包涵体变性亲和层析复性方法
包涵体变性及亲和层析复性方法
实验材料
裂解液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0
洗涤液：20 mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 3M 尿素，pH 8.0
变性液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，0.5M NaCl，20mM 咪唑，pH 8.5
洗脱液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，500mM 咪唑，pH 8.5
复性液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 M L-Arg, 0.5 mM GSH, 0.05 mM GSSG, 5% 甘油，1% PEG
实验方法：
1.包涵体的变性：收集菌体，加入裂解液，高压破碎，12000rpm离心30min，
沉淀中加入包涵体洗涤液，充分溶解，12000rpm离心30min取沉淀，加入变性液（1g包涵体加入15ml），碾压包涵体，置于室温充分溶解，12000rpm离心30min取上清。
2.包涵体的纯化：上述变性液上样至5 ml Ni柱，用变性液平衡，用pH 4.5的
20 mM NaAc缓冲液洗涤三个柱体积，然后用含有55mM, 100mM及500mM
咪唑的含8M尿素的洗脱液阶段梯度洗脱，每个梯度至少洗五个柱体积。3.包涵体的复性：上述洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，然后用变性液调节其浓度
至0.5 mg/ml左右。再透析至含有4M尿素的复性液中，10℃透析6 h，然后透析至含有2 M尿素的复性液中，透析8 h；再透析至含有1M尿素的复性液中，透析12h; 最后透析至储存缓冲液(20 mM Tris-HCl. 50 mM NaCl ,20 % 甘油, pH 8.0)中。5000 rpm 离心10 min, 取上清进行还原胶及非还原胶鉴定，并进行酶学性质检测。
包涵体的形成以及处理方法
包涵体的形成以及处理方法 1 包涵体形成的原因 (1)表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体L2]。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。(2)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成]。(3)重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠，导致错误折叠分子的产生。(4)重组蛋白的氨基酸组成，一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。(5)包涵体形成动力学研究表明，包涵体是由部分变性的中阃体聚合而成。因此，任何影响中间体稳定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚合反应。(6)在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。(7)有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体? 。 包涵体的处理 包涵体的形成具有有利的一面，也有不利的一面。有利的一面是包涵体的形成去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质。同时，因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率，通常其表达量可占菌体总蛋白的10％～30％，甚至高达50％。不利的一面是溶解包涵体进行复性折叠的过程中需要加变性剂和去垢剂，而引起蛋白质的不可逆修饰以及性质改变，这些试剂价格昂贵，且复性的操作过程不好控制；另一方面复性过程常伴有蛋白质水解和沉淀，有些还形成异构体【s] 5。因此复性是蛋白质工程中最关键、最复杂的问题。包涵体
的处理一般有如下几个步聚。 破碎细菌细胞 提取包涵体时，首先要裂解细菌，为了防止在裂解细菌的过程中目的蛋白质变性，常常采取一些保护措施：合适的缓冲体系，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液；加 入保护剂，如还原剂DTT(2一巯基苏糖醇)、2一巯基乙醇；加防止水解酶作用的试剂，如酶的抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。破菌的方法很多，主要包括以下几种：(1)渗透破碎法： 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。(2)冷热交替法：把待碎样品投人90℃左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内，可使大部分细胞破碎。可用于提取蛋白质和核酸。 (3)反复冻融法：把待碎样品冷却到一2O℃，冻固后取出，缓慢解冻，如此反复操作，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破导致部分细胞及胞内的颗粒破碎，但也可使生物活性物质失活。这种方法虽简单方便，但对温度变化敏感的蛋白质却不宜采用。(4)超声波法：使用超声波仪使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。根据不同待碎样品采用不同频率，不同时间；另外，超声波处理时溶液温度升高会使不耐热的物质失活，因此使用时为防止温度升高，除间歇开机外，还需人工降温。避免溶液内存在气泡，这样会使蛋白质变性【6】。(5)溶菌酶处理法：多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100 g至1 mg溶菌酶，37℃保温10 min，或者室温作用30 min，细胞就破坏了。 洗涤包涵体 洗涤包涵体前先8 000 r／rain，412离心15 rain，可使大多数包涵体沉淀，
包涵体的纯化和复性总结
板块一、大肠杆菌 （这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。） 一、关于菌体的量 大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。 二、关于是否包涵体表达 包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。 我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。 三、关于表达量 我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。 有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。 与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。 纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。 四、菌体破碎
蛋白质复性方法
包涵体表达的蛋白的复性 摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。 关键词包涵体蛋白质复性 Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules. Key words inclusion body , protein , renaturation 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体： 包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为，具有很高的密度（约ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR 等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以
硅烷偶联剂的使用(完整篇)
硅烷偶联剂的使用（完整篇） 一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-Y。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeCOO、Vi及 CH2-CHOCH2O－的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2－CHCH2O及H2N－硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N－及H2NCONH－硅烷偶联剂；聚烯烃选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而，光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕3种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中Y与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的Si－OH含量。已知，多数硅质基体的Si－OH含是来4-12个/μ㎡，因而均匀分布时，1mol硅烷偶联剂可覆盖约7500m2的基体。具有多个可水解基团的硅烷偶联剂，由于自身缩合反应，多少要影响计算的准确性。若使用Y3SiX处理基体，则可得到与计算值一致的单分子层覆盖。但因Y3SiX价昂，且覆盖耐水解性差，故无实用价值。此外，基体表面的Si-OH数，也随加热条件而变化。例如，常态下Si－OH数为5.3个/μ㎡硅质基体，经在400℃或800℃下加热处理后，则Si－OH值可相应降为2.6个/μ㎡或＜1个/μ㎡。反之，使用湿热盐酸处理基体，则可得到高Si－OH含量；使用碱性洗涤剂处理基体表面，则可形成硅醇阴离子。硅烷偶联剂的可润湿面积（WS），是指1g硅烷偶联剂的溶液所能覆盖基体的面积（㎡/g）。若将其与含硅基体的表面积值（㎡/g）关连，即可计算出单分子层覆盖所需的硅烷偶联剂用量。以处理填料为例，填料表面形成单分子
