仪器分析第三章 液相色谱法

第三章液相色谱法

第一节概述

20世纪的后二十年，LC的应用发展非常迅速。

生命科学、生物工程的发展，迫切需要解决高沸点、强极性、热不稳定性、大分子复杂混合物的分离分析。

高效液相色谱法是强有力手段之一。

80年代以来HPLC（到1998年统计）文献量占21%（89年）；仪器销售量 25%（12亿）（89年）。

应用领域：拓展得非常广（化工、环保、临床、药品、生命），超过GC。

1.1 液相色谱的适用范围

适合用HPLC分析的样品特点：

A 能制成溶液的有机物；

B 高沸点（400℃及其以上）；

C 热稳定性差；

D 相对分子质量大（大于400）。

这样的物质几乎占有机物总数的75%~80%。

高效液相色谱的应用越来越广泛。

高压：液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压，一般可150~350×105Pa。

高速：分离所需时间短，载气流速快（1~10mL/min）。

高效：柱效高，可达3万塔板/米。气相柱效为 2000塔板/米。

高灵敏度： 1、紫外检测器灵敏度可达10-9g，荧光检测器可达10-11g。

2、所需样品少，微升数量级的样品足以进行全分析。

1.3 高效液相色谱固定相

按液相色谱法的分类来介绍固定相

1. 液-液分配及离子对色谱固定相

（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；

（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）

30～40μm的实心玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量低，故需配灵敏度较高的检测器。目前粒度为5～10μm的全多孔微粒是使用最广泛的高效填料。

（3）化学键合固定相

化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相；

a. 硅氧碳键型：≡Si—O—C

b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c. 硅碳键型：≡Si—C

d. 硅氮键型：≡Si—N

化学键合固定相的特点：

（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；

（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；

（3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；

（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；

（5）有利于梯度洗脱；

存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；

2.液-固吸附色谱法固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；

结构类型：全多孔型和薄壳型；

粒度：目前常用5～10 μm的硅胶微粒；

3.离子交换色谱固定相

结构类别：

（1）薄壳型离子交换树脂：薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂。

（2）离子交换键合固定相：薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）。

上述两种树脂按分离特点又可分为两类，即阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）和阴离子交换树脂

（强碱性、弱碱性）。

按离子交换功能团酸碱性强弱分类: 强酸性、弱酸性；强碱性、弱碱性。

由于强酸或强碱性离子交换树脂比较稳定，pH值适用范围较宽，因此在高效液相色谱中应用较多。

4. 空间排阻色谱固定相

（1）软质凝胶

葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。

（2）半硬质凝胶

苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶

多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。

可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。

1.4 高效液相色谱固定相

1. 流动相特性

（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；

（2）正相色谱——亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。

反相色谱——若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。

2. 流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；

按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。

采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。

3. 流动相的选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：

水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)

4. 选择流动相时应注意的几个问题

（1）纯度——尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）相互作用——避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。

（3）溶解度——试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。

（4）粘度——溶剂的粘度小些为好，否则会降低样品组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。且在同一温度下，柱压随溶剂粘度增加而增加。

（5）与检测器相匹配——流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。

1.5 影响液相色谱分离的因素

在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即： H = A + C u

故液相色谱H-u曲线与

气相色谱的形状不同，

如图所示。

涡流扩散项和传质阻力项与气相色谱法的含义相同。

液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。

由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温。

改变淋洗液的组成和极性是改善分离的最直接的因素。

第二节、高效液相色谱仪

2.1高效液相色谱仪的结构

由液路系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统构成

1、液路系统

包括高压输液泵、在线脱气装置、梯度洗脱装置

（1）高压输液泵

高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性

往复式柱塞泵这是目前较广泛使用的一种恒流泵

往复式柱塞泵特点：不受整个色谱其余部分阻力微小变化的影响，可连续供给恒定体积的流动相；更换溶剂方便，适于梯度洗脱。

（2）在线脱气装置

在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。

除在线脱气装置外，目前也采用超声脱气、真空脱气等方式。

脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。

（3）梯度洗脱装置

梯度洗脱(提)，即载液中含有两种(或更多)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比，从而改变极性，通过载液极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。

通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。

2

在高效液相色谱中，进样方式及试样体积对柱效有很大的影响。要获得良好的分离效果和重现性，需要将试样“浓缩”地瞬时注入到色谱柱上端柱担体的中心成一个小点。如果把试样注入到柱担体前的流动相中，通常会使溶质以扩散形式进入柱顶，就会导致试样组分分离效能的降低。

