支链淀粉直连淀粉
直链淀粉和支链淀粉的测定(双波长法)
一、目的
淀粉一般都是直链淀粉和支链淀粉的混合物。直链淀粉和支链淀粉含量和比例因植物种类而不同，决定着谷物种子的出饭率和食味品质，并影响着谷物的贮藏加工。通过本实验学习掌握双波长测定谷物中直链淀粉和支链淀粉的含量。
二、原理
根据双波长比色原理，如果溶液中某溶质在两个波长下均有吸收，则两个波长的吸收差值与溶质浓度成正比。
直链淀粉与碘作用产生纯蓝色，支链淀粉与碘作用生成紫红色。如果用两种淀粉的标准溶液分别与碘反应，然后在同一个坐标系里进行扫描（400 - 960 mm）或做吸收曲线，可以得
到图所示结果。
图作图法选择淀粉的测定波长
图中1 为直链淀粉的吸收曲线，2 为支链淀粉的吸收曲线。对含有直链淀粉和支链淀粉的未知样品，与碘显色后，只要在选定的波长λ1 ，λ 2 ，λ 3 ，λ 4 ，处作 4 次比色，利用直链淀粉和支链淀粉标准曲线即可分别求出样品中两类淀粉的含量。
三、仪器、试剂和材料
1. 仪器
（1）电子分析天平
（2 ）索氏脂肪抽提器 1 套
（3 ）分光光度计1 台
（4 ）pH 计
（5 ）容量瓶100ml X 2 ，50ml X 16
（6 ）吸管0.5ml X 1，2ml X 1，5ml X 1
2. 试剂
（1）乙醚或石油醚（沸程30-60 ℃）
（2 ）无水乙醇
（3 ）0.5 ml / L KOH 溶液
（4 ）0.1 mol / L HCl 溶液
（5）碘试剂：称取碘化钾 2.0g，溶于少量蒸馏水，再加碘0.2g，待溶解后用蒸馏水稀释定容至l00ml.
（6）直链淀粉标准液：称取直链淀粉纯品0.1000g，放在100ml 容量瓶中，加入0.5mol/ L KOH 10ml，在热水中待溶解后，取出加蒸馏水定容至100ml，即为1mg/ml 直链淀粉标准溶液。
（7）支链淀粉标准液：用0.1000g 支链淀粉按（6）法制备成1mg/ml 支链淀粉标准溶液。
3. 材料
供试谷物粉。
四、操作步骤
1 .选择直链、支链淀粉测定波长、参比波长。
直链淀粉：取1mg/ml 直链淀粉标准液1ml，放入50ml 容量瓶中，加蒸馏水30ml，以0.1 mol/ L HCl 溶液调至pH 3.5 左右，加入碘试剂0.5ml，并以蒸馏水定容。静置20min ，以蒸馏水为空白，用双光束分光光度计进行可见光全波段扫描或用普通比色法绘出直链淀粉吸收曲线。
支链淀粉：取1 mg/ml 支链淀粉标准液1ml，放入50ml 容量瓶中，以下操作同直链淀粉。在同一坐标内获得支链淀粉可见光波段吸收曲线。
根据原理部分介绍的方法，确定直链淀粉和支链淀粉的测定波长、参比波长λ 2 、λ 1 、λ 4 和λ 3 。
2 .制作双波长直链淀粉标准曲线：吸取1mg/ml 直链淀粉标准溶液0.
