凝胶柱
凝胶层析定义
凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。
凝胶层析原理
凝胶层析的概念及其原理
单个凝胶珠本身象个"筛子"。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长!凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。
凝胶层析分类
葡聚糖凝胶是指由天然高分子 -葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech 生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex 和Sephacryl。
葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex 系列，它是葡聚糖与3-氯-1，2环氧丙烷(交联剂)相互交联而成，交联度由2环氧丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型号是G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。Sephadex 的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex 的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex 中排阻极限最大的G-200为8×10。
Sephadex 在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex 稳定工作的pH 一般为为2~10。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex 与强酸和氧化剂接触。Sephadex 在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 °C 下40 min 对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex 由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团(尤其是碱性蛋白)发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex 进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex 与蛋白发
生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephadex 有各种颗粒大小(一般有粗、中、细、超细)可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差;细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex 的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。另外，Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH 型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。Sephacryl 是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺(N，N'-methylenebisacrylamide)交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl 的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex 的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。Sephacryl 与Sephadex 相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：Sephacryl 在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温，Sephacryl 稳定工作的pH 一般为3~11。另外Sephacryl 的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以Sephacryl 相比Sephadex 可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。
凝胶的选择
根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显着差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm 左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
凝胶柱的使用（Superdex 10/300GL）
1. 第一次使用或长时间保存后重新使用
1.1 确保层析柱顶端接口充满溶液。
1.2 确保连接层析柱的管线充满溶液，并以低流速(0.5ml/min)连接层析柱。
1.3 至少 5倍柱体积去离子水平衡层析柱(0.5ml/min)，至少5倍柱体积洗脱液平衡层析柱。
1.4 优先尝试的层析条件
洗脱液：50 mM 磷酸盐缓冲液, 0.15 M NaCl, pH 7.0
流速：0.5~0.75 ml/min
上样体积：25 μl (0.22μm 滤膜过滤或10000g 离心10min，浓度<10mg/ml) 确保层析柱承受压力不要超过其耐受最大压力。
1.5 经过层析柱的所有溶液需要进行脱气并用 0.22μm 滤膜过滤。
2. 层析条件优化
