植物组织培养实验报告

植物组织培养实验报告文档编制序号：[KKIDT-LLE0828-LLETD298-POI08]

院(系、部) 化学与生物工程学院专业生物技术（师范）年级13级学号姓名组别第二组课程名称植物细胞工程学实验日期指导老师实验名称植物组织培养综合实验

一、实验目的

1.熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法

2.学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法；

3.掌握超净工作台上的接种方法与注意事项，了解接种室的灭菌方法；

4.了解组织培养的基本程序；

5.掌握接种的方法和材料的培养过程；

6.掌握无菌操作技术，包括外植体除菌和接种技术；

7.观察外植体的生长状况、染菌状况，剔除染菌外植体；

8.了解MS培养基和1/2MS培养基的区别

二、实验原理

1.植物细胞的全能性

一切植物都由细胞构成，细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。植物细胞含有全套遗传信息，具有形成完整植物的潜能。

2.植物细胞表现出全能性的条件

1.离体状态；

2.有一定的营养物质，激素和其他外界条件（无菌、温度、pH）；

3.选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型

3.无菌条件

把植物的组织、器官等，使其在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖。用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组培中外植体都死带菌的，在接种前必须进行表面消毒，这时取得培养成功的最基本和重要的前体。组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，所以所有的器材、植物体、接种室都应是无菌的。

4.脱分化与愈伤组织

已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化形态，转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。

5.培养基

植物组织培养常用的培养基为MS培养基。常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40℃以下)即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在4—10克／升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。MS培养基属于富盐平衡培养基，特点是：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。这类培养基是目前使用最广泛的培养基。

6.生长调节物质

包括天然植物激素额人工激素类似物。植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分化、器官形成和个体再生等均起着重要而明显的调节作用。一般来说，基本培养基只能保证培养物的生存，维持其最低的生理活动，而只有植物激素的配合使用，才能完成离体培养物中按照需要设计的各个调节环节。常用的植物组培激素种类主要有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素。

1)生长素的生理作用主要是促进细胞分裂和生长，有利于外植体脱分化并启动

细胞分裂，有利于形成愈伤组织。同时生长素和细胞分裂素的协调作用，对于培养物的形态建立十分必要。在离体培养的分化调节中，生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。在液体培养中，生长素还有利于体细胞胚胎发生。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、奈乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）和吲哚丁酸（IBA）等。在使用2，4-D时，必须严格控制使用

浓度和培养时期，因为高浓度的2，4-D常常抑制器官的发生，在分化培养

时不能使用2，4-D代替其他生长素。

2)细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，

增强蛋白质合成等。此外，它还能显着改善其他激素。离体培养中，细胞分裂素能够促进不定芽的发生，与生长素协调使用能有效调控培养物的生长与分化。常用的细胞分裂素包括6-卞基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、异戊

烯氨基嘌呤（2ip）、玉米素（ZT）等。

3)赤霉素（GA）是一类广泛存在于植物体内的激素，目前已发现的天然赤霉

素有20多种。自然界植物体内的赤霉素具有促进细胞伸长生长、诱导花芽

形成、打破种子休眠及诱导单性结实等生理功能。在离体培养条件下，赤霉

素的主要作用时促进细胞伸长生长，与生长素协同作用对形成层的分化具有

一定影响，同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。

三、实验材料、试剂和仪器设备

1.植物材料：马齿苋、番茄种子诱导的无菌苗、外植体（盘龙参、波斯菊、金叶

女贞、黄花苜蓿、菊花、香樟、杜鹃、月季）

2.实验药品（试剂）：甲醛、MS培养基母液（见表1）、蔗糖、琼脂、1%升汞、

酒精（75%和90%）、NaOH、HCl、6-BA、NNA、无菌水；

3.仪器设备和实验用具：高压灭菌锅、天平、pH计、超净工作台、电炉、酒精

灯、镊子、解剖刀、剪刀、烧杯、培养瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、广口试剂

瓶、牛皮纸、滤纸、培养皿、药勺、支架、打火机等。

四、实验步骤

(一)培养基母液的配制(2016/3/4)

