TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展
TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 的应用和研究进展
姜文灿，岳素文，江洪，王成彬
姜文灿，温州医科大学检验医学院、生命科学学院2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术。
[摘要] TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 因其重复性好、特异性强、线性范围宽等特点在各个领域有着广泛的应用，内标系统的引入进一步提升了该方法的灵敏度，增加了其可靠性和实用性。然而，这一技术也因为假阴性和假阳性问题存在着改进的空间。本文从TaqMan 探针法的简介、研究进展以及应用前景展开综述。
[关键词] 实时荧光定量PCR ；TaqMan 探针；引物二聚体；内标系统
[中图分类号] R446.6-3 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 2095-2775（2015）01-0797-09 Application and research progress of TaqMan probe real time PCR
[Abstract] TaqMan real-time PCR has been widely used in various fields because of its good repeatability, strong specificity, wide linear range, etc. Import of the internal control (IC) system further improved the sensitivity of this method, consequently increased its reliability and practicability. However, there are still some improve rooms for this technique because of the false negative and false positive problem. Here we proceed a review for TaqMan real-time PCR cover its introduction, research progress and applicative prospect.
[Key words] Real-time fluorescent quantitative PCR; TaqMan; primer dimer; IC
[作者简介] 姜文灿，2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术
[作者单位] 325000 浙江温州 温州医科大学检验医学院、生命科学学院（姜文灿，王成彬）；100085 北京 北京泰格瑞分子检验有限公司（岳素文，江洪）
[通讯作者] 王成彬，E-mail ：wangcb301@https://www.360docs.net/doc/dd7581491.html,
聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction, PCR ) 是在体外模拟体内核酸复制从而获取大量目的基因拷贝的技术，最早由Mullis [1]发明。其几何级数的放大模式，相比于普通信号叠加的检测方法灵敏度提升了上百万倍，同时又因操作简便，成为核心技术之一。实时荧光定量 PCR 是在传统 PCR 基础上加入信号系统达到实时监测 PCR 扩增的目的，继承了传统 PCR 高灵敏度和操作简便的特点，同时实现了对样本的定量检测。根据信号基团的不同，实时荧光定量 PCR 可以分为染料法和探针法。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于普通 PCR 非特异性扩增产物干扰的假阳性问题[2]。探针法中使用的探针多是 TaqMan 探针，与染料法相比，在一定程度上避免了假阳性问题的出现。现阶段， TaqMan 探针技术在医药卫生、农业科学、生物科学、政治法律等方面得到了广泛的应用[3-6]。
1 TaqMan 探针法简介
1.1 原理 TaqMan 探针的基本原理是利用扩增过程中Taq 酶的5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针在PCR 过程中延伸[7]，当引物延伸至寡核苷酸结合位置时，Taq 酶可以将其切割成小片段，使报告基团和淬灭基团分开并发出荧光（图1），经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增长对样本进行定量分析。现阶段使用的荧光报告基团有HEX 、FAM 、ROX 、JOE 、VIC 等[8]，荧光淬灭基团主要有TAMRA 、BHQ 等。研究发现，BHQ 本身具有非常低的荧光背景，实用性
