环境微生物实验课教学大纲

《环境微生物学》实验教学大纲

课程编号:

课程名称：环境微生物

课程类型:必修课

学时：12

适用对象: 环境科学与工程系高职高专学生

先修课程：环境微生物学、生物化学等

一、课程性质、目的和任务

1．使学生掌握研究与应用环境微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事环境工程学科的基础理论研究与污染物的生物处理方法中微生物学实验技能。

2．与环境微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，在实践中掌握熟练的操作技能，提高学生的综合能力。

3．提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，知道如何研究环境中的微生物以及对研究中所出现的问题加以分析和解决。

二、教学基本要求

1．观察和掌握微生物的显微特征和培养特征；

2．学习和掌握微生物显微观察技术、无菌操作技术、分离纯化技术、纯培养技术及基本的监测检测技术等基本技术；

3．通过综合性、设计性实验，培养学生分析问题、解决问题和创新精神以及团队合作的精神和创新意识。

三、实验内容及学时分配

正文为宋体，5号字（此部分根据具体实验项目列出具体内容及要求）

实验一显微镜的使用及微生物形态观察（2学时）

一、目的

1.掌握显微镜的使用方法。

2.通过实验学习观察微生物形态的基本方法，了解细菌、真菌和放线菌的形态特征。

二、原理

微生物都是个体微小的生物，用肉眼不能看到它们的个体，所以观察它们的形态必须在显微镜下进行，另外微生物细胞具有较高的透明性，所以有些微生物（尤其是细菌和放线菌）需经过染色后才能观察清楚，细菌个体很小，其大小以微米计，所以需要在油镜下观察。放线菌和霉菌的个体一般呈丝状，并且明显地分为基质菌丝和气生菌丝。成熟的个体还具有各种形态的孢子。因此观察内容包括基质菌丝、气生菌丝和孢子的形态，并注意它们的区别。

三、材料和用品

1、显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、解剖针、刀片

2、细菌和真菌玻片标本、霉菌试管培养物

3、染色液：石炭酸复红染色液

吕氏美兰染色液

乳酸石炭酸棉兰染色液

四、微生物形态观察

(一) 细菌形态观察

1、将细菌示范片置于镜台上，用标本夹住。

2、在低倍镜下，调节粗调节器和细调节器，使物像清楚；然后调节推进器，使观察

对象处于接物镜的正下方，调节入射光强度，使明亮度适宜，认真观察标本。最

后将观察对象移至视野中心，准备在高倍镜下观察。

3、将高倍接物镜头转至正下方，转换接物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与

玻片相接损坏镜头。调节入射光强度，使明亮度适宜，再用调节器调至物像清楚，

认真观察标本。再将观察部位移至视野中心，准备油镜观察。

4、油镜观察方法

(1)用粗调节器将镜头提起约1厘米，将油镜头转至正下方。

(2)在玻片标本的镜检部位滴一滴香柏油

(3)一面从侧面观察，一面用粗调节器将镜头器小心调节至几乎与标本相接触。

调节时应特别小心，注意不能使镜头接触标本片，用力过猛不仅会压碎玻片，也

会损坏镜头。

(4)一边从目镜观察，一边调节光线强度，使明亮度适宜；然后用细调节器校正

焦距，直至能清楚地观察到物像，再认真观察，记下观察结果。

(二) 真菌形态观察

1. 玻片标本观察

2. 霉菌试管培养物观察

(1)于洁净的载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉兰染色液，用解剖针从菌落的

边缘处取少量带有孢子的菌丝于染液中，再细心地把菌丝挑散开，然后用盖玻

片盖上，注意不要产生气泡。

(2)置显微镜下观察，先在低倍镜下观察，必要是再换高倍镜观察。

(3)记录观察结果。

五、实验报告

1、绘图说明所观察的细菌和霉菌的形态特征，并比较细菌和霉菌形态上的异同。

实验二显微镜直接计数法（2学时）

一、目的

1.明确显微镜计数的原理

2.学习使用血球计数板进行微生物计数的方法

二、原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。计数室的容积一定（0.1mm3），可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。此法计得的是活菌体和死菌体的总和。