1.MS培养基贮备液配制

表1

1)每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后

再将它们混溶，定容。

2)贮备液III需加热溶解。混合后调至，定容，保存在棕色玻璃瓶内。

3)6-BA：1 mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。

NAA：1 mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。

4)各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制

倍数、日期等，放入冰箱冷藏室保存。一般无机物质的母液在冰箱中可

保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀

或霉变,应立即需重新配制。

2.其他试剂的配置

1)1 mol/L 的NaOH：1瓶

2)1 mol/LHCL ：1瓶

3)%的升汞或2%次氯酸钠：每个超净工作台一瓶（用时处理5-30min)

4)70~75%酒精：每个超净工作台一瓶

5)95%酒精：每个超净工作台一瓶

6)75%酒精棉球：每个超净工作台一瓶

(二)培养基的配制与灭菌

1.培养基配制

1)配制培养液（MS培养液）：按每次配制500 mL培养基计，用量筒或者

移液管从各种母液中分别取出贮备液I 25 mL、贮备液II、Ⅲ、Ⅳ各5

mL；

2)溶化琼脂：用粗天平分别称取5g琼脂、15g蔗糖放入500 mL搪瓷缸

中，加入蒸馏水400 mL，用用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直

到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，

最后加蒸馏水定容至500 mL，搅拌均匀。

3)调pH：用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶

化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（～）测培养基

的pH，一直到培养基的pH为为止（培养基的pH必须严格控制在）。

4)培养基的分装溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧

杯中，然后将烧杯中的培养基倒入组培瓶（50 mL或100 mL）中。注意

不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。组培瓶中培养基的量约50 mL 。每

500 mL培养基，可分装10～15瓶。

5)培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。最后在组培瓶外壁贴上标签。2.培养基灭菌（高压灭菌）

1)放培养瓶。将装有培养基的培养瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气

灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔

开。

2)放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌

锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以

上物品都要用牛皮纸封口），用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、

镊子、滤纸、铅笔等。

3)待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、℃下，灭菌20

min。灭菌后取出培养瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d

后再使用。

3.其他灭菌

1)不耐热的物质将采用过滤灭菌

如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。

过滤灭菌的原理：溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。

2)玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌

即利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀灭微生物。

3)用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌

(三)接种室和超净工作台的灭菌处理

1.接种室熏蒸灭菌

长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。

甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。

几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和

反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2小时进行。

对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸

2.准备组培室

将组培室打扫干净，调至适宜温度

3.超净工作台处理

1)材料准备

用75%酒精擦拭，准备好超净工作台内物品，包括酒精棉球、75%和90%酒精、废液缸、打火机、酒精灯、支架、镊子、解剖刀、解剖剪等

2)灭菌处理

实验开始前先用75%酒精擦拭工作台面，然后开启紫外灯，紫外照射20min-30min。关闭紫外灯，开启风机10min后打开日光灯。用70－75％

的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，

将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。

注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰

不能时间太长。

(四)无菌苗的培养(2016/3/11)

1.培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）

种子的萌发采用1/2MS培养基

2.马齿苋（番茄）种子处理

1)洗去浮尘和上漂的种子，挑选饱满种子，置于培养瓶中流水冲洗30min

后倒掉水备用；

2)将种子置于培养瓶中，用75%酒精消毒灭菌30~60s，用无菌水冲洗干

净；

3)用1%升汞处理8~10min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿

中，置于酒精灯火焰下方，用无菌接种器械进行分离接种。

3.接种及培养

1)用酒精擦洗工作台和手，对接种器具进行灼烧灭菌；

2)打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子（90%酒精浸泡并灼烧）

将培养材料置于培养基上，灼烧瓶口，盖上瓶塞。

3)培养瓶贴上标签，做好标记，然后放到光照培养箱中或培养室培养架上

进行培养，条件为2000-3000LX，26±1℃，培养一周。

实验结果：所有马齿苋无菌苗均染菌（未拍照）

实验分析：①马齿苋种子消毒、灭菌时间不足

②接种室和培养实灭菌不彻底，环境较脏

③实验操作不正确

④超净工作台不干净

(五)愈伤组织诱导(2016/3/25)