高于TAMRA[9]。
图1TaqMan水解探针作用机理图
为了实现定量，我们往往以PCR反应的第3～15个循环的荧光值作为荧光本底信号，以3～15个循环的荧光值增加量标准偏差的l0倍为荧光阈值，根据信号达到该荧光阈值的循环次数（Ct值）和标准曲线判定结果。Ct值和荧光阈值一般要经过15次测试才能确定[10]，标准曲线要借助外标准品的检测完成，而外标准品制备的方法有直接化学合成、从标本获取和使用纯化病毒产物制备三种，其中实用性最高的为第三种[11]。Stone等[12]提出标准品要具有强稳定性的特点，DNA也要高度纯化并得到精确稀释。此外，在反应过程中，理论上每经过3.3个热循环靶模板总量增加一个数量级，故而标准曲线的斜率应在-3.3附近[13]。
1.2反应体系和使用仪器TaqMan探针法需要在传统PCR扩增体系中加入特异性TaqMan探针，同时选择性加入内标系统，总体积50μl、40μl、30μl、25μl、20μl均可见，一般进行40~45个循环。同普通PCR，TaqMan探针法中各成分含量的变化也会影响实验结果，而实验结果需要通过Ct值和荧光增值（Rn）获取，所以在检测前一般遵循Ct值最小、Rn最大的原则对体系进行优化[14]。此外，加入ROX染料可以校正背景荧光[15]；对于引物的合理性，可以通过产物电泳和熔解曲线分析来确定[16]。反应体系中使用的是不同荧光素标记的探针，因此检测的完成要借助多通道PCR扩增仪，比如ABI 7500扩增仪、罗氏公司的Lightcycler扩增仪、Stratagene Mx3005扩增仪、达安公司DA7600扩增仪、Bio-Rad I cycler扩增仪以及Axygen公司的Mx300P扩增仪[17-22]。其中Roche公司的荧光定量系统采用的是毛细玻璃管形式，升降温速度相对于普通管更快，反应时间也更短[23]。在这种反应管中加入牛血清蛋白（BSA）能减少玻璃壁对核酸聚合酶的吸附，起到保护Taq DNA聚合酶的作用，从而提高体系的扩增效率[24]，但这一方法并不适用于普通反应管。
在对样本进行检测时，并非模板浓度越高扩增效率越高，浓度太高的模板会干扰PCR反应，使扩增效率降低[25]。试验中，我们也可能遇到样本收集不全面的问题，对此，曹冬梅等[26]在使用TaqMan探针进行伤寒沙门氏菌检测时，采用了模拟样本的方式，即在无感染样本中加入不同浓度的细菌，得到多种模拟阳性样品进行检测；此外，他们还使用日本PPS公司的E7001核酸提取仪获得了更多更纯的模板。而胡骑等[27]在对口蹄疫病毒进行检测时，使用的是ABI公司的Magmax Express核酸自动提取系统，这一系统为车载便携式，30min可以同时完成24份样本的提取，为核酸的获取提供了一种新的方法。
1.3 TaqMan探针法的特点TaqMan探针法巧妙的结合了PCR对核酸的高效扩增、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性，克服了常规PCR只能实现定性检测的不足[28]。该技术实行完全闭管式操作，不仅避免了传统PCR开盖引起的产物污染问题，减少了假阳性现象的出现，还避免了对环境的污染[29]。由于其操作简便，判断结果直观明了，整个检测过程只需要2~3h[30]。相比于传统PCR电泳的方法，该技术的检测结果以更客观的数据形式呈现，可对样本进行阳性、阴性和可疑的判定，从而确保结果的准确性[31]。其特异性有引物和探针双重保证，
进一步增
加了结果的可信度[32]；探针的加入还降低了体系的检测下限，使其灵敏度比普通PCR高1~2个数量级[33]。此外，TaqMan探针法还具有自动化程度高、重复性好的特点[34]，特别适用于保存时间长而无法进行病毒分离的大批量样本检测[35]。敖金霞等[36]在实时荧光定量PCR技术用于转基因检测的综述中指出，该技术不仅可以实现对靶模板的定量，而且具有实时准确的特点。颜善活等[20]应用TaqMan探针法进行肺炎链球菌检测时，提出其具有敏感性高、特异性强、药物影响小、检测速度快、人力花费少、经济实惠等优点，为肺炎链球菌感染的诊断提供了一种新方法。为了进一步提高反应的灵敏度，王琳[37]在PCR反应体系中加入了探针增强液，但并未对此作出具体分析。
TaqMan 探针法线性范围宽，陶志华等[38]使用 TaqMan 探针法对HBV DNA实现了定量并进行了线性分析，结果显示该方法在104~1011 copy/ml 范围Ct值有很好的线性。施开创、孙庆歌[39,40] 在使用TaqMan探针法进行基因检测时也验证了其线性范围宽的特点。
在这一反应体系中，加入的探针识别步骤保证了该方法的特异性，因此我们可以采用多重PCR技术在一个反应管内同时完成对多个靶模板的分析[41]。董瑞玲等[31]针对登革热病毒的不同基因序列分别设计了引物和探针，建立双重PCR 反应体系实现了病毒的基因分型。赵冉等[42]则分别以四种肠道致病菌的基因保守序列为靶标，通过引物和探针的设计同时对四种细菌进行检测，大大提升了检测效率。翁学军等[43]也利用多种TaqMan探针建立了多重PCR检测呼吸道病毒的模式，并指出反应中所用酶的价格比较贵，增加了检测的成本，但该方法操作简便，可同时完成多种病毒检测，更加符合临床需求。多重PCR 增加了反应的复杂程度，因此其设计要遵循一些原则：①检测的灵敏度应达到或者接近单重PCR 水平；②避免引物对间的相互干扰；③避免靶模板之间的非特异性扩增；④保证引物对退火温度相近从而使目的片段有相近的扩增效率；⑤不同荧光基团之间无相互干扰并借助多通道扩增仪完成检测[44]。