2.1 降低流速，提高高分子量蛋白分辨率，降低低分子量蛋白分辨率。
2.2 减少上样体积，提高分辨率。
2.3 改变有机溶剂浓度，改变选择性。
2.4 两根层析柱串联，提高分辨率，控制 Superdex 75 10/300 柱压小于3MPa，Superdex 200 10/300 柱压小于2.5MPa。
3. 层析柱清洗
3.1 建议在层析柱清洗时采用反向流速。
3.2 用25ml 0.5M NaOH 或者0.5M 乙酸清洗层析柱(0.5ml/min)。
3.3 立即用2~5倍柱体积去离子水冲洗层析柱，接着用至少5倍柱体积洗脱液清洗(0.5ml/min)。
4. 常见问题处理
4.1 层析柱反压升高或柱效下降。
a 确保压力的升高是由层析柱引起的：检查在线滤器；从组分收样器开始断
开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。
b 按照3的方案清洗层析柱。
c 上样1倍柱体积1mg/ml 胃蛋白酶溶液（溶于0.1M 乙酸，0.5M 氯化钠），室温过夜或37 度1h，再按照3的方案清洗层析柱。
4.2 层析柱进气泡
用80~100ml 进行很好脱气的去离子水平衡层析柱（0.5ml/ml），气泡会被逐
渐带出层析柱；很少量的气泡不会影响层析柱柱效（柱管内壁涂抹了一层塑
料薄膜，小量气泡可能被吸附而不影响层析柱填料，而粗糙的表面不会影响
层析柱柱效）。
4.3 层析柱漏液
a 确保是层析柱本身漏液。
b 更换密封圈。
5. 层析柱溶液兼容性
5.1 水相缓冲液pH 3‐12
5.2 耐受 8M 尿素，6M 盐酸胍
5.3 离子型和非离子型去污剂，30%乙腈，10%三氟乙酸，70%乙酸
6. 层析柱超过两天不用或长时间保存
用2 个柱体积脱气去离子水平衡，再用2 个柱体积脱气20%乙醇平衡。
凝胶柱的使用（HiPrep Sephacryl）
1.第一次使用或长时间保存后重新使用
2. 1.1 连接层析柱
3. 1.2连接层析柱之前先打开系统泵排除管线及阀门里的气泡
4. 1.3 停泵，垂直放置层析柱，移去层析柱入口处的堵头，将层析柱入口管线和层析系统连接。
5. 1.4 小心移去层析柱出口堵头，将其与层析系统相连接。
6. 1.5 平衡层析柱
7. 1.6 设置合适的报警压
8. 1.7 1.5柱体积去离子水平衡（15cm/h）
9. 1.8 2柱体积洗脱缓冲液平衡（30cm/h）
10.1.9 优先尝试的层析条件
11.洗脱液：50 mM磷酸盐缓冲液, 0.15 M NaCl, pH 7.2
12.流速：15cm/h
13.上样体积：柱体积的0.5%~4% (0.22μm滤膜过滤或10000g离心10min)
14.确保层析柱承受压力不要超过其耐受最大压力经过层析柱的所有溶液需要进行脱气并用0.22μm滤膜过滤。
15.2. 如何测定柱后压和设置报警压
16.2.1 用一根peek管代替层析柱连接于AKTA系统相应位置。
17.2.2 使用层析时相同的缓冲液和流速运行系统，记录压力检测值为总压力。
18.2.3 断开peek管连接，运行，记录压力值为柱前压。
19.2.4 总压力减去柱前压为柱后压力。
20.2.5 如果柱后压力超过0.35MPa，采取措施降低柱后压（缩短管线、清洗可能被堵塞的管道、更换限流阀），运行直至柱后压小于0.35MPa。
21.2.6 将柱后压加0.15MPa作为系统报警压上限进行设置。
22.3. 层析条件优化
23.3.1 降低流速，提高分辨率。
24.3.2 减少上样体积，提高分辨率。
25.4. 层析柱清洗
26.4.1 建议在层析柱清洗时采用反向流速（15cm/h，室温）。
27.4.2用1.5倍柱体积的0.2M NaOH清洗层析柱，接着用2倍柱体积缓冲液平衡层析柱。
28.4.3如果缓冲液中含有去污剂需要用更多的溶液平衡直至UV基线稳定。
29.更剧烈的清洗
30.4.4 用0.5倍柱体积0.5M NaOH清洗（除去疏水性蛋白和脂蛋白），紧接着用4倍柱体积去离子水清洗层析柱。
31.4.5 用1.5倍柱体积30%异丙醇清洗（除去脂类和非常疏水的蛋白），紧接着用4倍柱体积去离子水清洗层析柱。
32.5. 常见问题处理
33.5.1 层析柱反压升高或柱效下降。
34.a?确保压力的升高是由层析柱引起的：检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。
35.b?按照5的方案清洗层析柱。
36.c?上样1倍柱体积1mg/ml胃蛋白酶溶液（溶于0.1M乙酸，0.5M氯化钠，降解沉淀在层析柱上的蛋白），室温过夜，再用1.5倍柱体积0.2M NaOH清洗，再用4倍柱体积去离子水清洗。
37.d?HiPrep层析柱不能打开或重新装填。
38.5.2 层析柱进气泡
39.用大量进行很好脱气的去离子水反相冲洗平衡层析柱（30cm/h），气泡会被逐渐带出层析柱。
40.5.3 层析柱干裂或层析柱破损漏液：建议购买新的层析柱。
41.6. 层析柱溶液兼容性
42.6.1 使用脱气并用0.22um过滤溶液可以增加层析柱寿命。
43.6.2 30%乙腈，0.5 M NaOH，24%乙醇，1M乙酸，30%异丙醇。
44.6.3 水相缓冲液pH 3-11。
45.6.4 6M盐酸胍，8M尿素。
46.7. 层析柱超过两天不用或长时间保存
47.用4个柱体积脱气去离子水平衡，再用4个柱体积脱气20%乙醇平衡层析柱，并连接堵头密封。
48.
凝胶层析的应用
⑴脱盐：高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。
血型鉴定微柱凝胶法