(1)注射器进样装置

这种进样方式同气相色谱法一样，试样用微量注射器刺过装有弹性隔膜的进样器，针尖直达上端固定相或多孔不锈钢滤片，然后迅速

按下注射器芯，试样以小滴的形式到达固定相床层的顶端。

缺点——不能承受高压，在压力超过150×105Pa后，由于密封垫的泄漏，带压进样实际上成为不可能。

可采用停流进样的方法解决此问题。

打开流动相泄流阀，使柱前压力下降至零，注射器按前述方法进样后，关闭阀门使流动相压力恢复，把试样带入色谱柱。

由于液体的扩散系数很小，试样在柱顶的扩散很缓慢，故停流进样的效果同样能达到不停流进样的要求。

停流进样缺点——无法取得精确的保留时间，峰形的重现性亦较差。

(2)高压定量进样阀

这是通过进样阀(常用六通阀)直接向压力系统内进样而不必停止流动相流动的一种进样装置。I:\仪器分析\视频\液相色谱

目前液相色谱法常用的标准柱型是内径为4.6或3.9 mm，长度为15—30cm的直形不锈钢柱。填料颗粒度5～10μm。液相色谱柱发展的重要趋势:

1、减小填料颗粒度(3～5 μm)以提高柱效。

2、减小柱径(内径小于1 mm，空心毛细管液相色谱柱的内径只有数十微米)，既大为降低溶剂用量又提高检测浓度。

4、检测系统

用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。

目前最常用的检测器：紫外光度检测器、荧光检测器、示差折光检测器、电导检测器。

（1）紫外-可见检测器

紫外光度检测器是液相色谱法广泛使用的检测器。

作用原理：被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守Lamber-Beer定律。

紫外光度检测器有固定波长(单波长和多波长)和可变波长(紫外分光和紫外可见分光)两类。

一般常采用氘灯作光源。

Lamber-Beer定律表达式：

I 透射光强I0 入射光强l 为液层厚度

E为吸光系数，即单位浓度、单位厚度的吸光度。指在一定条件（单色光、溶剂、温度）下E是物质的特征常数。

Lamber-Beer定律适用的一个前提条件是“溶液是稀液”，浓度过高会使C和A的关系偏离定律。

优点： 1、有很高的灵敏度，最小检测浓度可达10-9g·mL-1，故对紫外光吸收较弱的物质，也可用这种检测器进行检测。

2、此检测器对温度和流速不敏感，可用于梯度淋洗，其结构较简单。

缺点：

不适用于对紫外光完全不吸收的试样，溶剂的选用受限。为了扩大应用范围和提高选择性，

可用可变波长检测器。光电二极管阵列检测器是紫外可见光度检测器的一个重要进展。

（2）荧光检测器

特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2 3个数量级，适合于药物和生物化学样品的分析。

许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。一些不发荧光屏物质可以与发荧光物质反应衍生化后检测。

（3）示差折光检测器

差示折光检测器是借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。

溶液的折射率是纯溶剂(流动相)和纯溶质(样品)的折射率乘以各物质的浓度之和。

优点——几乎每种物质都有各自不同的折射率，因此都可用差示折光检测器来检测。

缺点——对温度变化很敏感，因此检测器的温度控制精度应为±10-3。此检测器不能用于梯度淋洗。（4）电导检测器

电导检测器属电化学检测器，是离子色谱法中使用最广泛的检测器。

作用原理——通过物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质含量。

特点——电导检测器的影响受温度的影响较大，因此要求严格控制温度。一般在电导池内放置热敏电阻器进行监测。

5、数据处理系统：

主要记录试样某一组分电信号的大小、保留值的大小、组分分离情况等。

2.2高效液相色谱仪的维护

2.2.1流动相的过滤和保存

一、过滤

所有溶剂使用前都必须经0.45μm（或0.22μm）过滤，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外。

用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。

1、有机相滤膜

有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。

2、水相滤膜

水相滤膜只能用于过滤水溶液。水相滤膜严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！

溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。

3、混合流动相过滤

对于混合流动相，可在混合前分别过滤，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。

现在已有混合型滤膜出售。

二、流动相的贮存

1、贮存容器

流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。

因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。

容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。

2、密封

贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。

3、贮存时间

磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。

卤代有机溶剂应特别注意的问题

卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质，能与HPLC系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解，不能存放太久。

例：CCl4、CHCl3等与各种醚类（如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等）混合后，可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的产物，这种混合流动相应尽量不采用，或新鲜配制。