1.4探针发展TaqMan探针之后，陆续出现了其它水解型探针（TaqMan-MGB、TaqMan-分子信标）和杂交探针（分子信标、双杂交探针、双链探针）以及探针标记引物（LUX引物、茎环引物、蝎型引物等），进一步推动了实时荧光定量PCR技术的发展。
TaqMan-MGB探针是在TaqMan探针基础上发展起来的一种水解型探针，在探针的3’端添加了可与靶模板和探针形成的螺旋小沟结合的MGB分子，提升了探针的Tm值，从而缩短了探针的长度，解决了检测中探针设计的难题[45]。另外，在实时荧光定量PCR早期，不能将荧光信号和背景荧光分开，无法判断产物量的变化[46]。对此，MGB探针3’端使用的是非荧光淬灭基团，与荧光报告基团距离也更近，降低了非特异性荧光背景，提升了检测的灵敏度[47]。同样针对背景荧光问题，分子信标（Molecular Beacon，MB）的概念在1996年由Tyagi等[48]提出，它是一种有着茎环结构的探针，其环部与靶模板完全配对，颈部由互补的序列组成，与靶序列无关；茎干部与靶模板杂交后环状区-目标分子双链结构之间的热力学关系，使分子信标的杂交特异性明显高于常规的线性探针，对靶序列中单个碱基的变化均可检测，适用于SNP分析[49]。在分子信标的基础上，KUHN等[50]利用基于肽核酸的分子信标，使双链DNA在不变性的条件下也能与MB结合，克服了常规分子信标只能与单链靶模板结合发光的问题。
TaqMan-MB是在分子信标及TaqMan探针的基础上设计的一种新型均相荧光探针[51]，该探针保留了分子信标的茎环结构和TaqMan探针的5’端互补序列，使荧光信号有构象变化和探针水解两个来源，降低荧光本底的同时增加了检测过程中信号的强度；此外，这一结构还可避免探针和引物之间的聚合，增加了检测的特异性。
双杂交探针由罗氏公司发明，要结合Roche 公司的Lightcycler扩增仪应用，适用于病原体和未知突变点的检测，可进行熔解曲线分析。蝎型探针是在分子信标基础上发展起来的探针，对等位基因检测特异性强，可实现多重分析[52]。Amplisenor是一种复合探针技术，采用的半套式PCR扩增技术提升了其灵敏度，但中间阶段半套式引物的加入环节增加了污染的可能性[41]。二聚体突变引物在引物的5’端标记荧光基团并使用3’端标记淬灭基团的带有一个突变位点的互补
寡核苷酸，提升了检测的灵敏度并降低了成本，但面临着引物二聚体产生假阳性的问题[53]。
其他探针如双链探针、茎环引物等[54]虽然检测的灵敏度相比于TaqMan探针有所提升，但复杂的设计流程和高昂的检测成本限制了其应用范围。双链探针和双杂交探针的发光机理与分子信标相似，在退火过程中与靶模板结合发出荧光；LUX引物、Sunrise引物等是在分子信标的基础上发展起来的探针[55]，在延伸过程中结合到双链内发出荧光[56]。故水解探针和探针标记引物信号的采集应在延伸阶段，而杂交探针信号的采集应在退火阶段。此外，Cycling探针、Simple 探针和神奇荧光探针也得到了一些应用[56-58]。
2研究进展
PCR用于样本分析时由于其指数放大环节的存在可以实现分子水平的检测，所以又被称为分子诊断[59]，然而其最大的缺点也源于非特异性的指数放大。虽然传统检测方法的非特异性也存在于PCR系统，但与指数放大产生的非特异性相比可以忽略，所以引物二聚体(Primer Dimer, PD)才是这一问题产生的根本原因。PCR中一对过量引物通过3’端聚合、互为模板和引物延伸产生的引物二聚体，使体系中形成PD与靶模板共用一对引物的竞争性反应模式。一对3’末端存在2~3个互补碱基的引物，经过十几个热循环就会产生大量PD掩盖靶模板的扩增[60]，经引物设计原则或软件优选的3’端尽量无互补的引物对一般从30个循环开始出现PD扩增[45]，限定了检测的灵敏度。在PCR反应中，由于扩增效率的不同和指数放大效应的存在，同样量的初始模板扩增产物量千差万别，因此常规PCR只能结合凝胶电泳实现定性检测而不能进行准确定量[55]。电泳的后处理增加了交叉污染的可能性，加入的染色剂溴化乙锭又有致癌性，致使该技术不宜用于高通量样本检测[61]。
Higuchi等[62]首先提出使用荧光染料动态监测PCR产物信号的方法，根据信号进入指数增长期的热循环数与初始靶分子量负对数之间的线性关系实现定量。但这些染料中，EB可以抑制PCR酶[63]，随后使用的染料SYBR Green Ⅰ、Super Green和Pico Green等[64-66]也都会结合引物二聚体造成假阳性。
