甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-3全长cDNA的克隆和序列分析
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述
陕西农业科学 昆虫对杀虫剂的抗性机制概述 王芙蓉。吴薇 （北仑出入境检验栓疫局，浙江宁波３１５８００） 提要：昆虫抗性机制的研究对于抗性监潮、治理等具有重要意义．综述了昆虫对几种杀虫剂的抗性机制。关键词：杀虫剂；抗药性Ｉ苏云金杆菌ｌ阿维菌素 随着杀虫剂长期、大量、广泛地使用，昆虫对杀虫剂产生的抗性也越来越引起人们的关注。尽管在杀虫剂的更新、混合、交替使用方面做了大量工作，延缓了杀虫剂抗性的产生，但昆虫对杀虫剂的抗药性上升趋势仍不可遏制。综述了昆虫对化学农药、苏云金杆菌、阿维菌素的抗性机制。 １昆虫对化学农药的抗性机制 １．１表皮穿透性的降低 昆虫表皮对药剂穿透性降低，可延缓杀虫剂到达靶标部位的时间，使昆虫有更多的机会来降解杀虫剂。虽然表皮穿透下降只表现低水平抗性，但作为其它抗性因子的修饰者则很重要，如与解毒作用相结合，就可大大影响死亡率而增加抗性。表皮穿透性降低机制在家蝇、埃及伊蚊、致倦库蚊、淡色库蚊等均有发现［１］。不同的杀虫剂或不同的昆虫表现出的穿透性降低在程度上存在差别，但穿透性降低是所有昆虫抗性普遍存在的一个因素，杀虫剂穿透性的降低是受“Ｐｅｎ”基因所控制的［２１。 １．２解毒酶活力的增强 与杀虫剂代谢相关的解毒酶的解毒作用增强是抗性产生的主要原因之一。这些解毒酶主要包括细胞色素Ｐ４５０介导的多功能氧化酶、谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）、水解酯酶等。 多功能氧化酶是昆虫体内参与各类杀虫剂以及其它外源和内源化合物代谢的主要解毒酶系，可使杀虫剂降低或失去杀虫活性，从而使昆虫产生抗药性。Ｐ４５０酶系的解毒代谢能力增强是因为抗性昆虫体内Ｐ４５０过表达。与抗性相关的Ｐ４５０基因主要有６个：ＣＹＰ６Ａ１、ＣＹＰ６Ａ２、ＣＹＰ６Ａ８、ＣＹＰ６Ａ９、ＣＹＰ６８２和ＣＹＰ６Ｄ１［３］。多功能氧化酶是多种昆虫对拟除虫菊酯、辛硫磷、吡 ?收稿日期：２００８—１１－０４ 作者简介：王芙蓉，女．山东烟台人．研究方向：昆虫学．虫啉、有机磷、氮基甲酸酯类以及生长调节剂定虫隆等多种杀虫剂产生抗性的主导因素。杀虫剂中许多有机磷化合物是被虫体的ＧＳＴ所解毒。一些抗有机氯和有机磷的昆虫体内ＧＳＴ含量很高。ＧＳＴ解毒能力增强也是由于基因在体内的过表达。多种害虫对有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性也与酯酶和水解酯酶有关。酯酶和羧酸酯酶活力增加也能导致棉蚜对有机磷杀虫剂产生抗性。以酯酶为基础的昆虫抗药性机制在分子水平上是因为酯酶基因扩增的结果。另外在昆虫体内还存在ＤＤＴ一脱氯化氢酶，它能把ＤＤＴ分解为无毒的ＤＤＥ，从而使昆虫对ＤＤＴ产生抗性。 １．３神经系统敏感性的下降 靶标不敏感性是昆虫对杀虫剂产生抗药性的一个极为重要的生化机制，已在多种昆虫对多种杀虫剂的抗性中发现。涉及变构乙酰胆碱酯酶（ＡｃｈＥ）对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性、不敏感的钠通道对ＤＤＴ和拟除虫菊酯的击倒抗性和不敏感的ｙ一氨基丁酸（ＧＡＢＡ）受体对环戊二烯类杀虫剂的抗性。 乙酰胆碱酯酶是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。许多昆虫的乙酰胆碱酯酶基因发生突变与昆虫的抗药性有着密切的关系［３。。基因发生突变后，其编码的ＡｃｈＥ对杀虫剂敏感度降低，这是造成昆虫对杀虫剂产生抗性的一个重要原因。现已在很多昆虫中发现不敏感的ＡＣｈＥ，不敏感的ＡＣｈＥ既可能是抗性昆虫ＡＣｈＥ酶量过高所致，也可能是ＡＣｈＥ发生了性质改变。通常情况下抗性是由ＡＣｈＥ变构引起的，不同昆虫的ＡＣｈＥ变构的部位不同。至今在ＡＣｈＥ中已
实验2 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
K 0 K t 吸光度A 实验二 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药 目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。 一、 实验目的 1． 了解果蔬中残留农药的分析方法； 2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。 二、 实验原理 有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。 以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。 