血球计数板有两个方格网，每个方格网共分9个大方格，中间的大方格为计数室，微生物的计数在计数室中进行。

计数室的刻度一般有两种规格，一种为16*25型，一种为25*16型。

三、器材和用品

显微镜、血球计数板、盖玻片无菌毛细管酿酒菌悬液

四、操作步骤

1.稀释

将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

2.镜检记数室

在加样前，先对记数板的记数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行记数。

3.加样品

将清洁干燥的血球记数板盖上盖波片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液

由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进行计数

室，一般进行计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。

4.显微镜计数

静止五分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位

置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释

度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜。每个计数室选5

个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只

数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌

体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

5.清洗血球计数板

使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水柱冲洗，洗完后晾干。镜检，观察每小

格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

五、实验报告和思考题

1.结果

将结果记于下表。A表示中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。

2.思考题

根据你实验的体会，说明用血球计数板的误差主要来自那些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？

实验三培养基的制备和灭菌（4学时）

一、目的

学会一般培养基的制备原理、方法、掌握培养基及器皿的灭菌方法

二、原理

培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物配置而成的基质。其中除含有水份、碳水化合物、含氮化合物和无机盐外，有的还需要维生素。以提供微生物新陈代谢所需要的能源、碳源、N源和其它化合物，由于不同微生物对营养物质的要求不同，因此，需提供不同种类的培养基。一般培养基细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基。

培养基除了要满足微生物所要求的各种营养条件外，还应保证微生物所需要的其它生活条件，如适宜的酸碱度，渗透压等，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的pH范围，如细菌、放线菌培养基为中性；霉菌、酵母菌培养基为弱酸性。

根据研究目的的不同，可以将培养基制成固体，半固体和液体三种形式。固体培养基的成分与液体相同仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物。通常加入1.5～2.0的琼脂，半固体加入0.3～0.5的琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶。

三、材料与用具

（一）材料：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl；1mol/L NaOH,，1mol/L HCL

（二）用具：试管、锥形瓶、漏斗、量筒、移液管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、pH试纸、漏斗架、止水夹、台秤、硫酸纸、药匙、防潮纸、线绳、标签纸、

剪刀、解剖刀、镊子、白瓷盘、铁丝筐。

四、方法

（一）培养基的制作方法

1、称量：按照培养基的配方，准确称取各成分于烧杯中。

2、溶化：向上述烧杯中加入所需要的水量，搅动，然后加热使其溶解。

3、调节pH值：用0.1N NaOH或1N HCl调至合适的范围。

4、过滤：用滤纸或双层纱布（中间夹一层脱脂棉花）趁热过滤。

5、分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管后三角瓶内，管（瓶）

口塞上塞子。

（1）液体：分装高度以试管高度的四分之一左右为宜；

（2）固体：分装试管，每管为管高的五分之一，灭菌后制成斜面，分装三角瓶的容量以不超过三角瓶的一半为宜。

（3）半固体：分装试管一般以管高的三分之一为宜。灭菌后垂直待凝成半固体深层琼脂。

6、塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉花，以阻止外界微

生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

7、灭菌：高压蒸汽灭菌，一般培养基1.05公斤/厘米2，灭菌20～30分钟。

图3—1 培养基的分装

（二）培养基配制的步骤，按下列培养基配方配制培养基。

肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）

牛肉膏5g 琼脂20g

蛋白胨10g 蒸馏水1000ml

NaCl 5g pH 7.2—7.4

（三）、培养基制作注意事项

1、加热溶化过程中，要不断地搅拌，以免琼脂或其它固体物质粘在烧杯底上烧焦，以

致烧杯破裂。加热过程中所蒸发的水分应补足。

2、pH值须按各种不同培养基的要求而准确测定。

1、所用器皿要洁净，勿用铁制或铜制器皿。

2、分装培养基时，注意不得使培养基在瓶口或管口壁上端沾染，以免浸湿棉塞引起染

菌污染;

3、培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证杀菌效果和不损

坏培养基的必要成分。

图3—2 棉塞

图3—3 斜面的摆法

（四）、灭菌

1、培养基的高压蒸汽灭菌

（1）需灭菌的物品、棉塞等用防潮纸包好（防止锅内水蒸汽把棉塞淋湿），放入灭菌锅内，放入锅内的材料要摆的疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响杀菌效果。

（2）关闭灭菌锅盖，切勿漏气。

(3)慢慢打开蒸汽口，不要使蒸汽过猛地冲入锅内，排除一部分冷气，关闭排气开关，

先使夹套升温至压力表为0.5公斤/厘米2，再使内层压力升至0.5公斤/厘米2，然后开启排气开关，使夹套及锅内冷气除尽。

（4）关闭排气开关后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时温度和压力都上升，当温度升至121℃，压强达到1.05公斤/厘米2时，保持20—30分钟，即达到灭菌目的。