TaqMan水解探针技术最早在1991年由Cetus公司的Holland等[67]使用，探针5’端标记32P和T4多核苷激酶，3’端设计为不能延伸。在此之后，Heid等[68]于1996年首先报道了TaqMan PCR的原理和方法，同年，ABI公司推出5’端标记荧光基团3’端标记淬灭剂只能结合靶模板的TaqMan探针。探针的加入绕过了引物二聚体产生的假阳性问题，但其干扰作用仍然存在，浓度较引物二聚体（Ct30）低十倍即对应Ct值在33之后的靶分子会被抑制产生假阴性[69]。在扩增反应中，一般Ct30对应的靶模板量在103数量级[70,71]，Ct33对应的靶分子数在102数量级，依此类推，数个靶分子需要38以上的热循环数才能进入指数扩增期，因此定量检测一般要进行40~45个热循环[72]。类似于普通竞争性双重PCR，与引物二聚体浓度差在10倍之内的靶模板不会被抑制，所以TaqMan探针法检测灵敏度比普通PCR和染料法高一个数量级[33]。配合热启动策略可以进一步提升体系的灵敏度和特异性[45]，辅助UDG酶和矿物油密闭等措施[73,74]，TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术已基本达到临床要求。
Aqula等[75]于1991年正式提出热启动概念，而经典热启动是在反应开始时升温的过程中加入Taq DNA酶（即人工热启动），可以将PD的出现推后1~2个热循环。现阶段该方法也得到了发展，我们可以通过引物的改进实现热启动，如使用发卡结构引物、双链引物和热活性引物；也可以通过对dNTP的修饰实现；还可以采用针对Taq DNA聚合酶的策略，如单克隆抗体结合、琼脂糖包埋和变异Taq DNA聚合酶；此外，蜡包镁离子也是热启动策略之一[76,77]。
不同于普通PCR和染料法中引物二聚体造成的假阳性问题，探针法中PD的竞争性抑制作用可以引起浓度低1个数量级的靶分子出现假阴性。但文献报道的主要是由PCR抑制剂和提取方法不当造成的假阴性[78]，假阴性率在1.5%~4.9%[79,80]。针对这一问题，可采用加入内标系统的方式来解决[81]；而根据其来源和反应模式不同，内标系统又可以分为竞争性和非竞争性两种。
竞争性内标一般是由靶模板经突变克隆产生的外源模板，与靶模板共用一对引物，应用不
同荧光素标记的水解探针实现定量，在排除假阴性问题的同时还提供了另一种定量的方法[82]。但在这一反应体系中，当内标基因和靶模板浓度相差十倍以上时，会出现竞争性抑制现象，使检测的灵敏度下降[83]；另外，竞争性内标的制作较为复杂费时[84]。
非竞争性内标系统中，多以管家基因作为内标基因[85]，分别设计针对靶模板以及内标基因的探针和引物，使其形成非竞争性双重PCR反应体系。虽有文献报道GAPDH、β-actin 和18s rRNA并非是最稳定的管家基因[86]，现阶段最常使用的内标基因还是这几种。类似于普通双重PCR，内标基因和靶模板的浓度差在10倍之内无抑制作用，但由于二者竞争性消耗底物，浓度差超过2~3个数量级时也会产生影响[87]。因此，可以选择经过提取之后Ct值在26~27之间的管家基因作为内标基因[88]，从而对Ct值在20-33之间的靶模板发挥内参照作用。研究发现，TaqMan探针法的灵敏度比普通PCR高一个数量级[89,90]，而加入内标系统之后灵敏度比普通PCR 高两个数量级[39,91]。究其原因，主要是在PCR 反应体系中，PD和靶模板间存在共用一对引物的竞争关系，二者浓度相差10倍时PD会抑制靶模板的扩增，故而未加入内标系统时检测灵敏度仅提升一个数量级。引入这一系统后另外添加了一对引物，引物间发生两两聚合，分散了与靶模板共用一对引物的引物二聚体形成过程，推后其开始指数扩增的循环数；同时体系中PD种类会有所增加，但新增PD不存在与靶模板共用一对引物的竞争关系，浓度与靶模板相差2~3个数量级时才出现干扰作用。因此，非竞争性内标系统的加入从整体上推后了PD抑制作用出现的循环数，使体系的灵敏度相比于普通PCR提升近2个数量级。但内标系统的加入，增加了反应的复杂程度，若新增PD出现的热循环数很靠前，会加重体系中竞争性抑制现象，所以解决假阴性问题的根本措施在于引物的优化。
TaqMan 探针法中加入的特异性探针，理论上不会和污染核酸结合产生假阳性，但在Ct值很靠后的反应中，这一问题也会出现[34]并且假阳性率在0.5%~4.4%[92,93]，这要归因于引物和探针之间的聚合延伸，探针和这种非特异性扩增产物杂交、水解而显色。探针3’端的磷酸化使其出现指数扩增的循环数较引物有所推后，但并非所有的探针都实现了磷酸化。另外，内标系统的加入，增加了探针和引物之间的碰撞机率，也会加重二者聚合的程度。不同于染料法中的熔解曲线分析[94]，由于反应过程中探针已发生水解无法恢复，TaqMan探针法只能采用产物电泳观察非特异性条带的方式排除假阳性，这无疑增加了操作流程和污染机率，所以，解决假阳性问题的关键在于探针的设计。为此，TaqMan-MB[51]在探针3’末端靶序列之后添加7~8个与首端互补的人工碱基使其形成类似于分子信标的茎环状结构，降低荧光信号基线的同时，也避免了引物和探针聚合产生的假阳性问题。在此基础上，我们还可以根据实际情况对TaqMan-分子信标的结构进行调整，从而配合整个PCR系统的优化改善其可靠性。