根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下： %1000 0?-= K K K Y t K 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值 K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜 率值 其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。 在样品的测量过程，选取每隔等步长时间测定一次吸光度值，3分钟内共测定7个数据点。设数据点如下 表： t 1 2 3 4 5 6 7 A A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 则线性回归所得A ～t 曲线的斜率K 为： 2 22272176543212 2 )721(7 1 )721() ()721(71 )765432()(7171 +++-++++++?+++-++++++= -- = ∑∑∑∑∑ A A A A A A A A A A t t A t A t K i i i i i i
植物基因克隆实验指导
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展
昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展1 林同，李立娜 华南农业大学林学院，510642 E-mail：lintong@https://www.360docs.net/doc/e1492054.html, 摘要：昆虫乙酰胆碱酯酶是有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，乙酰胆碱酯酶基因突变可导致乙酰胆碱酯酶对杀虫剂不敏感而是昆虫产生抗药性。黑腹果蝇和家蝇等昆虫只有一个乙酰胆碱酯酶基因，但冈比亚按蚊等昆虫乙酰胆碱酯酶基因有两个或多个拷贝。本文还综述了昆虫乙酰胆碱酯酶基因的结构和表达调控等。 关键词：乙酰胆碱酯酶基因；基因点突变；抗药性；基因拷贝 乙酰胆碱酯酶（AChE）是在神经系统中的一种主要的酶，能通过催化神经传递介质胆碱酯酶的水解而终止神经冲动。AChE是有机磷酸酯类(OP)和氨基甲酸酯类杀虫剂的主要靶标[1]，数量和性质的改变会使昆虫对杀虫剂产生抗性[2，3]。 1. 昆虫乙酰胆碱酯酶基因的结构与表达调控 人们已经研究了20多种昆虫乙酰胆碱酯酶生化特性[4]，并对一些昆虫乙酰胆碱酯酶基因(Ace)结构进行了分子分析，这些昆虫包括黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）[5]、印度按蚊（Anopheles stephensi）[6]、埃及伊蚊（Aedes aegypti）[7]、马铃薯叶甲（Leptinotarsa decemlineata）[8]、、家蝇（Musca domestica）[9]、尖音库蚊（Culex pipiens）[10]、黑尾夜蝉（Nephotettix cincticeps）[11]、铜绿蝇（Lucilia cuprina）[12]、麦二叉蚜（Schizaphis graminum）[13]、油橄榄果实蝇（Bactrocera oleae） [14]、棉蚜（Aphis gossypii）[15]和冈比亚按蚊（A. gambiae）[16]等。 铜绿蝇AChE序列和其他双翅目昆虫的高度同源，尤其是和家蝇和黑腹果蝇。铜绿蝇序列与家蝇的AChE有92.4%的氨基酸相似性，与黑腹果蝇的有85.3%氨基酸相似性，近似于按蚊和伊蚊之间的相似性[6，7]。 麦二叉蚜完整的cDNA序列有3283bp,其中包含2028 bp的开放阅读框（ORF），起始密码子（蛋氨酸）在257 bp处。终止密码子TGA在2285–2287bp处，后面是976 bp非翻译区，其中包括23 bp poly(A) 尾。在3＇非翻译区poly(A) 尾上游15 bp处有一个典型的AATAAA 信号。在非编码区（222–223 bp位置）和编码区(1775–1776 bp位置)各有一个Eco R I位点，在C末端非编码区(3181–3182位置)有 Hind III位点[13]。 黑腹果蝇[17]和斯氏按蚊(A. stephensi) [6] AChE基因有9个内含子。埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因5＇非翻译区前导序列中有一个很长的内含子（19kb）,其大小及位置和果蝇乙酰胆碱酯酶基因5＇非翻译区前导序列中的第一个内含子相似[18]；在开放阅读框内的内含子和外显子有很强的保守性[6，17]，但第一和第二个内含子（分别是19kb和大于7kb）比印度按蚊乙酰胆碱酯酶基因的内含子（55-105bp）长[6]。 埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因转录起始位点上游40bp处没有类似于TATA的序列，其启动子和多数脊椎动物的乙酰胆碱酯酶基因一样没有TATA盒[18，19]。但果蝇乙酰胆碱酯酶基因中含有TATA盒[17]。在人类这样没有 TATA盒的乙酰胆碱酯酶基因中，去除转录起始元件几乎会去掉启动子的活性，这表明转录起始元件在没有 TATA盒的乙酰胆碱酯酶基因的驱动表达中起重要作用。埃及伊蚊乙酰胆碱酯酶基因转录起始位点上游有五个调控元件。-496至 1本课题得到广东省自然科学基金（04300488）和华南农业大学校长科学基金（2004k051）资助
