孔。 3、左眼注视目镜内，同时双手转动反光镜（光强用使用平面镜、光弱使用凹面镜），使光线反射到镜筒里，直到整个视野呈雪白色为止。 4.整理复位：把显微镜的外表擦拭干净。取下镜头放入镜盒内，并将镜筒缓缓下降到最低处。最后把显微镜放进镜箱里，放回原处。 B 、去年考卷： C 、评分标准： （1）安装好物镜和目镜（1分） （2）能将显微镜对好光观察（2分） 记录：雪白色或亮白色（1分） （3）整理器材（1分） 二、制作并观察洋葱鳞片叶临时玻片标本： A 、操作步骤： 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净。 2、用滴管在载玻片中央滴一滴清水。 3、用刀片在洋葱内表面划一个“井”字，用镊子撕下表皮，然后把它放在载玻片中央的水滴中，用解剖针轻轻地将其展平； 4、用镊子夹起盖玻片，使其一边接触载玻片上面的液滴，然后缓缓地盖在液滴上，盖片时要防止装片上出现气泡； 5、在载玻片的一侧滴一滴碘液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次，使染液浸润到整个标本； 6、安装显微镜和对光； 7、将制作的装片安放在显微镜的载物台上，然后将镜筒缓缓下降直到物镜接近玻片； 8、用左眼注视目镜，调节粗准焦螺旋使镜筒缓缓上升，直到在视野中看到细胞图像，然后旋转细准焦螺旋，使物像更清晰； 9、移动装片，在视野中找到一个完整的细胞进行仔细观察； 10、整理复位：取下玻片标本，平移方式（防止折断盖玻片）取下盖玻片并连同载玻片一起放回原处。取下镜头放入镜盒内，将镜筒下降到最低处，然后把显微镜放进镜箱里。把其他废弃物放入垃圾桶并把实验桌抹干净。 B 、去年考卷： C 、评分标准： （1）用纱布将载玻片、盖玻片擦拭干净（1分） （2）在载玻片中央滴一滴清水（1分） （3）用刀片切取一块洋葱鳞片叶，用镊子撕取鳞片叶的内表皮置于载玻片上清水中并用解剖针将表皮展平，盖上盖玻片（1分） （4）将一滴碘液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从对侧引流使碘液扩散到整个标本（1分） （5）将制作好的临时装片放在显微镜下观察（1分） 记录：气泡（1分） 细胞核（1分） 细准焦螺旋（1分） 左上方（1分） （6）整理器材（1分） 三、制作并观察口腔上皮细胞临时玻片标本： A 、操作步骤： 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净； 2、用滴管在载玻片中央滴一滴生理盐水； 3、用清水漱口，清除口腔中食物碎屑，用消毒牙签粗的一端在口腔侧壁上轻轻刮几下； 4、将牙签上附着的碎屑放在载玻片的生理盐水中涂抹几下； 用镊子夹起盖玻片让一侧先接触生理盐水在轻轻放平，避免出现 。 你观察到的细胞内染色最深的结构是 如果想让物像更清晰，应转动 。如果物像在视野的左上方，应将玻片标本向 移动，才能使物像移到视野中间。 建筑工程技术指导手册 1 总则 1.1农村危房改造重建要以保证困难农户重建房屋质量，保护困难农户生命财产安全，改善困难农户居住条件为基本原则，贯彻执行国家法律、法规及相关的标准规范。 1.2服从村庄、集镇、建制镇总体规划和建设规划，注重将农房改造重建与村庄整治、人居环境改善相结合。 1.3农村危房改造重建，要因地制宜采用合格的建筑材料，鼓励应用节能环保型的新技术、新材料、新工艺。 1.4本指导手册主要用于农村困难农户翻建新建二层（含二层）以下的自用住宅及附属用房。 2房屋选址 2.1新建房屋选址要符合规划要求。符合规划的建房户应尽量利用原宅基地恢复建设。有条件的地方，择址新建的房屋应与生态建设紧密结合，不占或少占耕地。 2.2房屋选址应选择稳定基岩，坚硬土，开阔平坦、密实、硬度均匀稳定的有利地段建房。避开活动断层和可能发生滑坡、山崩、地陷、非岩质的陡坡，突出的山嘴，孤立的山包地段，避开饱和砂层、软弱土层、软硬不均的土层和容易发生砂土液化的地段。 2.3选择向阳、通风良好的地段，避开风口和窝风地段。 2.4拟建房屋不能占压地下管线，应与各类电力线路保持安全距离（其中1千伏以下不小于4米，4千伏以下不小于6米），否则必须报告电力线路管理部门采取安全防护措施。 3房屋的建筑设计 3.1房屋建筑设计应围绕使用功能兼顾周围环境，鼓励建房人员采用本地区农房设计通用图集及新技术建设农房。 3.2房屋建筑设计体现以整体环境为中心的设计理念，兼顾农村地方特色，做好房屋外部环境的整体空间布局，处理好户外交往空间，要在保护、节约耕地 的前提下做到以实用为主，采取多种单元类型，系列化拼接，注意房屋建筑节能措施的实施和使用节能建材。 3.3房屋功能布局要做到生产功能与生活功能区分，实行人畜分离，采用科学合理的农村房屋家居功能模式。 3.4在建筑结构设计中要使用成熟的节能体系和节能环保建材；计算各结点承载力；确定窗墙比；提高门窗保温隔热性能和气密性；合理选择朝向；综合利用新能源、可再生能源。 3.5对主要持力层范围内存在软弱粘性土层的地基，应设置钢筋混凝土圈梁或进行地基加固处理。 3.6 在抗震设防地区，要充分考虑抗震设防要求；在雷区应考虑防雷设防要求。 4基础工程 4.1基础地基选择 4.1.1 基础持力层应落在中硬土以上地质均匀的老土层上，基础埋深不少于500毫米。 4.1.2 当基础地基出现软硬不均时，对软土部分进行处理，挖成台阶型，使地基持力层土质相对均匀一致。 4.1.3 当基础持力层落在斜面岩层上时，基槽应挖成台阶型并应有镶固，防止基础滑移。 4.1.4 在坡顶建房，基础应距边坡一定距离，具体视地质情况定。当边坡角大于45°、坡高h大于8米时，应请专业技术人员进行边坡稳定性验算，防止圆弧滑动。对于稳定的边坡，基础底面外边缘线至坡顶水平距离L不得小于2.5米。如所建房屋临近边坡底部，在确保边坡安全稳定的情况下，也应与边坡保持一定距离。 