3应用及前景
3.1医药卫生方面的应用TaqMan探针法在医学和分子生物学领域已经得到了广泛应用，李秉鸿等[48]十多年前对该技术进行综述时就指出它在病原检测、基因表达研究和等位基因鉴定中的重要性。TaqMan探针法用于乙肝病毒检测时，除了可以实现定量外，还可以对HBV进行基因分型和YMDD突变检测，其测定结果与直接测序法符合率较高，并且操作相对简单[95]。国内这一技术用于肝炎检测的专利主要是关于乙肝基因分型和YMDD突变检测联合基因定量，单一针对HBV DNA定量的专利较少[96,97]。目前细菌全身感染诊断的金标准是血培养，但培养结果受多种因素的影响并且无法检测死亡细菌对人体的危害，引起漏诊现象。为了避免这一问题，吴亦栋等[98]使用TaqMan探针建立了检测细菌16s rRNA诊断新生儿败血症的方法，结果显示该方法灵敏高、特异性强，可以为新生儿败血症提供早期诊断依据。李云玖等[45]则以大肠杆菌糖苷酶基因为靶标设计了引物和探针，对血液中的大肠杆菌进行检测，证明该方法阳性检出率与文献报道相符；此外，他指出TaqMan探针法也适用于胆汁和其他体液中大肠杆菌的检测。传统寄生虫检测的方法主要有形态学、化学检测等，这些方法耗时长且灵敏度低。王明旭等[99]在进行松材线虫检测时，根据其DNA保守序列设计了探针和
引物，建立了TaqMan探针检测线虫的方法，检出结果与DNA测序符合率100%。在此之后，王金成等[100]也使用TaqMan探针完成了对松材线虫的测定，并分别设计干扰试验和敏感性实验以验证该方法的特异性和灵敏度，结果显示该方法特异性强、灵敏度高，适用于大批量样本检测。
TaqMan探针法在肿瘤基因检测和药物研究中也都发挥了无可替代的作用。李金兰等[101]以abl为内参基因，使用TaqMan探针法对白血病患者体内融合基因含量和标准化水平进行了探讨，指出该技术不仅能够精确定量基因表达水平，还可以评价影响PCR的因素，极大地提升了PCR技术在血液病诊断和疗效监测上的应用。与此类似，张秀梅等[102]以VEGF-C mRNA为靶标设计了引物和探针，检测其表达水平用以评价该基因与前列腺癌的关系。对于药物沙门氏菌污染的问题，刘婷婷等[103]建立了TaqMan探针法检测沙门氏菌的模型，结果显示该方法灵敏度高特异性好，对人工污染样本检出率100%，可用于药品沙门氏菌快速检测。
此外，TaqMan探针法在基础医学研究中也起着重要的作用。张晶等[104]在实时荧光定量PCR技术应用于微生物学研究的综述中指出，该技术不仅可以实现环境微生物群落变化的动态预测和生理代谢研究，还可以用于微生物群落特性的探讨和生存条件的优化，并可与其他分子生物学技术相结合，为微生物学研究开辟了更光明的道路。
3.2农业科学、工业技术等其他方面的应用TaqMan探针技术在动物学如家禽病毒感染检测、植物学如植物保护和植物基因鉴定、水产渔业等方面[105-107]已经得到了普遍的应用。肖国生[108]在对实时荧光定量PCR技术用于动物学研究的综述中指出，其步伐相对于人要慢得多，但这并非技术本身的问题，而是由于动物的价值和技术成本与人相比存在一定的差距。我们还可以将TaqMan探针法用于农作物的检测和病虫害的预防，焦新萍等[109]使用TaqMan探针完成了对大豆制品转基因成分的检测，王欢[110]则应用该技术实现了对蝶蛹金小蜂的研究。TaqMan探针技术不仅可以用于自动化技术的研发，还可与其他技术联合应用完成检测。窦亚玲等[111]通过TaqMan探针法和扩增阻滞技术，在对靶基因进行定量分析的同时完成了对基因的分型；汪文斐等[34]则将该技术与飞行时间质谱联合应用实现了对结核病易感基因SNP的筛选。另外，该技术还可以用于生物科学探索、环境科学研究、司法鉴定等[112-114]。马亚等[115]借助TaqMan探针技术实现了对松江鲈鱼Cytb基因的序列分子和物种鉴定，并指出该技术为海洋的探索工作提供了可靠的工具。何国林等[116]运用该技术实现了对燕窝的鉴定，并指出生物体内线粒体DNA的含量和稳定性高于细胞核DNA，在使用TaqMan 探针法进行物种鉴别时，可以选择线粒体DNA 作为靶标。
3.3前景 TaqMan探针法实时定量PCR技术自推出以来得到了迅速发展和广泛应用，这无疑显示了其强大的生命力和发展潜力。由于其灵敏、特异等特点，现已成为核酸分子检测的核心技术。如今，大批科研工作者基于TaqMan探针法的定量原理对这一技术进行了不断深入的研究和改良，使其特性得到了进一步的完善，并在TaqMan探针基础上开发出了一批新的探针技术。随着科技的发展，检测更准确更迅速的PCR 扩增仪将不断被推出，引物和探针的优化改良工作也将逐步完成，联合不断革新的软件分析技术，TaqMan探针法将得到进一步的推广和应用。
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荧光比率探针及其应用研究进展
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
实时荧光定量PCR原理和实验
实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更