血型鉴定微柱凝胶法 1.目的： 采用正反定型对受检者进行血型鉴定 2.职责： 严格按照血型鉴定试剂说明书操作 3.适用范围： 血库工作人员 4.原理： 凝胶作为微柱凝胶卡的填充物，将生物化学的凝胶分子筛过滤技术、离心技术和血型血清学的抗体特异性结合在一起，当抗原抗体反应时，凝集的红细胞在离心力的作用下不能通过凝胶而留在凝胶上层或游离在凝胶中，呈阳性反应；而抗原抗体没有反应时，未凝集的红细胞在离心力的作用下可通过凝胶而沉积在微柱凝胶管的底部，呈现阴性反应。 5.试剂、仪器及所需材料 ℃保存，主要成分：IgM性质抗-A单克隆试剂：细胞株HA4、ADD、HA5、HA3，来源于河北医科大学生物医学工程中心； IgM性质抗-B单克隆试剂：细胞株BAD、BDF、HB4，来源于河北医科大学生物医学工程中心；IgM性质抗-D单克隆试剂：细胞株RUM-1，来源于英国Millipore公司。 %-1%的A型和B型红细胞 %的生理盐水：安徽双鹤药业有限责任公司 LB-3000医用低速离心机一次性吸管一次性塑料试管 6.标准种类及收集要求 样本应符合《临床输血技术规范》要求，应无严重溶血、无脂血及无纤维蛋白存在，EDTA抗凝的血液标本。 7.检测环境条件： 18-25℃，湿度30%-70% 8.操作程序
血型卡有六个凝集管。其中第一管为抗A凝胶，第二管为抗B凝胶，第三管为抗D凝胶，第四至六管为中性胶。 用生理盐水将待检者的压积红细胞配置成%-1%浓度，分别加入第一至第三管和第六管微管中，每管50ul。 将A型、B型红细胞分别加入到第四和第五管中，每管50ul。
将待检者血浆分别加入到第四至第六管中。每管25ul。 混匀后置专用离心机离心5分钟。 离心结束后，取出观察结果并记录。 9.结果判定 10.注意事项 为了便于鉴别，抗A微管中内容物为蓝色，抗B微管中内容物为黄色，抗D微管中内容物为乳白色，其他三个中性胶中内容物为乳白色。 使用血型卡前重新离心后使用。 若凝胶卡封口开裂、孔中凝胶干涸或有气泡时，不可使用。 撕开凝胶卡的封口膜时，不可用力过猛，以免造成凝胶微孔间的交叉感染。 红细胞悬液的浓度为%-1%，浓度过高或过低会影响检测结果。血浆标本必须充分离心去除纤维蛋白，否则会在微柱凝胶中阻止红细胞沉淀，呈现假阳性反应。 如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，一定要认真分析并向上级主管技术人员报告并讨论。
卡式微柱凝胶试验与传统检验方法对临床输血检验的应用比较
卡式微柱凝胶试验与传统检验方法对临床输血检验的应用比较 发表时间：2018-03-02T13:14:45.873Z 来源：《医药前沿》2018年1月第3期作者：周文彪[导读] 以卡式微柱凝胶试验展开临床输血检验，可提升一次性检验正确率，为患者输血安全提供有力保障。 （云南省楚雄州人民医院输血科云南楚雄 675000）【摘要】目的：比较卡式微柱凝胶试验与传统检验方法对临床输血检验的应用价值。方法：为158例交叉配血的患者以盐水法、卡式微柱凝胶试验展开临床输血检验，比较检验结果。结果：卡式微柱凝胶试验正定型、反定型一次性检验符合率100.0%、99.4%明显高于盐水法的96.8%、91.8%（P＜0.05）。经交叉配血后，1例患者发生配血不符，占比0.6%。结论：以卡式微柱凝胶试验展开临床输血检验，可提升一次性检验正确率，为患者输血安全提供有力保障，值得推广。【关键词】输血检验；卡式微柱凝胶试验；传统检验【中图分类号】R457.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）03-0137-01 输血是重要的临床辅助治疗手段，要求安全、快速，而展开准确的交叉配血试验对患者用血安全性有重要影响[1]。现阶段临床应用较多的交叉配血检验方法为聚凝胺法、酶法、盐水介质法等，这些传统检验方法操作繁琐，用时较长，极易被外界因素影响，灵敏度较低，输血的安全性有待提高[2]。卡式微柱凝胶试验是新型输血检验方法，操作简便且准确性高。为分析卡式微柱凝胶试验的应用价值，笔者选取158例交叉配血试验患者展开临床研究，现报道如下。 1.资料与方法 1.1 临床资料 选取2016年1月至2017年2月在我院行交叉配血试验的158例患者，其中男95例，女63例，年龄13～71岁，平均（35.4±6.9）岁；所有患者临床资料均完整，其中54例有输血史，10例有妊娠史，1例短期内输血数次，3例有妊娠合并输血史。 1.2 方法 根据规范要求，采集患者肘静脉血3～5ml，以枸橼酸钠抗凝剂行抗凝处理，利用试管对158例患者展开盐水正向定型与反向定型试验。对卡式凝胶管并做标记，以生理盐水制作0.05%红细胞悬液，将待测血清50μl加入A、B两试管，分别加入20μl抗A血清与抗B血清和5%红细胞悬液50μl，将待测血清50μl和抗C血清加入试管C中。在A1与B1食管内加入待测血清、A型及B型血清、0.5%红细胞悬液。检测期间调整温度为37℃并孵化10min，向凝胶试管加入O型血50μl，以1000r/min的速度离心3min，之后展开测量。 1.3 判定标准 阳性：试管中的红细胞全部或部分结合柱内的凝胶；阴性：试管中的红细胞均沉淀至底。 1.4 统计学分析 用SPSS 20.0软件包分析数据，计数资料对比采用χ2检验。P＜0.05为差异显著。 2.结果 2.1 两种试验方法的检验结果 卡式微柱凝胶试验正定型、反定型一次性检验符合率明显高于盐水法（=5.08、10.76，P=0.024、0.001）见表1。 2.2 血型检测结果 158例患者中RhD阴性1例，占比0.6%；E阴性44例，占比27.8%；C阴性11例，占比7.0%；1例患者在交叉配血试验之后发生配血不符，占比0.6%。 3.讨论 在很多疾病治疗中，输血具有无可取代的重要地位，而输血检验是确保患者用血安全的重要环节。传统的输血检验方法如聚凝胺法、酶法及盐水法等最低检测限度较高，自动化程度不佳，且操作比较麻烦，难以标准化，若患者为危急重症，一旦输血延误将会导致患者疾病治疗受到影响，严重时可危及患者生命安全[3]；若配型不准则会导致抗凝现象，甚至可诱发血管内栓塞，导致残疾或死亡。因此输血前展开准确、快速的配对十分重要。 过去临床常用的传统检验方法在血清配对、血型配对方面的准确度有待提高，与此同时因配对不准引发的医疗事故也并不少见，这些给患者及医院均造成了不良影响[4]。近年来，卡式微柱凝胶试验在输血检验中的应用逐渐增多。卡式微柱凝胶试验属于血型血清配对的新型、迅捷检验方法，以抗人球蛋白为基础，展开血型鉴定和配血。