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
4植物基因克隆的策略与方法
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
实验三 杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
实验三杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用 一、试验原理和目的 在昆虫中枢神经系统的兴奋性突触中，乙酷胆碱是主要神经递质，它通过生物合成、释放以及与受体的结合，使得神经传导能正常进行。当神经接受到某一刺激时，冲动传导到突触处，就由突触前膜释出含有乙胆碱的小囊胞，一次冲动可释出小囊胞100-150个，每个小囊胞含有乙酰胆碱(ACh)分300-2000个。在突触后膜上约有乙酰胆碱分子900个就可产生局部膜电位的去极化，致神经传导正常进行。多余的乙酰胆碱分子及完成刺激受体后而解离的乙酰胆碱分子应立即被突触间隙的乙酰胆碱酯酶(AChE)所水解，使神经又处于静止状态而有利于迎接下一个刺激。因此，比较乙酰胆碱酯酶的活力和性质，可以作为测定神经递质的一个指标。 有机磷酸酯和氨基甲酸酯类杀虫剂在昆虫体内主要作用于神经系统，抑制胆碱酯酶的活性，导致神经传导的阻抑而引起昆虫中毒死亡。研究其毒理机制，胆碱酯酶活力是重要指标之一。其活力测定方法较多，发展较快，有测压和测pH法、比色法、电化学法、荧光法、放射法等。其中比色法中由于应用的底物和显色剂不同，又有不同的测定方法。本实验主要介绍一种常用的比色测定方法乙酰硫代胆碱一二硫双对硝基苯甲酸法(ASCh一DTNB法)。 该法是Ellmanl961年创制的方法，其原理是应用乙酰硫代胆碱(ASCh)为底物，在胆碱酯酶作用下水解为硫代胆碱及乙酸，然后以二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，形成黄色产物，在412nm处有最大吸收峰。生成物浓度和光密度在一定范围内密切相关，故用分光光度计可以进行定量测定，以此代表AChE的活性。 本实验通过测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对昆虫乙酰胆碱酯酶活力的影响，以理解该两类杀虫剂的作用机理，并熟练掌握该酶活性测定方法。 二、仪器、试剂和材料 1. 仪器 721型分光光度计、冰箱、离心机、恒温水浴、匀浆器、具筛刻度试管、吸管等。 2. 供试昆虫 5或6龄的粘虫或家蝇成虫。 3. 试剂 (1) 1.5%溶液生理盐水：称取kcl 1.5g，加入98.5ml蒸馏水，置于100ml的容量瓶中。 (2) 2.0×10-3M谷胱甘肽（还原型）生理盐水溶液：称取谷胱甘肽（还原型）0.030733g，以1.5%的1.5%溶液生理盐水定容于50ml的容量中。
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展
董洁娴 等/重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展 Chinese Journal of Biotechnology May 25, 2012, 28(5): 557?564 https://www.360docs.net/doc/e1492054.html,/cjbcn ?2012 Chin J Biotech, All rights reserved Received : August 30, 2011; Accepted : December 12, 2011 Supported by : National Natural Science Foundation of China (No. 30871755), Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (No. 2009A020101004). Corresponding author : Yuanming Sun. Tel: +86-20-85283448; E-mail: ymsun@https://www.360docs.net/doc/e1492054.html, 国家自然科学基金 (No. 30871755)，广东省科技计划项目 (No. 2009A020101004) 资助。 