3 、0.5 、0.7 、0.9 、1.1 、1.3 ml 分别放入6 只不同的50ml 容量瓶中，加入蒸馏水30ml ，以0.1 mol/ L HCl 溶液调至pH 3.5 左右，加入碘试剂0.5 ml，并用蒸馏水定容。静置20min，以蒸馏水为空白，用1cm 比色杯在λ1、λ 2 两波长下分别测定A λ1，A λ 2 即得△A 直= A λ 1 - A λ 2 以△ A 直为纵坐标，直链淀粉含量（mg ）为横坐标，制备双波长直链淀粉标准曲线。
3 .制作双波长支链淀粉标准曲线：吸取1mg/ml 支链淀粉标准溶液2.0，2.5 、3.0 、3.5 、
4.0 、4.5 分别放入6 只不同的50ml 容量瓶中。以下操作同直链淀粉。以蒸馏水为空白，用1cm 比色杯在λ 3 ，λ 4 两波长下分别测定其A λ3，A λ 4 即得△A 支= A λ
4- A λ3。以△A 支为纵坐标，支链淀粉含量（mg ）为横坐标，制备双波长支链淀粉标准曲线。
4. 样品中一直链淀粉、支链淀粉及总淀粉的测定：样品粉碎过60 目筛，用乙醚脱脂，称取脱脂样品0.1g 左右（精确至1mg ），置于50ml容量瓶中。加0.5 mol/ L KOH 溶液10ml，在沸水浴中加热10min，取出，以蒸馏水定容至50ml 若有泡沫采用乙醇消除），静置。吸取样品液 2.5ml 两份（即样品测定液和空白液），均加蒸馏水30ml，以0.1mol/LHCI 溶液调至pH 3.5 左右，样品中加入碘试剂0.5ml，空白液不加碘试剂，然后均定容至50ml 。静置20min ，以样品空白液为对照，用1cm 比色杯，分别测定λ2，λ1，λ4，λ 3 的吸收值A λ2，A λ1，A λ4，A λ3。得到△A 直= A λ2 - A λ 1 ，△A 支=A λ4-A λ 3 。分别查两类淀粉的双波长标准曲线，即可计算出脱脂样品中直链淀粉和支链淀粉含量。二者之和等于总淀粉含量。
五、结果处理
式中，X1 一查双波长直链淀粉标准曲线得样品液中直链淀粉含量（mg）
X2 一查双波长支链淀粉标准曲线得样品液中支链淀粉含量（mg）
m 一样品质量（g）
总淀粉（%）= 直链淀粉（%）+支链淀粉（%）
六、注意事项
因蜡质和非蜡质支链淀粉碘复合物颜色差异较大，在制备双波长支链淀粉曲线时，应根据测定的谷物类型选择不同支链淀粉纯品（蜡质或非蜡质型）。
七、思考题
1. 双波长法测定谷物中直链、支链淀粉的原理是什么？
2. 除了双波长法外，比色法（620nm ）和安培滴定法也能分别测定直链和支链淀粉。了解其原理，比较不同方法的优缺点。
直链淀粉,支链淀粉测定试剂盒(doc 11)的资料简介：
淀粉测定试剂盒
用于测定淀粉中的直链淀粉和支链淀粉含量
AMYL 11/99
简介:
决定谷物淀粉最终的特殊用途取决于淀粉众多特性中的直链淀粉/支链淀粉比率，因此，对于淀粉加工企业，淀粉中直链淀粉含量是一项非常重要的指标。测定谷物淀粉中的直链淀粉通常采用电位测定法、糊化染色法或旋光分析法，即通过测定碘与直链淀粉结合生成直链淀粉-碘复合物的方法来评估直链淀粉含量，然而由于支链淀粉-碘复合物在此过程中同样会形成，因此这些方法的准确性常遭到质疑。利用非比色方法测定游离碘离子的减少和通过比色测定直链淀粉-碘复合物的方法会导致高估直链淀粉的含量，是用此方法可能出现的更多问题请参考Gibson et al11。
目前，国际上普遍采用结果更加准确的利用伴刀豆凝集素A(Con A)沉降支链淀粉，然后测定直链淀粉含量的方法，在特定的温度、pH和离子强度下，Con A 可以特定的连接含吡喃葡萄糖基[a-D-glucosepyranosyl]或吡喃甘露基
[a-D-mannopyranosyl]的支链多聚糖，因此会优先于直链淀粉与支链淀粉形成沉淀复合物。