为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利
实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤
实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。
实时荧光定量PCR全方位解析
实时荧光定量PCR全方位解析 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧
荧光定量PCR实验指南(一)
荧光定量PCR实验指南（一） 一、基本步骤： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 从https://www.360docs.net/doc/dd7581491.html,/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定
比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 序列选取应在基因的保守区段； 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 避免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理 （一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 （二）实时原理 1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念： （1）扩增曲线： （2）荧光阈值：
（3）Ct值： CT值的重现性：
5、定量原理： 理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一：SYBR Green法 （一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同 （二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、基因型的分析； 3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 （三）优点及缺点 优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量PCR操作步骤
实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量pcr步骤
实时荧光定量pcr步骤： 荧光定量PCR 实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC
荧光探针
荧光探针(fluorescent probe)在化学传感、光学材料及生物检测和识别等领域得到了广泛的应用，并成为实现上述功能的一种主要的技术手段。但以传统的有机荧光染料为主的荧光探针在应用中也存在一些难以克服的缺陷。最近，无机发光量子点、荧光聚合物纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子等荧光纳米探针的相继出现，在一定程度上克服了传统有机荧光试剂的缺陷，为生物分析提供了新的发展领域，成为了近年来研究的热点，在此我想作一简单介绍，希望能起到抛砖引玉的作用，如果大家觉得我有什么地方说错的话，欢迎批评指正！让我也从中受益！ 1、荧光纳米粒子的分类 荧光纳米粒子是指可以发荧光的半导体纳米微晶体（量子点）或将荧光团(Fluorophore)通过包埋、共价键连接以及超分子组装等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能。与传统的荧光染料相比，荧光纳米粒子具有更高的亮度和光稳定性，也能更加容易地实现水分散性和生物相容性。另外，随着纳米制备技术的进一步提高，对纳米粒子的尺度的精确控制及对粒子功能化手段的日臻完善，这在很大程度上使荧光纳米粒子满足了化学传感器、生物探针等领域的要求。目前荧光纳米粒子主要有无机发光量子点、荧光高分子纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子三大类。 1.1.量子点 量子点(quantum dot, QD)又可称为半导体纳米微晶体，是由数百到数千个原子组成的无机纳米粒子，是一种由II-VI 族或者III-V 族元素组成的纳米颗粒。目前研究较多的主要是CdX(X = S、Se、Te)。量子点粒径很小，它们的电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光。量子点的体积大小严格控制着它的光谱特征。量子点的晶体颗粒越小，比表面积越大，分布于表面的原子就越多，而表面的光激发的正电子或负电子受钝化表面的束缚作用就越大，其表面束缚能就越高，吸收的光能也越高，即存在量子尺寸效应，从而使其吸收带蓝移，荧光发射峰也相应蓝移。