细菌分离培养相关技术及应用

实验二 细菌分离培养相关技术及应用

（Bacterial Isolation and Culture：Some Techniques and Applications）

一、无菌操作技术（Aseptic technique）

【实验目的】

认识无菌操作的重要意义，学习基本的无菌操作方法。

【实验原理】

（一） 无论在研究实验室、临床实验室还是教学实验室，保证实验用或检测用微生物材料不被其他微生物污染是非常重要的；此外，保证实验人员不被这些微生物感染也非常重要。因此，在接种细菌时，要求所用物品如培养基、玻璃器皿和器械等必须灭菌；空间应进行紫外线消毒；操作者应穿隔离衣，必要时应带口罩、帽子和医用手套。除此之外，对接种操作技术本身也要求做到防止污染和感染的发生，这种防止污染和感染发生的接种技术称为无菌操作技术。

（二）培养细菌常用的接种工具有接种环、接种针、涂布棒、吸管和酒精灯。

1.接种工具：接种环（针）是由白金丝或镍合金丝制成。接种环是在金属丝前端卷成一直径2mm~3mm小环又称白金耳。用于细菌分离接种或纯培养接种。接种针多用于半固体培养基穿刺接种。涂布棒一般为前端成三角形的玻璃小棒，用于细菌在固体培养基上进行大面积均匀涂布。吸管可用于菌液的大量和定量接种。

2.无菌操作技术（见图1‐2‐1）：用接种环（针）取菌时，先将接种环以45度角插入酒精灯火焰的内焰（黄色火苗处，温度最低，防止过热造成的崩溅）处烧灼片刻，再移至外焰（蓝色火苗处，温度最高）烧灼片刻，之后将接种环横过来水平移动，烧灼全部镍铬丝部分。以无菌操作手法打开培养物，将烧灼灭菌的接种环（针）在琼脂表面或试管壁上冷却6~8秒，取少许菌苔或菌液，同样以无菌操作的手法接种至新鲜培养基内（单菌落划线分离或集接种等）。取菌时如果接种环过热，接触菌液或菌苔时易产生感染性气溶胶，引起自身感染或污染环境，也会杀死菌种。接种应在火焰附近进行，蘸有细菌的接种环（针）不能碰触衣物和操作台等其它物品。接种结束要立即将染菌金属丝用火焰灭菌，并将接种柄置于接种架上（不得随手乱放）。用吸管接种时，吸管吸取的菌液在离开标本管液面时，吸管尖端应存有一段空气，以防止在吸管移动时菌液滴在台面上。用涂布棒或吸管接种时，接种完毕的器具应放于消毒液中。所有无菌操作完毕，应将带有细菌物品妥善处理，并将其空间进行紫外线消毒。

图1‐2‐1. 无菌操作技术示意图。

【实验材料】

（一）试剂：LB琼脂培养基。

（二）器械（仪器）：接种环、酒精灯、恒温培养箱。

（三）菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）菌液。

【实验步骤】

（一）按无菌操作手法，用接种环从大肠埃希氏菌菌液中取一环细菌。

（二）用无菌操作手法，将接种环上的细菌接种到LB琼脂培养基上。

（三）将接好种的培养皿倒置放在37℃恒温培养箱中，培养24h。

（四）从培养箱中取出培养皿，观察其上细菌生长情况，从菌苔（落）特点判断是否有杂菌污染，以判断无菌操作是否合格。

【注意事项】

（一）热的接种环应在培养基无菌生长区稍加降温后，再刮取细菌。否则易损伤细菌且易产生微生物气溶胶引起感染。

（二）细菌培养时，培养皿应底部朝上倒置放在培养箱中。因为皿盖朝上正向放置时，37℃条件下培养基中水分挥发可凝集在皿盖上，形成液滴，液滴滴落在琼脂表面，易引起培养物污染或单菌落连接在一起成片生长。

二、细菌的分离和纯培养法（Methods of bacterial isolation and pure culture）

【实验目的】

了解细菌分离和纯培养的常用方法，掌握用三划线法分离获得单菌落的操作技术。 【实验原理】

细菌分离培养法也叫细菌分离接种技术，即应用接种环将细菌在固体培养基平板上划线（streak plate technique）接种，将混杂细菌逐一分散成单个，经培养后各自形成单个菌落，将单个菌落移种增殖后可得到纯种细菌。图1‐2‐2中介绍了几种划线分离方法，其目的都是把细菌分散越开越好。但应注意每划完一个区域，都要将接种环灭菌后再从菌稀的地方划另外部分。