其工作原理是借助细小凝胶颗粒构成滤网，与系统调控下的离心机器配合，可迅速将非凝结红细胞与凝结红细胞分离，于电脑显示器上反映出不同图谱，检验医师可结合标准解读方法对图谱进行分析，实现标准化输血检验，可在最大限度上降低人为因素给交叉配血检验造成的干扰。卡式微柱凝胶试验可避免传统检测方法的不足，能够快速、准确的实现血液配对，为患者输血安全与迅速的输血治疗提供更多保障。在本次研究中，卡式微柱凝胶试验正定型、反定型一次性检验符合率100.0%、99.4%明显高于盐水法的96.8%、91.8%（P＜0.05）。经交叉配血后，1例患者发生配血不符，占比0.6%。从中可见，卡式微柱凝胶试验的输血检验准确率较高。 本研究中有1例患者经卡式微柱凝胶试验结果并不正确，推断可能是因为患者自身疾病可能会影响到试验结果的准确性，如免疫性溶血性贫血、自身凝血功能障碍或恶性肿瘤等，因此在运用卡式微柱凝胶试验展开输血检验前，应先判断患者疾病。另外，在检验过程中，根据规范标准保存血液病适当处理，之后再展开血清血型检验十分重要，若血液样品的保存时间过长，会影响检测结果的准确性。卡式微柱凝胶试验可减少医护人员和血液样品的接触，能减少医护人员带来的污染，同时又能避免血液样品中可能存在的病原给医护人员健康造成损害。
SephadexG10凝胶色谱柱
Sephadex G10 凝胶色谱柱 在药物质量控制中的应用 （大连依利特公司应用实验室） 1.前言 目前国内外分离分析β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的主要方法是色谱法，应用的色谱分离模式包括反相、离子交换和凝集色谱等。由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（如均为过敏性杂质），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。因此根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法具有明显的优势。 在深入研究药物与葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该作用影响的基础上，人们开发了葡聚糖凝胶Sephadex G-10为固定相的凝胶色谱模式，可以方便地用于各类β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离分析。 中华人民共和国药典2000版规定了采用Sephadex G-10色谱柱测定头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松四种药物中高分子杂质的含量。但是采用传统的玻璃低压凝胶色谱柱柱效非常低，很难达到药典规定的色谱柱的指标，同时该类色谱柱还由操作不方便、分离时间长、分离度差等不足。针对上述问题，大连依利特公司在药典规定的基础上于2000年开发成功高效Sephadex G-10凝胶色谱柱，能够满足药典规定的四种药物中高分子杂质质量控制的需要。2年来用户使用得到很好的效果。
2．药典规定用Sephades G-10色谱柱的分析方法描述 中国药典2000版采用Sephadex G-10色谱柱分离表1所示的四种头孢化合物中的聚合物，定量方法均为自身对照外标法，药物对照品的分析采用相同的流动相条件（0.01％十二烷基硫酸钠溶液），但是样品的分析用流动相组成和盐的浓度不完全相同。评价色谱柱柱效和拖尾因子均采用蓝色葡聚糖2000。 以下分别在上述条件下评价了依利特Sephadex G-10色谱柱的性能指标及其在药物分析中的应用谱图。
交叉配血试验标准操作规程(微柱凝胶)
交叉配血试验标准操作规程 （微柱凝胶抗人球蛋白法） 1.目的 为规范微柱凝胶抗人球蛋白法在交叉配血试验中的应用，保证检测结果准确及临床输血安全有效，依据《输血实验室管理程序》的要求制定本规程。 2.适用范围 适用于医疗机构输血科作交叉配血试验。 3.职责 医疗机构输血科技术人员负责对交叉配血的试验。 4.原理 红细胞血型抗原与不完全抗体（IgG），在抗人球蛋白的桥梁作用下，经一定的离心力，产生特异性免疫凝集复合物或红细胞血型抗原与完全抗体（IgM）直接产生的特异性免疫凝集复合物，被排阻在具有三维空间网状结构的凝胶表层或凝胶颗粒间隙之中，判为阳性结果，表示待检血标本中含有相应红细胞血型抗原抗体；红细胞全部沉积于凝胶孔腔底部，即判断为阴性反应，表示待检血标本中无相应的红细胞血型抗原抗体。 5.所需设备和试剂 普通离心机、微注凝胶卡专用离心机、微柱凝胶卡专用孵育器、微量移液器、抗人球蛋白微柱凝胶卡 6.检测环境条件 室湿应控制在18~27℃，湿度应保持30%~70%。 7.操作步骤 7.1先将供（受）血标本制备0.5%红细胞低离子介质（LIM）悬液。 7.2撕开卡的封膜，于反应胶中主（次）侧管加供（受）者0.5% 红细胞LIM悬液100μl，加入受（供）血者血浆或血清25μl（或50μl）。 7.3将检测卡37℃孵育15min取出，置离心机1800r/min离心1min,2500r/min离心1min。 结果，表示受（供）血者血浆或血清中含供（受）血者红细胞血 型抗原相应的抗体（不完全抗体IgG或完全抗体IgM），供 受血者血液不相容。
阴性结果，表示供受血者血液相容。 8.质量控制 8.1微柱凝胶试剂卡在有效期内使用，每批试剂卡在使用前用已知阴、阳性对照确认其有效性。 8.1试剂质量控制方法 8.1.1即作阴、阳性对照试验：撕开检测卡的封膜，于2个反应腔中分别加入已致敏IgG抗D的1%O型RhD(+)红细胞LIM悬液50μl、健康者1%O型RhD(+)红细胞LIM悬液50μl。 8.1.2将检测卡于离心机1800r/min离心1min,2500r/min离心1min。 8.1.3取出，结果判定同7.3 9.注意事项 9.1检测卡若在冰箱储存，使用前须放置实验室平衡至室温。 9.2检测卡试验前，应3000r/min离心1min，正立放置待用。 9.3如因运输过程产生的气泡，可将检测卡放置在漩涡震荡器上震荡，使气泡漂移至胶面为止，3000r/min离心2min。 9.4细菌污染、纤维蛋白析出、抗凝不佳的血，可产生假阳性。 9.5离心速度过快，时间过长，试剂失效等因素均可导致假阴性。 10.相关文件 山东科博试剂仪器有限公司《抗人球蛋白检测卡说明书》