4.2毛石基础施工 4.2.1 砌筑毛石基础的第一皮石块时，基底应用高强度等级的砌筑砂浆找平坐浆，石块大面向下，并选择比较方正的石块砌在各转角处。 4.2.2 应根据石块自然形状交错位置，尽量使石块间缝隙最小，然后将砂浆填在空隙中，并且铁钎插捣密实。严禁采取先放小石块后灌浆的放法。 4.2.3 基础最上一皮石块，宜选用较大的毛石砌筑。基础的第一皮及转角处、交接处和洞口处，应选用较大平毛石砌筑。 4.2.4 毛石基础的转角及交接处应同时砌筑。如不能同时砌筑又必须留槎 牛奶中酪蛋白的制备 一、实验目的 1. 学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 2. 掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 二、实验原理 利用酪蛋白的等点点为4.7，所以调节牛奶的pH4.7使酪蛋白沉淀洗出。等电点是调节溶液的pH,使蛋白质所带的正电荷和负电荷恰好相等，总净电荷为零，以两性离子存在，不想阳极移动也不想阴极移动，此溶液的pH称为蛋白质的等电点。酪蛋白不溶于乙醇、乙醚等试剂。因而加入乙醇乙醚洗涤沉淀物除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 三、实验材料、试剂与仪器 （一）材料与试剂 95%乙醇、新鲜牛奶、乙醇-乙醚混合液（乙醇：乙醚=1：1） 0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液 A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 27.22g，定容至1000 mL。 B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）6.0g定容至500 mL。 取A液590mL，B液410mL混合即得pH 4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液1000 mL。 （二）器具 离心机、抽滤装置、精密pH试纸、玻璃棒、量筒、恒温水浴 四、实验步骤 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （二）酪蛋白的纯化 1. 用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3 000r/min），弃去上清液。 2. 在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液30 mL洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 3. 将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。 （三）准确称重，计算含量和得率。 生物化学实验指导 吕杰编著 新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室 内容介绍 《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。 目录 实验一氨基酸纸层析 (4) 实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5) 实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7) 实验四酪蛋白的制备 (8) 实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10) 实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12) 实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14) 实验八维生素C的定量测定 (16) 实验一氨基酸纸层析 一、实验目的 1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。 二、实验原理 纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。 分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。 3、试剂： （1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。 （2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀； （3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升 四、实验步骤： 纸层析 (1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。 (3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离 六、思考题： 1、何谓分配层析法和分配系数？ 