生物工程学报 重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展 董洁娴，李振峰，雷红涛，何永盛，王弘，孙远明 华南农业大学食品学院 广东省食品质量安全重点实验室，广东 广州 510640 董洁娴, 李振峰, 雷红涛, 等. 重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展. 生物工程学报, 2012, 28(5): 557?564. Dong JX, Li ZF, Lei HT, et al. Expression and molecular evolution of recombinant acetylcholinesterase for detection of pesticide residues: a review. Chin J Biotech, 2012, 28(5): 557?564. 摘 要: 乙酰胆碱酯酶 (Acetylcholinesterase ，AChE) 是酶抑制法检测农药残留的核心试剂。但天然提取的 AChE 存在含量低、纯化困难、稳定性差等不足，因此，高性能的重组AChE 制备成为研究学者关注的热点。文中综述了重组AChE 的表达、和分子进化等方面的研究成果，并指出酶定向进化策略与表面展示技术结合是重组AChE 活性改造的未来趋势。 关键词: 农药残留，重组乙酰胆碱酯酶，酶抑制检测法 Expression and molecular evolution of recombinant acetylcholinesterase for detection of pesticide residues: a review Jiexian Dong, Zhenfeng Li, Hongtao Lei, Yongsheng He, Hong Wang, and Yuanming Sun Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety , Food College of South China Agricultural University , Guangzhou 510640, Guangdong , China Abstract: Acetylcholinesterase (AChE) plays a key role in the pesticide determination. However, the extraction of AChE from natural materials has the disadvantages of low yield, complex purification and poor stability. Therefore, the preparation of recombinant AChE with high performance becomes the hot topic of researchers in recent years. In this article we summarize the progress in the expression of recombinant AChE and the improvement of its analytical characteristic. 综 述
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
胆碱酯酶抑制剂
胆碱酯酶抑制剂治疗阿尔茨海默病的系统评价 自1997年首次使用胆碱酯酶抑制剂(ChEI)治疗阿尔茨海默病以来,多数临床医师和绝大多数患者均把胆碱能药物,如多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明作为轻至重度阿尔茨海默病的一线药物治疗用药。这些药的药代动力学特征有轻度差异,但都是通过阻断乙酰胆碱酯酶,抑制乙酰胆碱这种与记忆相关的重要神经递质的失活。这类药物可以改善阿尔茨海默病的临床表现。为评估上述药物治疗因阿尔茨海默病引发的轻、中或重度痴呆的疗效,英国牛津大学的Birks检索了Cochrane痴呆与认知改善组登记库,从中提取相关数据进行分析,并于今年1月25日在线发表了分析结果。 多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明这3种ChEI对轻至重度阿尔茨海默病都是有效的。在治疗开始前,无法确定药物治疗对哪些患者更有效。无证据表明ChEI治疗是没有价值效益的。尽管上述3种药的作用模式略有不同,但没有证据表明其疗效存在差异。与利凡斯的明相比,多奈哌齐导致的不良反应更少。