凝胶色谱柱操作
凝胶色谱柱操作 1、溶胀 商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。 2、装柱 由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。 3、柱均匀性检查 凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。 4、上样 凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品
凝胶色谱柱
装柱 由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。 3、柱均匀性检查 凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。 4、上样 凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔细，避免破坏凝胶柱的床层。 .交联葡聚糖：葡聚糖凝胶颗粒的商品名，用于凝胶过滤，其大小不同颗粒可用于对各种不同原子量的物质进行分离，作分子筛色谱法介质 这是葡聚糖凝胶，G后面的数字代表凝胶颗粒的大小。具体操作详见，说明书啊！但是G-200的分离范围好像也不大啊，只有20万 Sephadex G-100 对多糖的分离范围最大直到10万，而多糖大于十万的多得是呢 只适用于水中应用，不同规格分离不同分子量范围的化合物。 sephadex g25 g25是什么意思？ 参考见解：Cross-linked dextran gel G-25,葡聚糖凝胶G-25,白色珠状颗粒。一种由葡聚糖经醚键相互交联合成具有多孔性三度空间网状结构的高分子分离材料，为稳定的亲水性凝胶，G-10是表示G类凝胶吸水量的型号。可将G后的数字除以10即为该凝胶每克干重所吸水分的毫升数。能使一定分子量范围的大分子进入凝胶的网状结构内，不溶于水、盐分离和提纯蛋白质、多糖、酶、核酸、激素、氨基酸、多酞和抗菌素等。 比较基础，适合新虫学习！ 一、装柱
HILIC色谱柱介绍
亲水作用色谱（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的注意事项进行了总结。 1. HILIC的概念 亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。2. HILIC的分离机制 HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。 3.HILIC影响保留的主要因素 普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。 影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。 Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid. 4. HILIC与RP-HPLC的比较 传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。 HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC 上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示：
微柱凝胶法血型鉴定操作规程精编版
微柱凝胶法血型鉴定操 作规程 GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-
微柱凝胶法 抗凝血2.0ml 1标本：EDTA-K 2 2原理： 2.1人红细胞抗原与相应抗体发生特异性免疫反应（其本质为血凝反应）； 2.2检测系统是在微柱中（载体）装有的介质凝胶； 2.3凝胶间隙具有分子筛作用。凝集的红细胞（结合的）被留在微柱上面成带状或凝集颗粒散布凝胶中间。未凝集的红细胞（即未结合、游离的）通过离心后沉入微柱的底部； 2.4微柱凝胶中所含的特异性单克隆抗A、抗B试剂检测红细胞上相应的血型抗原，从而鉴定红细胞的血型。 3操作： 3.1在A1孔悬空加入50ul标准A1红细胞，在B孔悬空加入50ul标准B红细胞，再在两孔中各加入50ul样品血浆。 3.2在A、B、D、C、E、Ctrl六个孔内分别悬空加入5%病人红细胞悬液10ul 3.3将卡放到戴安娜专用离心机中离心9分钟 3.4离心结束后在白色背景前观察结果 4结果判断： A孔阳性B孔阴性为A型;A孔阴性B孔阳性为B型; A孔阴性B孔阴性为O型;A孔阳性B孔阳性为AB型。
5.注意事项 5.1严格按操作规程操作，认真核对标本并作好标记。 5.2应先加红细胞悬液，然后再加血浆。 5.3为了防止冷凝集现象的干扰，一般应在室温下进行试验。 5.4严格控制离心速度和时间，防止假阳性或假阴性结果。 5.5未用的微柱凝胶免疫检测卡应入室温保存，用完后放4℃冰箱保存1周。
5.6判断结果后应仔细核对，记录，避免笔误。 6.方法评价 卡式法定型使用安全，操作简单，结果稳定可靠，灵敏度高，重复性好，但费用昂贵，需要特殊的仪器设备。
凝胶色谱法
凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。 凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 凝胶色谱法-分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。 凝胶色谱不但可以用于分离测定 高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。 近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理 凝胶色谱法-分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同 的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗 粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在 凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过 程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分 子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后 流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。具有多孔 的凝胶就是分子筛。 各种分子筛的孔隙大小分布有一 定范围，有最大极限和最小极限。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大 的，就会全部被排阻在凝胶颗粒 之外，这种情况叫全排阻。两种 全排阻的分子即使大小不同，也 不能有分离效果。直径比凝胶最 小孔直径小的分子能进入凝胶的 全部孔隙。如果两种分子都能全 部进入凝胶孔隙，即使它们的大 小有差别，也不会有好的分离效 果。因此，一定的分子筛有它一 定的使用范围。 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大， 完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应 的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变 凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子， 在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而 分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小
凝胶色谱法要点
简介 凝胶色谱技术是上世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，对高分子物质有很好的分离效果。在生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域被广泛采用，工业生产上也有非常广泛的应用。 一、分离原理 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量
常用色谱柱简介
常用色谱柱简介 气相色谱毛细柱 （键合，聚二甲基硅氧烷） HP-1，DB-1，P-1，CP-SIL5CB， Ultra-1,007-1,RTx-1,AT-1 类似固定相：SE-30，SP-2100，OV-1，OV-101,使用 温度：-60℃-320℃ 应用范围：烷烃，芳烃，多环芳烃，醇，酚，酮，酯，醛，胺，卤代烃，吡啶，糖衍生物，氨基酸衍 生物，维生素衍生物，镇痛药，农药，溶剂，胆固SPB-50型中等极性柱 醇，香料，咖啡，食品添加剂等。 (键合, 50%二苯基,50%二甲基聚硅氧烷) 对照品牌：HP-50，HP-17，DB-17，RTx-50，AT-50 SPB-5型弱极性柱 类似固定相：OV-17, SP-2250,使用温度：30℃-310℃（键合，5%苯基，95%甲基聚硅氧烷） 应用范围：烷烃，低沸点芳烃，多环芳烃，醇，甘 对照品牌：HP-5，DB-5，BP-5，CP-SIL 8CB， 油三酸酯，喹啉，卤素化合物，香料，农药，酯，Ultra-2, ,RTx-5,AT-5 镇痛药，除草剂等。 类似固定相：SE-54，SE-52，OV-73 使用温度： -60℃-320℃ PTE-5，PTE-5QTM型弱极性柱
应用范围：烷基苯，多环芳烃，醇，酚，酮，脂肪(MS专用柱,键合,5%苯基,95%甲基聚硅氧烷) 酸酯，苯二甲酸酯，硝基芳烃，芳胺，烷基胺，联 对照品牌：HP-5 MS，DB-5 MS, DB-5.625，XTI-5， 苯胺，卤代烃，多氯联苯，，糖类衍生物，维生素衍BPX625，半挥发污染物分析柱（US EPA方法525， 生物，有机酸，镇痛药，农药，抗组胺药，溶剂，625.5，625） 生物碱，防腐剂，香料等。 类似固定相：SE-54,SE-52 使用温度：-60℃-320℃ 应用范围：多氯联苯，胺，有机磷，有机氯农药，SUPELCOWAX 10型极性柱 含氯除草剂，酚，苯胺，香料等。 (键合,聚乙二醇二万) 对照品牌：HP-Wax，DB-Wax，BP-20，CP-Wax 52CB，SPB-1701型中等极性柱 HP-INNO Wax,AT-Wax (键合, 14%氰丙基,86%二甲基聚硅氧烷) 类似固定相：PEG-20M, CARBOWAX-20M,使用温 对照品牌：HP-1701，DB-1701，RTx-1701，AT-1701，度：35℃-280℃ BP-10，CPSil19CB 应用范围：低沸点芳烃，醇，酮，酸，酯，醛，醚， 类似固定相：OV-1701,SP-2250 使用温度：室温-280 乙二醇，丙二醇，甘油，吡啶，胺，亚硝胺，卤代 ℃ 烃，胆汁酸衍生物，冰片，薄荷，精油，香料，酒，
微柱凝胶卡交叉配血试验常见问题及处理