1.培养基的配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）

2.无菌苗和外植体的处理

1)无菌苗处理

从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用；

2)外植体处理

a将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；

b将洗净植物切去叶柄，将叶片从叶脉处剪开，再切成3～4 mm2的

小块；嫩茎需切取两个节之间的节间部分，长约1 cm，流水冲洗

30min；

c将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌水冲洗

d用1%升汞处理12~15min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后进行接

种。

3.接种及培养（同无菌苗的建立）

4.剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养

5.观察实验现象

实验结果：

第一周

材料 马齿苋 盘龙参根 结果

材料 盘龙参叶 盘龙参叶基部 结果

材料 苜蓿花+叶 波斯菊叶 结果

第二周(2016/4/15) 材料 结果

开始

长愈伤组织

无变化

愈伤组织长势良好

实验分析：

1、仅有无菌苗染菌：无菌苗本身染菌，但未被发现； 实验培养基凝固不彻底，粘到瓶子壁上；

叶）

叶-50% 叶：50%

波斯菊叶

0 100%

培养基pH未调好；

操作时，动作不正确

无菌苗仅用无菌水洗涤，未用酒精和升汞

2、外植体有部分枯死：灭菌过度，时间过长

3、盘龙参组织无变化：可能由于培养基中植物激素不适宜，培养室温度、光照等不恰当

4、波斯菊长愈伤组织明显，此培养基较适宜波斯菊

5、不同植物对植物激素的要求不同，所以在同一浓度下出现不同的结果

(六)生根实验（类似扦插）(2016/4/15)

1.生根培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）

2.无菌苗和外植体的处理

1)无菌苗处理

从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，保留部分幼嫩叶片，切成大小（材料尽量幼嫩），置于无菌培养皿备用；

2)外植体处理

a将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；

b将洗净植物切去老叶，保留顶端嫩叶、嫩茎，切成长约2 cm茎段，流水冲洗30min；

c将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌水冲洗

d用1%升汞处理13min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后（约）进行接

种。

3.接种及培养（同无菌苗的建立）

一瓶接种2~3个茎段，直接插入培养基中，形态学上端朝上；

4.剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养

5.观察实验现象

实验结果：

周

(206/

4/29)

结果

褐化，无根

无根有白色菌点or愈伤组织

材

料

杜鹃波斯菊茎

结

果

无根，几乎无变化长势旺盛，略微生根

材

料

女贞茎

结

果

无变化，无根

第二周(2016/5/6)

其余材料均无明显变化

材

料

月季花波斯菊

结果开始枯萎，无根波斯菊开始长菌，黄色细菌，菌落光滑

稍长根，但不明显

综合对比

不同浓度NAA对波斯菊生根的影响(2016/5/6) NAA浓度低——————————> 高

实验结果显示：较高浓度NAA诱导长根效果

更好。如图所示，随NAA浓度的增加，波斯菊生根越多，长势越好

(七)生芽实验(2016/5/6)

1.生芽培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）

组别

6-

BA

NNA 贮备液

Ⅰ

贮备液

Ⅱ

贮备液Ⅲ贮备液

Ⅳ

蔗糖琼

脂

一5% % 15g 5g 二5% %

2.无菌苗和外植体的处理（同上）

1)无菌苗处理

从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用；

2)外植体处理

a将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；

b将洗净植物除叶留芽，切成长约2 cm，流水冲洗30min；

c将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌水冲洗

d用1%升汞处理12~15min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后进行接

种。

3.接种及培养（同无菌苗的建立）

4.剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养

5.观察实验现象

实验结果：

第一

周

（20

16/5/

20）

第二周(2016/5/27)

愈伤组

织

第三周（2016/6/3）

五、注意事项

1.配制培养液时应注意：

1)在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶

子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，

重新进行配制；

2)用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管

润洗2次；

3)量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1

种，以免出错。

4)溶化琼脂需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不

能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪

瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热

时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。

2.外植体放入培养基时，注意方向。每瓶放置外植体的数量，应该根据培养瓶瓶的

大小来确定，一般放置胡萝卜4-6块。注意外植体也不要放得太少，以充分利用培养基中的营养成分。

3.接种用的酒精灯，火焰不要调得太高，接种时应靠近酒精灯火焰操作，接种的速

度要快。

4.接种时严防超净工作台内着火。

5.无菌操作培养时：

1)进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机

会。

2)不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

3)为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东

西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。

4)工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露

在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使

用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。

5)吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，

以防扩大污染或导致细胞交叉污染。

6)工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面

发生污染。

7)手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸

管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。