如果在给患者用药前逐步细致地进行超过3个月的常规剂量滴定,患者对加兰他敏和利凡斯的明的耐受性与多奈哌齐相当。多奈哌齐的滴定较简单,因考虑使用较低剂量。 阿尔茨海默预后和治疗 认知功能的衰退是不可避免的,但病情进展的速度是不可预料的.存活期自2年至20年不等,平均为7年. 对阿尔茨海默病的一般性治疗原则与所有痴呆的治疗相同(见上文痴呆的治疗). 某些能增强胆碱能神经传递的药物,例如Donepezil[即安理申(aricept)],至少在疾病的早期阶段能暂时改善记忆功能.不过,这些药物并不能改变基本病理变化的稳步恶化.他克林(tacrine)引起的不良反应较多.安理申开始试用的剂量是每天晚上1次5mg,过4~6周以后,可增加至10mg；须连续用药数月才能评估其疗效.有关抗氧化剂(如维生素E),雌激素和非类固醇抗炎药的治疗尚在研究之中. 许多药物都能引起中枢神经系统不良反应,包括精神错乱和倦怠.镇静剂如苯二氮类药物,应尽可能避免使用.抗胆碱能药物,例如某些三环类抗抑郁剂,抗组胺制剂,抗精神病药物以及苯甲托品,均应避免使用. 银杏叶浸出物能使阿尔茨海默病或血管性痴呆病例的记忆丧失与其他症状进展有所减慢或有中度的逆转.银杏叶制剂可能起着自由基清除剂的作用.不良反应很轻微；治疗应用尚需进一步研究. 老年痴呆症前兆是什么 导读：一般老年痴呆症前兆有什么呢?由于前期老年痴呆症患者的生活基本可以自理，所以很多时候人们往往忽视了老年痴呆症前兆，被发现时基本都是中晚期了。因此了解老年痴呆症前兆可以帮助患者及时发现病情，以及更好的治疗老年痴呆症。 老年痴呆症,指的是一种持续性高级神经功能活动障碍,简单点说就是在没有意识障碍的状态下,记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面发生了障碍。一般老年痴呆症常常发生在50岁以后,起病隐匿,发展缓慢,最早期往往是以逐渐加重的健忘开始,如果不注意,通常不容易发现,常听有些老年人说:“老了,记性不行了,不中用了。”这其实可能就是老年痴呆症的先兆。 一般老年痴呆症前兆有什么呢?下面请百济药师来为大家介绍老年痴呆症前兆。 老年痴呆症前兆 1、记忆力减退：尤其是近记忆力减退是老年痴呆症早期最常见的前兆。经常忘记近期得到的一些信息，如约会、人名或电话，忘记熟人的名字，不记得刚刚发生(甚至自己做过)的事，还有拿什么东西转手就忘。 2、不能完成熟悉的工作：难以胜任日常家务，而这些家务通常不需要思考。例如，经常做饭的人现在却不知如何做，以前是个精于计算的人，现在连买菜的小账和简单的加减法都算不清。
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
植物基因克隆
来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述
昆虫对杀虫剂的抗性机制概述 摘要: 昆虫抗性机制的研究对于抗性监测、治理等具有重要意义, 综述了昆虫对几种杀虫剂的抗性机制。 关键词: 杀虫剂; 抗药性; 苏云金杆菌; 阿维菌素 随着杀虫剂长期、大量、广泛地使用, 昆虫对杀虫剂产生的抗性也越来越引起人们的关注。尽管在杀虫剂的更新、混合、交替使用方面做了大量工作, 延缓了杀虫剂抗性的产生, 但昆虫对杀虫剂的抗药性上升趋势仍不可遏制。综述了昆虫对化学农药、苏云金杆菌、阿维菌素的抗性机制。 1 昆虫对化学农药的抗性机制 1. 1 表皮穿透性的降低 昆虫表皮对药剂穿透性降低, 可延缓杀虫剂到达靶标部位的时间, 使昆虫有更多的机会来降解杀虫剂。虽然表皮穿透下降只表现低水平抗性, 但作为其它抗性因子的修饰者则很重要, 如与解毒作用相结合, 就可大大影响死亡率而增加抗性。表皮穿透性降低机制在家蝇、埃及伊蚊、致倦库蚊、淡色库蚊等均有发现[ 1] 。不同的杀虫剂或不同的昆虫表现出的穿透性降低在程度上存在差别, 但穿透性降低是所有昆虫抗性普遍存在的一个因素, 杀虫剂穿透性的降低是受Pen 基因所控制的[ 2] 。 1. 2 解毒酶活力的增强 与杀虫剂代谢相关的解毒酶的解毒作用增强是抗性产生的主要原因之一。这些解毒酶主要包括细胞色素P450 介导的多功能氧化酶、谷胱甘肽转移( GST ) 、水解酯酶等。多功能氧化酶是昆虫体内参与各类杀虫剂以及其它外源和内源化合物代谢的主要解毒酶系,可使杀虫剂降低或失去杀虫活性, 从而使昆虫产生抗药性。P450 酶系的解毒代谢能力增强是因为抗性昆虫体内P450 过表达。与抗性相关的P450 基因主要有6 个: CYP6A1、CYP6A2、CYP6A8、CYP6A9、CYP6B2 和CYP6D1[ 3] 。多功能氧化酶是多种昆虫对拟除虫菊酯、辛硫磷、吡虫啉、有机磷、氨基甲酸酯类以及生长调节剂定虫隆等多种杀虫剂产生抗性的主导因素。杀虫剂中许多有机磷化合物是被虫体的GST 所解毒。一些抗有机氯和有机磷的昆虫体内GST 含量很高。GST 解毒能力增强也是由于基因在体内的过表达。多种害虫