原理:
加入二甲基亚砜(DMSO)的淀粉样品通过加热被完全溶解，乙醇洗脱样品中的油脂，回收洗涤后的淀粉样品，并用醋酸/钠盐溶液溶解，加入Con A后支链淀粉被特异性的沉降，离心分离支链淀粉，保存于悬浮液中的直链淀粉被酶水解生成葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶测定葡萄糖的含量。溶解于醋酸/钠盐溶液中的总淀粉同样可以被水解成葡萄糖，并利用萄糖氧化酶/过氧化物酶测定葡萄糖。在510nm测定利用Con A沉降后悬浮液中GOPOD吸光度的比率变化来计算直链淀粉的浓度，同样道理可计算出总淀粉浓度。
此方法适用于所有的纯净淀粉样品和谷物面粉。
精确性:
对于纯净淀粉和~10%的谷物面粉，批内偏差<5%
试剂盒:
试剂盒内提供有足够50-100次试验用的试剂
1. 分析方法
2. 冻干Con A (200mg)
3. 淀粉葡萄糖苷酶/真菌α-淀粉酶悬浮液
4. 葡萄糖测定液
5. 葡萄糖反应缓冲液
6. 葡萄糖标准液
7. 淀粉参考标样（含有特定的直链淀粉）
安全手册:
1. 水稻、玉米、谷子籽粒直链淀粉测定法
GB 7648—87
1 适用范围
本标准适用于水稻、玉米、谷子籽粒直链淀粉含量的测定。
2 参考标准
GB 5006—85《谷物籽粒粗淀粉测定法》
GB 3523—83《谷类、油料作物种子水分测定法》
3 测定原理
淀粉与碘形成碘-淀粉复合物，并具有特殊的颜色反应。支链淀粉与碘生成棕红色复合物，直链淀粉与碘生成深蓝色复合物。在淀粉总量不变条件下，将这两种淀粉分散液按不同比例混合，在一定的波长和酸度条件下与碘作用，生成由紫红到深蓝一系列颜色，代表其不同直链淀粉与支链淀粉含量比例，根据吸光度与直链淀粉浓度呈线性关系，可用分光光度计测定。
4 仪器、设备
4.1 粉碎机（实验室用旋风磨）。
4.2 分光光度计：721型或具有相同性能的其他型号。
4.3 分析天平：感量0.0001g。
4.4 玻璃仪器：50ml具塞刻度试管，100ml容量瓶。
5 试剂配制
除注明者外均为分析纯，水为蒸馏水。
5.1 氢氧化钠（GB 629—81），1mol·L-1、0.09mol·L-1水溶液，准确标定。
5.2 冰乙酸（GB 676—78），1mol·L-1水溶液，准确标定。
5.3 碘贮备溶液及碘试剂：称2g碘和20g碘化钾（GB 1272—77）用蒸馏水溶解并稀释至100ml，即为碘贮备液。取10ml碘贮备液稀释至100ml，即为碘试剂。
5.4 马铃薯直链淀粉标准溶液：1mg/ml，取烘干（55～56℃真空干燥）的马铃薯直链淀粉纯品，称取重量相当于含0.1000g淀粉，放入100ml容量瓶中，加入1ml无水乙醇湿润样品，再加9ml1mol·L-1氢氧化钠溶液，于沸水浴分散10min，迅速冷却后，用水定容。
5.5 支链淀粉标准溶液：1mg/ml，选择与待测谷物样品相应的蜡质谷物标准品，称取重量相当于含
0.1000g粗淀粉，放入100ml容量瓶中，加1ml无水乙醇，再加9ml1mol·L-1氢氧化钠溶液，于沸水浴加热10min，迅速冷却后，用水定容。
5.6 石油醚（HG 3—1003—76），沸程60～90℃。
6 样品的选取和制备
6.1 将样品挑选干净（谷子脱壳、稻谷制成精米），按四分法取样20g。
6.2 用粉碎机将样品粉碎，全部通过0.177mm孔径筛（80号），混匀装入磨口瓶备用。
7 测定步骤
7.1 混合校准曲线绘制
取6个100ml容量瓶，分别加入1mg/ml马铃薯直链淀粉标准溶液0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00ml，再依次加入1mg/ml支链淀粉标准溶液5、4.75、4.50、4 .00、3.50、3.00ml，总量为5ml。另取1个100ml容量瓶，加入0.09mol·L-1氢氧化钠溶液5ml作空白。然后于各瓶中依次加入约50ml水、1ml1mol·L-1乙酸及1ml碘试剂。用水定容后显色10min，在620nm处读取吸光度。