图1‐2‐2. 在培养基平板上划线分离细菌的不同划线接种法示意图。选择图中a~d哪种划线接种模式，取决于样品中微生物浓度的情况。微生物浓度越高，划线次数越多。但是，不论划几次线，切记在不同划线之间，一定要将接种环火焰灭菌。

在分离出单个菌落的基础上，将某纯种细菌移种增殖称细菌纯培养。细菌纯培养接种技术按使用培养基的固体、半固体和液体状态，可分为平板接种法、斜面接种法、半固体接种法和液体接种法。

纯培养的平板接种法与平板分离划线接种法接种手法相同，只是不必分出单个菌落。

斜面接种法是在固体培养基斜面上移种纯种细菌，常作为菌种传代和观察细菌某些生化反应用，如尿素分解试验和枸橼酸盐利用试验。

半固体培养基接种法，也称穿刺接种法，是使用接种针在半固体培养基表面中心位置，沿中轴方向垂直刺入培养基至3/4深度进行接种。用于细菌动力观察、保存菌种及观察某些细菌生化反应（醋酸铅试验和明胶液化试验等）。

液体培养基如消化肉汤、蛋白胨水、单糖发酵管等，可应用于细菌的增菌或细菌生化反应。不同的细菌在液体培养基内可呈现不同生长现象，主要有混浊生长、沉淀生长和菌膜（状）生长。

【实验材料】

（一）试剂：LB琼脂培养基

（二）器械（仪器）：接种环、酒精灯、恒温培养箱。

（三）菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）菌液。

【实验步骤】

（一）左手执装有大肠埃希氏菌菌液的试管，右手执接种环，将接种环用火焰灭菌后，以右手小指打开试管盖，并用冷却后的接种环沾取细菌，将试管口烧一下，盖上盖，放回试管架。

（二）按图1‐2‐2c所示三划线方法进行单菌落分离。具体操作如下：左手将装有LB琼脂培养基的培养皿平托于手掌上，用手指将平皿盖呈15度角打开，并靠近火焰无菌区（火焰半径5cm范围内），用蘸有细菌接种环于平皿一侧之上端进行第一次划线；盖上皿盖，将接种环用火焰灭菌后，将培养皿旋转一定角度后，如图1‐2‐2C所示进行第二次划线；同样火焰灭菌接种环后进行第三次划线。

（三）接种完毕，将右手的接种环灭菌后插在专用架上，左手盖上平皿盖并翻转平皿使其底部朝上。在平皿底部注明标本名称、接种人、接种日期、班级和实验室号，然后倒置放入37oC恒温培养箱中，培养24h。

（四）从培养箱中取出培养皿，观察其上细菌生长情况，单菌落一般出现在第二次或第三次划线的接种线上。

【注意事项】

（一）为防止空气中杂菌污染琼脂平板，划线接种时动作要迅速准确，打开平皿盖的时间要尽量缩短。

（二）划线接种时，接种环与培养板表面呈15度~20度斜角，划线动作要轻，用力过大会划破琼脂面。

（三）沾有细菌的接种环、涂布棒、吸管头不得碰触其它物品。用吸管吸取的菌液在离开标本管液面时，吸管尖端应存有一段空气，以防止在吸管移动时菌液滴在台面上。

三、观察常见病原菌的典型菌落特点（Observation of the characteristics of typical colonies of commonly found pathogenic bacteria）

【实验目的】

细菌分离培养技术的最常见应用是利用各种固体培养基及单菌落分离技术，获得某种细菌的单菌落，用于进一步的鉴定和研究。

本实验的目的是使学生熟悉常见病原菌分离培养的常用培养基，并认识这些病原菌在这些培养基上产生的典型菌落的形态特点。

【实验原理】

在固体培养基上，由一个细菌经生长繁殖形成肉眼可见的细菌集落称菌落（colony）。

不同细菌在一定条件下形成的菌落其特征有一定的稳定性和专一性，有初步鉴别价值。但要注意细菌生长受到理化因素及遗传变异影响，可改变菌落形态或出现不典型菌落。

以下是描述菌落特征的常用术语：

（一）颜色（colour）：细菌产生的色素一般有水溶性色素和脂溶性色素。肉眼观察可见，水溶性色素使培养基染上颜色，脂溶性色素只造成菌落本身出现颜色，培养基还是原来颜色。