防水工程技术手册（2015版－1） 设计工程部 目录： 第一部分：总说明 第二部分： 第一节：屋面露台防水部分（设计要求）——————————————————第05页第二节：屋面露台防水部分（施工要求）——————————————————第10页第三节：墙面防水部分（设计要求）————————————————————第20页第四节：墙面防水部分（施工要求）————————————————————第24页第五节：厨卫防水部分（设计要求）————————————————————第29页第六节：厨卫防水部分（施工要求）————————————————————第29页第七节：门窗及幕墙防水部分（设计要求）—————————————————第30页第八节：门窗及幕墙防水部分（施工要求）—————————————————第32页第九节：地下室防水部分（设计要求）———————————————————第33页第十节：地下室防水部分（施工要求）———————————————————第37页第三部分：具体案例分析 第一节：常见案例分析——————————————————————————第38页第二节：特殊案例分析——————————————————————————第47页第四部分：相关项目实施大样 第一节：常见部位大样——————————————————————————第50页第二节：特殊部位大样——————————————————————————第56页第三节：施工流程大样——————————————————————————第58页 第一部分：总说明 1总说明 防水工程的设计及施工应遵循“防、排、截、堵相结合，刚柔相济、因地制宜，综合治理的原则”，做到先排后防，即首先不能有积水，要将水在短时 上海大学生命科学实验中心 实验预习报告 课程：姓名：日期： 学号：同组者：指导老师： 实验时间：温度：湿度： （一律用A4纸、钢笔书写或打印，不得涂改，经教师签字后方为有效，附在实验报告中一并交。 如无此原始记录或丢失，报告不批示成绩） 实验名称：酪蛋白的制备 1.目的：学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法，并依此加深对等电点概念的印象。 2.原理、仪器设备、材料和试剂： 原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质。其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。牛乳在pH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在乳中呈高分子状态。 在处于其等电点时，兼性离子/粒子在溶液中的溶解度降低；如果我们将牛奶的pH 调到4.7，就可获得酪蛋白沉淀；下一步，用乙醇、乙醇-乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物，以去除脂溶性杂质，就可得到较纯的酪蛋白。 试剂：95%乙醇；无水乙醚；乙醇—乙醚混合液(V/V=1∶1) 。 0.2mol/L pH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL： A液：称取NaAc 3H2O 54.44g，定容至2000mL。 B液：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL。 取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。 仪器：离心机；抽滤装置；研钵；布氏漏斗；容量瓶。 3.操作步骤及现象记录 1．将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃。将20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液。 2．用精密pH试纸调pH至4.7，可见溶液变为乳白色悬浮液。待悬浮液冷却至室温，3000rpm离心 酪蛋白 内容提要：蛋白质是由氨基酸构成的高分子化合物。蛋白质同氨基酸一样是两性电解质，调节蛋白质溶液的pH值可使蛋白质分子所带的正负电荷数目相等，即溶液中的蛋白质以兼性离子形式存在，在外加电场中既不向阴极也不向阳极移动。这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。在等电点条件下，蛋白质溶解度最小，因此就会有沉淀析出。牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。牛乳在pH 4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在乳中呈高分子状态。提取到酪蛋白后，可以用双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应来鉴定分析。 关键词：酪蛋白制备定性分析鉴定 1、实验目的 （1）学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 （2）对酪蛋白进行分析鉴定。 2、实验原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白食一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 双缩脲：尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与铜离子结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 茚三酮反应：一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳、氨分子和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。反应的适宜ｐＨ为５－７，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同ｐＨ条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 3、实验试剂、材料与器材 3、1试剂与材料 实验报告 一、实验名称：从牛奶中分离酪蛋白 二、实验目的： 1.