可见，相对于其他传统的荧光染料而言，量子点由于其量子尺寸效应，粒径不同或组成材料不同即可发射不同颜色的荧光。由于量子点潜在的应用前景，研究者在量子点的制备方面展开了一系列的研究。 目前，量子点的制备方法根据其所用材料的不同，有以下两种方法：一、在有机体系中采用胶体化学方法以金属有机化合物为前体制备量子点，二、在水溶液中直接合成。在有机体系采用胶体化学方法制备量子点的研究中，Bawendi等将金属有机化合物注射入热的有机溶剂中，在高温下制备出具有单分散性的CdSe量子点。后来，人们使用无机物来钝化颗粒表面，发展了核壳结构的量子点。peng等人以CdO或Cd(Ac)2为原料，在一定条件下与S、Se、Te的储备液混合，一步合成了性能良好的CdS、CdSe、CdTe量子点。Nie等以此法合成了CdSeTe量子点，其荧光发射最大的波长为850 nm，量子产率高达60%。该法不但克服了先前合成方法中需要采用(CH3)2Cd作为原料的缺点，而且所合成的量子点荧光量子产率高、尺寸分布窄、波长覆盖范围广。此外，Reiss等人在Peng的基础上以CdO为前体在HDA-TOPO混合体系中合成CdSe，然后以硬脂酸锌为锌源，在CdSe的表面包覆一层ZnSe，首次合成了CdSe/ZnSe核壳结构的量子点，荧光量子产率高达85%。另外，也有研究者采用在水溶液中进行量子点的合成，Weller等人以六偏磷酸钠及巯基乙酸、巯基乙胺等巯基化合物为稳定剂，以Cd(ClO4)2?6H2O为镉源合成了水溶性的CdS、CdSe、CdTe量子点。该法操作简单、可制备的量子点种类多、所用材料价格低、毒性小，且量子点表面修饰有可直接与生物分子偶连的羧基或氨基等官能团。然而，采用在水溶液中合成量子点的方法存在着量子产率不高、尺寸分布较宽等缺点。所以，目前人们仍较多的采用在有机体系中进行量子
实时荧光定量pcr步骤
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
荧光探针在蛋白质研究中的应用
第13卷 第3期1998年6月荧光探针在蛋白质研究中的应用 Ξ王守业 余华明 张祖德 刘清亮 (中国科技大学化学系 合肥230026) 大学化学 摘要 荧光探针技术是研究蛋白质在水溶液中构象的一种有效方法。利用它可以测定蛋白 质分子的疏水微区内两基团的距离以及酶与底物结合过程中蛋白质构象的变化等。本文综述了荧光探针技术在蛋白质研究中的一些进展。 一、 引言 荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究在溶液中蛋白质构象的一种方法。该方法的最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围。荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象,主要是因为其具有特殊的光物理性质,如在不同极性介质中有着不同的光谱特性(即不同的峰值波长),不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此,测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化,就可探知其所处微环境的极性及其他有关性质。利用荧光探针技术研究蛋白质在溶液中的构象有两种方法:一种是测定蛋白质分子的自身荧光,即“内源荧光”,另一种是利用荧光探测剂,即“外源荧光”。若引人的荧光探测剂为有机分子,则该分子叫做有机荧光探针;若引入的荧光探测剂为稀土离 子(如铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ )等),则该离子叫做稀土离子荧光探针。 二、 荧光探针的某些光物理和光化学特征 1. 有机荧光探针的某些特征 最常用的有机荧光探针物质有12苯胺基萘282磺酸(ANS ),22对甲胺萘262磺酸(2062TNS )和12N 0N 2二甲胺基萘252磺酸(1052DNS )(dansyl acid ),其结构如图1:θθSO -3 N θH θθSO -3N H θ H 3C θθS O O Cl N H 3C CH 3 1,82ANS 2,62TNS 1,52DNS 2Cl 图1 1082ANS,2062TNS 和1052DNS 2Cl 的结构 这些化合物在水溶液中基本不发荧光,量子产率低(低于0.1),但在非极性溶剂中,其量子产率大增,荧光峰蓝移,且能和许多蛋白质结合。这种探针分子溶液的荧光光谱因溶剂极 Ξ本文为国家自然科学基金资助项目。
相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项