（5）灭菌完毕，关闭进汽开关，或切断电源，待压力降至“0”时，打开排气开关，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基沸腾，使棉塞玷污，甚至冲出容器以

外。

（6）打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。

2、干热灭菌法

常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用干热法灭菌，

进行灭菌时，先将要灭菌器皿（培养皿、移液管的包装方法见示范）包好，放入烘箱内。调节温度至160—170℃维持1—2小时（当温度升至80℃以上后切勿打开烘箱门，以免引起玻璃器皿破裂和火灾）。灭菌后当温度降至30—40℃时，打开箱门，取出灭菌器皿。五、实验报告

思考题

1.培养微生物的培养基应该具备哪些条件？为什么

2.培养基为什么要灭菌后再用？如何检查所配好的培养基是无菌的？

实验四微生物的接种（2学时）

一、目的：

1.掌握微生物的接种技术

二、材料与用具

材料：菌种，牛肉膏琼脂培养基，酒精灯，接种环，火柴等

三、操作步骤

1.平板的制作和培养

将已灭菌的固体培养基融化后（水浴融化）冷到45-50℃（温度过高，培养皿盖上凝结水太多，菌易被冲掉或烫死；温度过低，则培养基凝固，不易倒出）。右手拿培养基，左手把皿盖打开一逢倾入培养基15-20毫升迅速盖妥，平放桌上，轻轻旋转，使培养基与土壤稀释液充分混匀，凝固后，即成平板，将培养皿倒置于培养箱中培养，细菌即在所固定的位置长成肉眼可见的菌落。

2.接种方法

I．斜面接种技术

（1）试管先贴上标签，注明菌名，日期和姓名，然后将菌种斜面和欲接种斜面试管放在左手食指.中指和无名指之上，大拇指按在二管中央，菌种管口在外方，

斜面稍朝上（图4－1（a））

（2）先将棉塞用右手扭转松动，以利接种时拔出

（3）右手拿接种环末端，使其垂直于火焰中，烧红灭菌

（4）用右手小指，无名指和手掌拔下棉塞(图4－1(b))

（5）以火焰烧管口，烧时应不断转动试管口，使试管口沾染的少量杂菌被烧死(图4—1(c))

（6）将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体取出少许，慢慢将接种环抽出试管

图（4－1（d））

（7）迅速将接种环在火旁伸进欲接种试管，在培养基上轻轻划线，划线时要由底部到顶部，由下而上，但不要把培养基划破，也不要使菌种污染管壁（4－1（e））（8）烧试管口，并在火旁将塞塞上，塞棉塞时，不要用试管去通棉塞，以免试管在运动时污染杂菌（图（4－1（f，g））

（9）将接种环在火焰上再烧红灭菌，放下接种环后，再腾出手将棉塞塞紧（图（4－1（h））

II．液体接种（由斜面培养基接入液体培养基内）

(1)操作方法与前相同，但要使试管向上略斜，以免液体培养液流出。

(2)将取有菌种的接种环送入液体培养基时，要使环在液体表面与管壁接触的部分轻

轻打动，使菌体在培养基中分散出来，放置于37 ℃温箱中培养。

III穿刺接种

将取有菌种的接种针自固体培养基的中心刺入，直到管底，但不可刺穿，然后拔出，塞棉塞，置37 ℃温箱培养。

图4—1 斜面接种

四、思考题：

1. 微生物接种应注意的问题？

2.培养微生物应考虑哪些原则？培养时，为什么要把已接种的培养皿倒置保温培养。

实验五革兰氏染色及镜检（2学时）

四、考核方式

平时实验考核和期末总考试相结合。

五、推荐实验教材和教学参考书（黑体，小4号字）

实验教材：

[1] 肖琳等. 环境微生物学实验技术，中国环境科学出版社，2004

其他参考书：

[1] 钱存柔，黄仪秀．微生物学实验教程．北京：北京大学出版社，1999

[2] 黄秀梨.微生物学实验指导.高等教育出版社,2000

[3] 范秀荣,李广武,沈萍.微生物学实验.高等教育学出版社,1991

六、说明（黑体，小4号字）

大纲制订人：郑辉

大纲审定人：

制订日期：2008-3-30