学习从胶体中提取某一类物质的方法。 2.学习蛋白质的各种颜色反应及其原理。 三、实验原理： 1.蛋白质是两性化合物，溶液的酸碱性直接影响蛋白质分子所带的电荷。当调节牛奶 的pH值达到酪蛋白的等电点（pl）4.8左右时，蛋白质所带正、负电荷相等，呈电 中性，此时酪蛋白的溶解度最小，会以沉淀形式从牛奶中析出。 2.缩二脲反应原理：具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应,生 成红紫色的络合物。所有的蛋白质均有此显色反应。 3.蛋白黄色反应原理：硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，在加热状态下产生了黄色硝 基苯衍生物，再加碱颜色加深呈橙黄色。这是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸 和色氨酸的蛋白质所特有的颜色反应。 4.茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的 缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。 四、实验步骤及现象： 1.取50mL脱脂牛奶于150mL烧杯中，用热水浴加热至40℃，维持此温度，边搅拌 边加稀醋酸（1：9）溶液约2mL——有白色沉淀析出。 2.继续搅拌并使悬浊液冷却至室温，然后将混合物转入离心杯中，于3000r/min离心 15min。 3.离心完毕后，上清液倒入乳糖回收瓶中，沉淀用95%的乙醇（20ml）搅匀，然后用 布氏漏斗减压过滤，用乙醇-乙醚（1：1）混合液洗涤沉淀2次，每次约10ml，最 后用5ml乙醚洗涤沉淀一次，减压过滤至干——得到干燥的白色固体。 4.将干粉铺于表面皿上，称量并计算牛奶中酪蛋白含量。 5.称取0.5g酪蛋白，溶解于0.4M氢氧化钠溶液的生理盐水（5mL）中，然后滴加3-4 滴1%硫酸铜溶液，振荡试管——溶液变成紫色。 五、实验数据： 空表面皿的质量m0 =28.15g 表面皿与酪蛋白的总质量m1 =31.78g 牛奶中酪蛋白的质量m= m1 - m0 =3.63g 六、讨论与感想： 1.牛奶是一种胶体，在正常情况下是均一稳定的，要想分离出其中的某一成分，就应 该想办法使这种成分变成沉淀析出。通过本次实验，我知道了可以通过调节胶体的 酸碱性，来改变蛋白质分子所带电荷，使其达到等电点。此时蛋白质分子间的电荷 作用力最小，分子间没有了间隙，浮力减小，蛋白质就会沉淀。而实验中50ml牛 奶和2ml稀醋酸（1：9）所配成的混合液的pH恰好在4.8左右，正好是蛋白质的 实验名称：观察植物细胞 1、用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净 2、把载玻片放在试验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。 3、①用镊子从洋葱鳞片叶内侧撕取一小块透明薄膜内表皮。②把撕下的内表皮浸入载玻片的水滴中，用镊子把它展平。 4、用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，然后缓缓地放下，盖在要观察的材料上。 5、把一滴稀碘液滴在盖玻片的一侧。染 6、用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本的全部。 观察人的口腔上皮细胞 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净。 2、把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水 3、用凉开水把口漱净。用消毒牙签从口腔侧壁处轻轻刮几下，牙签上就附着了一些碎屑。把牙签放在载玻片的生理盐水滴中均匀地涂抹几下。 4、用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的液滴，然后缓缓放平。 5、在盖玻片的一侧滴加稀碘液（染），另一侧用吸水纸吸引，使染液浸润到标本的全部。 观察鸡卵的结构 1.取一个鸡卵，观察其外部形态。（放大镜，气孔） 2.将鸡卵的钝段轻轻敲出裂纹，将碎裂的卵壳连同紧贴壳的膜除去，观察鸡卵的气室。（镊子，卵壳，外卵壳膜和气室） 3.用剪刀将气室下的内卵壳膜剪破。（剪刀） 4.将卵壳膜内的卵白和卵黄转移到培养皿中，卵黄完整。（培养皿） 5.观察鸡卵的结构。若未见胚盘，可用镊子夹起细系带把卵黄轻轻翻转。 观察种子的结构 1.观察菜豆种子的结构 ⑴取一粒浸软的菜豆种子，观察它的外形[来源:学|科|网Z|X|X|K] ⑵剥去种子最外面的一层薄皮-------种皮，分开合拢着的两片子叶。 ⑶用放大镜仔细观察子叶.胚根.胚轴和胚芽，看看它们各有什么特点？ 2观察玉米种子的结构 ⑵一粒浸软的玉米种子，观察它的外形。 ⑵用刀片将这粒种子从中央纵向剖开。 剖面上滴一滴碘液，在用放大镜仔细观察被碘液染成蓝色的胚乳以及未被染成蓝色的果皮和种皮，胚芽，胚根，胚轴和子叶，看看它们各有什么特点？ 测定某种食物中的能量 1．取一只锥形瓶（50毫升），量筒量取30毫升水注入其中，再将它固定在铁架台上。 2.再锥形瓶里放入一支温度计（温度计下端要浸入水中，但不要接触锥形瓶的瓶底） 3.参照右图安装好试验装置，并测定水温。 4.称出一粒干燥花生种子的质量，将这粒种子放倒火焰上点燃， 5.将刚刚燃烧的花生种子尽快放倒锥形瓶底部。待这粒花生种子完全燃烧后，测量水温。 6.计算：Q=CM△T=30×4.2×（t2－t1）(把测量的温度代入，得出数据)牛奶中酪蛋白的提取与分析
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