相对定量方法实际操作 （三种常用方法） 本人用的是相对荧光定量PCR法，在分子水平上比较课题中5种新基因的表达差异。实验进行很多次，感受颇深，同时遇到了一些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同行朋友一起探讨和指教。 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个 基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 公式： P1 P2 相同的样品在两页里命名成相 同的名称，并定义为unknown 分别分析P1和P2页 选delta-delta Ct选项 依次填入，并定义对照样品 完成分析 F=2— 待检样品看对照组目的 基因平均Ct 对照组看家 — 待检样品目 ——
Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点 是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真 实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基 因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于 0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量 分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 应用实例：
荧光探针的发展和应用
Supplementary materials for: Perylene diimide based “turn-on” fluorescence sensor for detection of Pd2+ in mixed aqueous media Hai-xia Wang a, b,*, Yue-he Lang a, Hui-xuan Wang a, Jing-jing Lou a, Hai-ming Guo a, b, Xi-you Li c,* a School of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory of Green Chemical Media and Reactions of Ministry of Education, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China b School of Environmental Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China email: hxwang5270@https://www.360docs.net/doc/dd7581491.html, (H. Wang) c School of Chemistry an d Chemical Engineering, Shandong University, Jinan 250100, China email: xiyouli@https://www.360docs.net/doc/dd7581491.html, (X. Li) Contents Page S1: Title of the paper, authors along with the contents. Page S2-S4: Copy of the 1H and 13C NMR spectra of PDI-1, PDI-2 and PDI-3. Page S5:Photophysical properties of PDI-1, PDI-2and PDI-3derivatives in different solvents at room temperature; Fluorescence spectra change of PDI-2and PDI-3 upon addition of different metal(8.0 equiv) ions; UV-vis spectra of PDI-1 (6.0 μM) in the presence of different metal ions (8.0 equiv). Page S6: Job’s plots in DMF/H2O (v/v, 7/1) and acetonitrile; Fluorescence spectra changes of PDI-1 (5.0 μM) in the presence of Pd2+in acetonitrile and chloroform;ESI mass spectra of PDI-1 in the presence of 1.0 equiv PdCl2 in CH3CN. Page S7: Job’s plots of PDI-1 (5.0 μM)in the presence of Pd2+in chloroform; Influence of pH on fluorescence intensity of PDI-1 (5.0 μM) in the absence and presence of 1.0 eq Pd2+; Benesi-Hildebrand analysis results.