（二）边缘（edge）：整齐、波状锯齿状、丝状和羽毛状等。

（三）溶血性（hemolysis）：当用新鲜的血平板培养某些细菌时，会看到菌落周围出现溶血现象。根据溶血能力的不同，可将其分为α‐溶血（不完全溶血，草绿色半溶血环）、β‐溶血（完全溶血，透明溶血环）和γ‐溶血（不溶血）三种类型。（四）形状（shape）：圆形、针尖状（直径小于1mm）、不规则。

（五）大小（size）：以mm计。

（六）表面（surface）：光滑、粗糙、同心圆、放射状和乳突状等。

（七）质地（texture）：粘性、蜡质、膜样和奶油样等。

（八）厚度（thickness）：扁平、凸起和脐形。

（九）透明度（transparency）：不透明、半透明和透明。

（十）菌落类型：光滑型菌落（smooth colony），粗糙型菌落（rough colony）和粘液型（mucous colony）。

【实验材料】

菌种：在特定培养基上生长的常见病原菌（表1‐2‐1），均已分离出单菌落。

【实验步骤】

依次观察以下各种细菌在特定培养基上的菌落特点（表1‐2‐1）。

表1‐2‐1常见病原菌在特定培养基上的菌落特点

菌种 培养基 值得关注的菌落特征

金黄色葡萄球菌 普通肉汤琼脂 圆、隆起、光滑、湿润、边缘整齐、不透明、1

－2mm，金黄色

血琼脂平板 有β‐溶血

表皮葡萄球菌 普通肉汤琼脂 与金黄色葡萄球菌类似，但为白色或柠檬色，

较大

血琼脂平板 一般无溶血环

甲型溶血性链球菌 血琼脂平板 细小、暗灰色、周围有窄半透明溶血环

乙型溶血性链球菌 菌落中等偏小、灰白发乳光、周围有宽透明溶

血环

肺炎链球菌菌落 开始较小，经48h以上时间培养逐渐增大，菌

落中央可出现自溶现象，呈“肚脐”状，周围有半

透明溶血环

脑膜炎奈瑟氏菌 巧克力色培养基 圆形隆起、表面有光泽、无色透明或浅蓝半透

明、0.1‐0.5mm、粘液型、早期培养似露滴故称

露滴状菌落

淋病奈瑟氏菌 圆形隆起、表面有光泽、无色透明或灰色半透

明、0.1‐0.5mm、边缘整齐、光滑型

大肠埃希氏菌 普通肉汤琼脂 2‐3mm圆形凸起、灰白色、光滑型菌落、湿润、

边缘整齐

血琼脂平板 有些菌株有β溶血

痢疾志贺氏菌 普通肉汤琼脂 半透明、光滑型、约2mm

伤寒沙门氏菌 普通肉汤琼脂 圆形、湿润、边缘整齐、无色、半透明、光滑、

2‐3mm

白喉棒状杆菌 吕氏培养基 细小、约1mm、灰白色、不透明、湿润、边缘

整齐、圆形突起、光滑型

亚碲酸钾血琼脂 还原亚碲酸钾为元素碲，菌落为黑色，有鉴别

意义

炭疽芽孢杆菌 普通肉汤琼脂 灰白色、无光泽、不透明、扁平、个大、干燥、

边缘不整齐、粗糙型

含NaHCO3血琼脂平板 有毒株可产生荚膜，呈粘液型菌落，菌落周围一般不溶血或轻微溶血

铜绿假单胞菌 普通肉汤琼脂 大小不一、平均2‐3mm，扁平、边缘不整齐、

常称互相融合状态、培养基变蓝绿或黄绿色 血琼脂平板 有金属光泽、有生姜气味、较大、有透明溶血

环

破伤风梭菌 血琼脂平板

薄、扁平、中心细密而四周疏松似羽毛状不规则菌落。短时间培养有半透明溶血环；长时间培养有透明溶血环。培养时间过长菌落可遍布整个平板无法辨认

产气荚膜梭菌 中等大、灰白色、湿润、凸起、边缘整齐、光

滑型菌落；有双层溶血环、内环（θ毒素完全溶

血）、外环较宽（α毒素不完全溶血）

结核分枝杆菌 罗氏培养基 米黄色或乳白色、不透明菌落，表面粗糙呈颗

粒、结节或菜花状

【注意事项】

（一）观察时不要打开培养皿盖子，防止污染和感染的发生。

（二）对某种细菌菌落特征的描述不能脱离所用的培养基，所以在观察时除关注菌落特征外，一定要清楚所用培养基为何。