微柱凝胶卡交叉配血试验常见问题及处理苯露露论坛 微柱凝胶卡交叉配血试验的原理:在微柱凝胶介质中，红细胞抗原与相应抗体结合，利用凝胶的空间位阻，经低速离心，凝集的红细胞悬浮在凝胶上层，而未和抗体结合的红细胞则沉于凝胶底部(管底尖部)。 微柱凝胶卡交叉配血试验的优点:微柱凝胶实验(又名微柱凝胶血型卡法)有结果清楚明确、结果稳定可保存、灵敏度高、特异性强、可标准化操作、自动化程度高、可检出IgG抗体、标本用量少、降低错误发生率的优点。微柱凝胶卡交叉配血试验常见问题: 1主侧不凝集，次侧凝集 1.1微柱凝胶卡交叉配血试验如果主侧不凝集，而次侧凝集，原因有:?患者的红细胞已经包被了抗体(自身抗体，直接抗人球蛋白试验即DAT阳性反应)。最常见的原因是患者有免疫系统疾病、肿瘤以及骨科患者。?供血者血浆中存在针对患者红细胞的抗体。?患者与供血者的ABO血型不合。 1.2处理 1.2.1患者红细胞直接抗人球蛋白试验:患者05%红细胞悬液50ul加入合血卡主侧或次侧，立即离心5min(900rpm2min;1500rpm3min。程序已设置好。)，取出肉眼判定结果。如果为阳性结果，则说明患者自身红细胞问题，即患者红细胞已被致敏，此袋血可以发出，但报告写清楚:主侧不凝集，次侧凝集，患者红细胞直接抗人球蛋白试验阳性，请缓慢输注。 1.2.2如果患者红细胞直接抗人球蛋白试验为阴性结果，则查找献血员血浆中是否存在不完全抗体。用献血员血浆作不完全抗体筛查试验:08%标准红细胞悬液?、?、?各50ul(1滴)加入相应凝胶管中，再加献血员血浆50ul，37?孵育
15min，离心5min(900rpm2min;1500rpm3min。程序已设置好。)，取出肉眼判断结果。如果为阳性结果，则说明献血员血浆中存在不完全抗体，此袋血不能发出，必须换一袋血再重新合血 1.2.3如果还查找不出原因，则请临床重新抽取血液标本，用新标本重新合血。 2主侧凝集，次侧不凝集 2.1微柱凝胶卡交叉配血试验如果主侧凝集，次侧不凝集，原因有:?患者或供血者ABO定型不正确，或二者的ABO血型不配合。?某些亚型的特异性非常强。?患者血清中存在同种抗体，与供血者红细胞上的相应抗原发生了反应。?供血者红细胞上已经包被了抗体。?患者血清不正常，患者刚输注大分子药物如右旋糖酐。 2.2处理?重新鉴定血型，如属血型错误，则重新用同型血合血。?如属亚型，则此袋血不可以发出，必须换一袋血重新合血。?如果患者刚输注大分子药物如右旋糖酐，则立即停止输注大分子药物，2h后重新抽取血液标本，重新合血。 3主次侧均凝集 3.1微柱凝胶卡交叉配血试验如果主次侧均凝集，原因主要是ABO血型的错误。 3.2处理重新检测受血者和献血者的ABO血型(正反定型)，必须用ABO、RHD血型定型试剂卡(单克隆抗体)(微柱凝胶卡)作血型鉴定，如果正反定型不符，要按相应方法处理，直到结果能做出合理解释为止。 注意事项:?抗人球蛋白凝胶合血卡必须标注患者姓名和献血员血袋号(后4位)，一卡可以合三袋血。?微柱凝胶卡的准备:合血前首先观察微柱凝胶卡的外观如有干胶、杂质、 气泡不可使用，然后用专用离心机离心3~4min。?红细胞悬液浓度不可太浓或太淡，应以0.5%~0.8%为宜。?冬天可将生理盐水37?孵育后配红细胞悬液，遇疑难
凝胶色谱GPC实验步骤
一、实验目的： 1. 掌握PL—120型号凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）的工作原理。 2. 掌握凝胶渗透色谱仪的基本操作及数据处理方法。 3. 利用凝胶渗透色谱仪测定聚合物的分子量及其分布。 二、基本原理： 分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能与其分子量和分子量分布密切相关。凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）是液相色谱的一个分支，已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。其还可测定聚合物的支化度，共聚物及共混物的组成。采用制备型的色谱仪，可将聚合物按分子量的大小分级，制备窄分布试样，供进一步分析和测定其结构。该方法的优点是：快捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。 凝胶色谱的分离机理众说不一，有体积排除、限制扩散、与流动分离等各种解释。实验证明，体积排除的分离机理起主要作用。因此，这一技术又被赋予另一个名称：体积排除色谱（size exclusion chromatography，SEC） 、 图1. GPC分离过程示意图 圆球表示颗粒；黑点表示溶质分子 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入
HILIC色谱柱介绍
亲水作用（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的进行了总结。 1. HILIC的概念 亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。2. HILIC的分离机制 HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。 影响保留的主要因素 普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。 影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显着增加样品的保留因子。在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显着的亲水作用。如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。 Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid. 4. HILIC与RP-HPLC的比较 传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。 HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC 上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示： Figure 2: Chromatograms comparing the retention of allantoin on Atlantis HILIC Silica and Atlantis dC18 columns. (a) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis dC18; mobile phase: 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows no retention (k =0) of allantoin. (b) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis HILIC Silica; mobile phase: 95:5 (v/v) acetonitrile–water containing 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows retention (k =1) of allantoin. 另外，HILIC柱上的洗脱顺序与RPLC柱上的正好相反，极性较小的物质先出峰，极性较大的物质后出峰。如图3所示：
微柱凝胶卡式法交叉配血试验标准操作规程
微柱凝胶卡式法交叉配血试验标准操作规程 1、目的 为规范输血科交叉配血试验的技术操作，确保鉴定结果准确及临床输血安全有效，依据《输血实验室管理程序》4.1.7条款的要求制定本规程。 2、适用范围 本文件适用于本院输血科进行交叉配血的操作技术的规范化管理。 3、职责：输血科技术人员负责本实验的技术操作。 4、试验方法及原理 4.1试验方法：凝胶测试法 4.2原理：本微量定型系统凝胶测试法基于生物化学凝胶过滤技术和离心技术及免疫化学抗原抗体特异反应。当抗原抗体反应，抗人球试验时，血细胞发生凝集。离心时凝集块不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层，呈阳性反应，未凝集细胞离心时可通过凝胶间隙而沉积在凝胶管底部，呈阴性反应。 5、样本采集和处理 受血者血样为EDTA-K2抗凝血。抽取受血者静脉血3~4ml于专用管（紫色头管）内，分离出血浆。红细胞配成0.8%的悬液，供血者血样以同样方法分离血浆，并配制0.8%红细胞悬液。配血所用受血者血样必需是输血前3天内的。
6、试剂： 6.1 0.9%的生理盐水； 6.2戴安娜合血卡； 7、仪器： 7.1XTL-4.7细胞洗涤离心机； 7.2DiaMed-ID Incubator 37 SⅠ温育器； 7.3DiaMed-ID Centrifuge 12 SⅡ 8、操作程序： 8.1工作准备： 8.1.1生理盐水室温平衡。准备样本。标记合血卡。 8.1.2 0.8%-1%样本红细胞制备：加25μl样本压积红细胞 悬浮液于2ml戴安娜2号稀释液中。 8.1.3于1号管中（主侧）加入50μl献血者红细胞（0.8%）。25μl受血者血浆或血清。 8.1.4 2号管中（次侧）加入50μl受血者红细胞（0.8%）。25μl献血者血浆或血清。 8.1.5 37℃孵育15分钟。 8.1.6 离心10分钟。判断结果，并作好记录。 9、结果判断：1+至4+为抗人球配血不相容；—（0）为配 血相容，可以输注。 10、医学解释： ABO交叉配血试验是检查供、受血者血液中是否含有不相合
血型鉴定微柱凝胶法
血型鉴定微柱凝胶法 1. 目的：采用正反定型对受检者进行血型鉴定 2. 职责：严格按照血型鉴定试剂说明书操作 3. 适用范围：血库工作人员 4. 原理：凝胶作为微柱凝胶卡的填充物，将生物化学的凝胶分子筛过滤技术、离心技术和血型血清学的抗体特异性结合在一起，当抗原抗体反应时，凝集的红细胞在离心力的作用下不能通过凝胶而留在凝胶上层或游离在凝胶中，呈阳性反应；而抗原抗体没有反应时，未凝集的红细胞在离心力的作用下可通过凝胶而沉积在微柱凝胶管的底部，呈现阴性反应。 5. 试剂、仪器及所需材料 5.1 ABO/RhD 血型定型检测试剂卡：江阴立博医药生物技术有限公司，产品注册号：国械注准20163400855 ，包装： 6 孔/卡，12 卡每盒。储存要求：18-25 C保存，主要成分：IgM性质抗-A单克隆试剂：细胞株HA4、ADD 、HA5 、HA3 ，来源于河北医科大学生物医学工程中心；IgM性质抗-B单克隆试剂：细胞株BAD、BDF、HB4，来源于河北医科大学生物医学工程中心；IgM 性质抗-D 单克隆试剂：细胞株RUM-1 ，来源于英国Millipore 公司。 5.2 0.8%-1% 的A 型和B 型红细胞 5.3 0.9% 的生理盐水：安徽双鹤药业有限责任公司 5.4 LB-3000 医用低速离心机一次性吸管一次性塑料试管 6. 标准种类及收集要求 样本应符合《临床输血技术规范》要求，应无严重溶血、无脂血及 无纤维蛋白存在，EDTA 抗凝的血液标本。 7. 检测环境条件： 18-25 C,湿度30%-70% 8. 操作程序
8.1 血型卡有六个凝集管。其中第一管为抗A 凝胶，第二管为抗B 凝胶，第三管为抗 D 凝胶，第四至六管为中性胶。 8.2 用生理盐水将待检者的压积红细胞配置成0.8%-1% 浓度，分别加入第一至第三管和第六管微管中，每管50ul 。 8.3将A型、B型红细胞分别加入到第四和第五管中，每管50ul。
第九章 凝胶渗透色谱
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日
第九章凝胶色谱分析 凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]： 1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。 近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。 入射光 散射光 图9-1光散射现象 9.1 基本原理 9.1.1凝胶渗透色谱分离原理 让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。这样经过一定长度的色谱柱分离后，不同相对分子质量的物质就被区分开了，相对分子质量大的在前面流出（其淋洗时间短），相对分子质量小的在后面流出（淋洗时间长）。从试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分