以直链淀粉毫克数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制校准曲线或建立回归方程。
7.2 样品测定
7.2.1 按GB 5006—85《谷物籽粒粗淀粉测定法》和GB 3523—83《谷类、油料作物种子水分测定法》测定样品的粗淀粉含量和水分。
7.2.2 样品分散：称取相当于0.1000g粗淀粉的样品（如按样品干重计算直链淀粉百分含量时，称取样品100mg）于100ml容量瓶中，加1ml无水乙醇，充分湿润样品，再加入9ml1mol·L-1氢氧化钠溶液，于沸水浴中分散10min，迅速冷却，用水定容。
7.2.3 脱脂：取20ml分散液于50ml具塞刻度试管中，加入7～10ml石油醚，间歇摇动10min，静止15min，分层后用连接在水泵上的吸管抽吸，吸去上部石油醚层。重复以上操作2～3次（精米脱脂二次，玉米、谷子须脱脂三次）。
7.2.4 测定：吸取脱脂后的碱分散液5.00ml于100ml容量瓶中，加水50ml，再加入1mol·L-1乙酸溶液1ml及碘试剂1ml，用水定容。显色10min后，在620nm 处读取吸光度。
注：测定样品与绘制校准曲线时的温度相差不能超过±1℃。
8 结果计算
8.1 计算公式
a. 直链淀粉（％，占淀粉总量）按式（1）计算：
直链淀粉（％，占淀粉总量）=〔G×100/（m1×5）〕
×100 (1)
b. 直链淀粉（％，占样品干重）按式（2）计算：
直链淀粉（％，占样品干重）=G×100/〔m2×5×（1-H）〕
×100 (2)
式中：G—─从相应的混合校准曲线或回归方程求出的直链淀粉质量，mg；
m
──称取样品中所含粗淀粉的质量，100mg；
1
m
──称取样品的质量，100mg；
2
H──水分百分率。
8.2 结果表示
两个平行测定的结果，用算术平均值表示。保留小数点后两位。第三位数的舍入见GB 1.1—81《标准化工作导则编写标准的一般规定》附录C。
8.3 结果的允许误差
两个平行测定值的相对误差，不得超过2％。
附录A
马铃薯直链淀粉纯品制备方法
（参考件）
A.1 仪器、设备
A.1.1 离心机（4000r/min）。
A.1.2 电动搅拌器。
A.1.3 冰箱。
A.1.4 真空干燥箱。
A.1.5 磁力搅拌器。
A.1.6 232型甘汞电极或具有相同性能的其他型号。
A.1.7 213型铂电极或具有相同性能的其他型号。
A.1.8 0～1.000V毫伏表。
A.2 试剂
除注明者外，均为分析纯，水为蒸馏水。
A.2.1 氢氧化钠（GB 629—81），0.5mol·L-1水溶液。
A.2.2 盐酸（GB 622—77），1mol·L-1、1.5mol·L-1、2mol·L-1水溶液。
A.2.3 正丁醇（HG 3—1012—76）。
A.2.4 异戊醇（HG 3—996—76）。
A.2.5 碘酸钾标准溶液：称取0.1784g碘酸钾（GB 651—77，优级纯）用水溶解后，转入1000ml容量瓶中用水定容，即8.34×10-4mol·L-1。
A.2.6 碘化钾溶液：称取66.40g碘化钾（GB 1272—77）用水稀释至1000ml，即0.4mol·L-1。
A.3 制备方法