此外，卤代溶剂（如CH2Cl2）与一些反应性有机溶剂（如乙腈）混合静置时，还会产生结晶。

总之，卤代溶剂最好新鲜配制使用。如果是和干燥的饱和烷烃混合，则不会产生类似问题。

2.2.2高压泵的使用和维护

一、注意事项

为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须注意下列操作事项：

1、防止任何固体微粒进入泵体。

因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。

流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤。

泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。

2、流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。

如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。

因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

3、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，

最终产生漏液。

4、输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

5、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。

二、高压泵产生故障时的应对措施：

1、没有流动相流出，又无压力指示。

原因及措施：可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。可能是密封环磨损，需更换。

2、压力和流量不稳。

原因及措施：可能是气泡，需要排除；可能是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。

3、压力过高

原因及措施：可能是管路被堵塞，需要清除和清洗。

4、压力降低

原因及措施：可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

2.2.3色谱柱的使用和维护

使用及维护事项

1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。

温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会影响柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。

2、应逐渐改变溶剂的组成

尤其是反相色谱柱，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。

3、色谱柱的反冲

一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

4、适宜的流动相

选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

5、使用保护柱

避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。

6、冲洗色谱柱

经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50～75ml。

7、色谱柱的保存

保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

8、色谱柱压力升高

色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。

9、色谱柱的冲洗

每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4～5天开机冲洗15分钟。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。

第三节高效液相色谱仪的类型及其应用

一、液相色谱的类型

根据分配机制不同，高效液相色谱可分为

以下几种主要类型：

1、液-液分配色谱

固定相与流动相均为液体（互不相溶）；

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；

流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；

固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。

2、液--固色谱

固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。

缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。

3、离子交换色谱

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。

亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+ 阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。

4、离子对色谱

原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；

阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；

阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；

反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离

子 Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相

后，生成疏水性离子对Y+X -后；在两相间分配。

5、离子色谱

离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与

离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离

子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，

是测定混合阴离子的有效方法。

6、排阻色谱

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，

由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部胶空隙，中速通过；

而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。

全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合

物按质量分离。

二、液相色谱分离类型的选择

三、液相色谱柱的选择

现代高效液相色谱中，分离效果好坏的一个重要指标是色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。

1、硅胶基质填料

1.1 正相色谱（NPC）正相色谱用的固定相通常为

硅胶以及其他具有极性官能团的基团，如氨基和氰基团的键合相填料。

由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强。因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。

正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane）、氯仿（Chloroform）、二氯甲烷（Methylene Chloride）

正相色谱常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

1.2 反相色谱（RPC）

反相色谱常用的填料是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。

反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。

常用的反相填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。

RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。

需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5～7.5（2～8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH 值会使键合的烷基脱落。有报告指出新商品柱可在pH 1.5～10范围操作。

2、聚合物填料

聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在pH值为1—14均可使用。

相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。

现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。

3、其它无机填料

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。

举例：

3.1 石墨化碳黑

石墨化碳黑正逐渐成为反相色谱柱填料。

这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳黑的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳黑可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何pH与温度下使用。

3.2 氧化铝

氧化铝也可以用于HPLC。

氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床。

优点是可以在pH高达12的流动相中使用。

缺点是由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。

3.3 氧化锆

新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。

商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用pH为1-14，温度可达100℃。

由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。

4、填料粒度的选择

目前，商品化的色谱填料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3和5um填料进行。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um填料的应用。

在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。

如果固定相选择正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。

3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色谱柱的背压却是5um 的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，柱长越小，分析时间越短。

另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。

四、液相色谱的应用实例

1. 环境中有机氯农药残留量分析

固定相：薄壳型硅胶(37 ～50 m)

流动相：正己烷

流速：1.5 mL/min

色谱柱：50cm 2.5mm(内径)

检测器：差示折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。

2. 稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。

固定相：十八烷基硅烷化键合相

流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50 oC

柱压：70 104 Pa

检测器：紫外检测器

液相色谱习题：

1.简述液－液色谱法中的反相和正相液相色谱法其固定相、流动相和分离化合物的性质。

2. 何谓梯度淋洗？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？在液相色谱中，在什么情况下采用梯度淋洗有利于分离、分析？

3. 空间排阻色谱法适用于什么化合物的分离？

4. 俄国植物学家茨维特在研究植物色素成分时, 所采用的是什么类型的色谱方法？

5. 在液相色谱中,能使所有有机物都能显示信号的检测器是哪一种？它有什么缺点？

6. 高效液相色谱中, 为什么在流动相在使用之前, 必须进行脱气处理？

7. 高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有何不同之处？