称取马铃薯淀粉10g，加少量无水乙醇使样品湿润，再加入350ml0.5mol· L-1氢氧化钠，放入沸水浴中加热搅拌20min至完全分散，冷却，以 4000r/min 离心20min，取上清液用1.5mol·L-1盐酸调至pH6.5（用pH精密试纸），然后加入1∶1（V/V）丁醇-异戊醇80ml，在沸水浴中加热搅拌10min，冷却至室温。移入冰箱内（2～4℃）静置24h去掉上层污物层，以4000r/min离心15min，弃掉上清液，沉淀物即为粗直链淀粉。
用饱和正丁醇水溶液洗涤沉淀物（粗直链淀粉），4000r/min离心15min，将沉淀物转入200ml饱和正丁醇水溶液中，在沸水浴中加热溶解（10～15min），冷却至室温，放入冰箱内（2～4℃）24h，弃去上层污物层，以4000r/min离心15min，沉淀物再加 200ml饱和正丁醇水溶液加热溶解，反复纯化三次。最后沉淀物用无水乙醇反复洗涤离心3～4次，在真空干燥箱中（55～56℃）干燥。即得直链淀粉纯品。
A.4 纯品质量鉴定
A.4.1 淀粉含量测定
称0.1000g纯品加入10ml0.5mo l·L-1氢氧化钠在沸水浴中加热分散，再加入21.5ml2mol·L-1盐酸，在沸水浴回流水解2h，用费林氏液法（GB 5513—85《粮食、油料检验还原糖和非还原糖测定法》）测定还原糖，乘以0.9即得淀粉量，计算纯品含量。
A.4.2 碘-淀粉复合物吸收光谱测定
取5.4溶液2ml（1mg/ml直链淀粉）及0.09mol ·L-1氢氧化钠溶液 3ml 加50ml水稀释后，再加入1mol·L-1乙酸溶液1ml和碘试剂1ml，用水定容至100ml，显色10min，于分光光度计测定500～800nm的吸收谱。
A.4.3 碘结合量测定
A.4.3.1 测定
称取重量相当于含0.1000g淀粉的烘干马铃薯直链淀粉纯品于100ml 容量瓶中，加几滴无水乙醇湿润后再加入0.5mol·L-1氢氧化钠溶液10ml，置沸水浴完全分散，冷却、加水定容。吸5ml（含直链淀粉5mg）分散液放入200ml烧杯中，加入85ml 水，5ml1mol·L-1盐酸及5ml0.4mol·L-1碘化钾溶液，按电位滴定装置要求，把烧杯置于电磁搅拌器上，将铂电极及甘汞电极插入液面下，在电磁搅拌下，用5ml微量滴定管滴加碘酸钾标准溶液，每次滴加0.2ml（或0.1ml），加后1min读取毫伏数，滴定终点用二次微商法计算。
A.4.3.2 计算
直链淀粉碘结合量，％=（0.6346/m）×T×100
式中：m──直链淀粉质量，mg；
T──8.34×10-4mol·L-1碘酸钾溶液滴定体积，ml；
0.6346──每毫升8.34×10-4mol·L-1碘酸钾溶液相当于碘的质量，0.6346mg。
A.4.4 马铃薯直链淀粉纯品标准
为640～650nm；b.淀粉含量在85％马铃薯直链淀粉纯品必须具备：a.λ
max
以上；c.碘结合量在19.5以上； d.，λmax在20℃时为340以上。
附录 B
水稻、玉米、谷子支链淀粉标准品的选择与制备
（参考件）
B.1 碘-淀粉复合物吸收光谱测定
取5.5溶液5ml（1mg/ml支链淀粉），加50ml水稀释后，再加入1mol·L-1乙酸溶液1ml和碘试剂1ml，加水至100ml，显色10min，用分光光度计测定400～640nm的吸收谱。
B.2 标准品的选择
水稻、玉米、谷子支链淀粉标准品可以从相应的蜡质谷物品种中选择，标准品必须分别具备：
520～530nm，，620nm，在20℃时为17以下；
水稻：λ
max
520～530nm，，620nm，在20℃时为25以下；
玉米：λ
max
530～540nm，，620nm，在20℃时为20以下。
谷子：λ
max
B.3 标准品的制备
取适量(10～20g)通过0.177～0.149mm孔径筛(80～100号)的蜡质谷粉，分别用甲醇及石油醚在索式脂肪抽提器回流脱脂16h，放入真空干燥箱烘干（55～56℃）备用，同时按 GB 5006—85测定淀粉含量。