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结 二、包涵体的洗涤? 1、包涵体的洗涤问题? 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。? 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。? 2、如何得到比较纯的包涵体? 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3?mM。去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。? 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。? 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。? 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实
硅烷偶联剂的使用方法
一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X ，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-丫。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeC、OOVi 及CH2-CHOCH－2O 的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2- CHCH2及H2N-硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N-及H2NC0NH硅烷偶联剂；聚烯烃选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而， 光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕 3 种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中丫与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的Si—OH含量。已知，多数硅质基体的Si —OH含是来4-12 个/卩叭因而均匀分布时，1mol硅烷偶联剂可覆盖约7500m2的基体。具有多个可水解基团的硅烷偶联剂，由于自身缩合反应，多少要影响计算的准确性。若使用丫3SiX处理基体，则可得到与计算值一致的单分子层覆盖。但因丫3SiX价昂，且覆盖耐水解性差，故无实用价值。此外，基体表面的Si-OH数，也随加热条件而变化。例如，常态下Si —OH数为5.3个/卩川硅质基体，经在400C或800C 下加热处理后，则Si —OH值可相应降为2.6个/卩卅或V 1个/卩讥反之，使用湿热盐酸处理基体，则可得到高Si —OH含量；使用碱性洗涤剂处理基体表面，则可形成硅醇阴离子。硅烷偶联剂的可润湿面积（WS，是指ig硅烷偶联剂的溶液所能覆
包涵体复性注意事项和常见问题解析
活性蛋白整体方案包涵体复性注意事项和常见问题解析 包涵体复性注意事项 1)最适pH值范围为8.0-9.0之间； 2)温度适宜选择4℃； 3)复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL； 4)复性时间一般为24-36小时； 5)低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在 非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6)首先要获得较高纯度的包涵体； 7)包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施； 8)透析前后均要离心； 9)包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100； 10)包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性； 11)复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h； 12)复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定 13)TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用Triton洗涤有些包涵体 效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。 14)复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白 在低浓度时不稳定，很容易变性。 包涵体复性常见问题分析 包涵体复性原则 低浓度，平缓梯度，低温。n(O5~0q8D; 怎样洗涤包涵体？ 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。 对于尿素和盐酸胍该怎么选择 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度
硅烷偶联剂使用说明
硅烷偶联剂使用说明 一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-Y。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeCOO、Vi及CH2-CHOCH2O－的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2－CHCH2O及H2N－硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N－及H2NCONH－硅烷偶联剂；聚烯烃多选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而，光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。 硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕3种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中Y与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的
蛋白质、包涵体复性
目录 一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用 二、包涵体变复性 三、包涵体洗涤纯化——7~10 四、包涵体提出、纯化和复性
一、
二、包涵体变复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。 基本信息 中文名称 包涵体变复性 复性方法 稀释复性 原因 基因工程菌的表达产率过高 包涵体变性 破菌洗涤溶解 目录 1包涵体 2包涵体变性 3包涵体复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 包涵体的形成原因 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决 包涵体的纯化和复性总结 包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤： 包涵体的洗涤 包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。 包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。 包涵体的溶解 变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不
溶的包涵体。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。 另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。 常用变性剂对比 尿素（8-10M） 较盐酸胍慢而弱，溶解度 为70-90% 用尿素溶解具有不电离，呈中 性，成本低，蛋白质复性后除去不会 造成大量蛋白质沉淀 溶解的包涵体可选用多种色谱 法纯化 盐酸胍（6-8M） 溶解能力达95%以上，且 溶解作用快而不造成重组蛋白 质的共价修饰 成本高、在酸性条件下易产生沉 淀、复性后除去可能造成大量蛋白质 沉淀 对蛋白质离子交换色谱有干扰 包涵体的复性 复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束；盐酸胍可以从4M开始，到1.5M 时结束。复性方法主要采用稀释复性，透析复性和柱上复性，具体对比如下：
包涵体复性(课堂参照)
我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。 再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。 出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。 至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。 如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。TGE配法如下： 50mM Tris 0.5mM EDTA 50mM Nacl 5%或10％甘油 如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。 沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度? 046 wrote: 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 先过柱後复性。 蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白
蛋白质变性机理
蛋白质变性机理 1、蛋白质介绍 2、蛋白质变性结果 1)活性丧失 蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只要轻微变化即可引起生物活性的丧失。 2）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来, 分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低 蛋白质分子凝聚从溶液中析出
3）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。 4）致变因素 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。 反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。蛋白质的变性很复杂，要判断变性是物理变化还是化学变化，要视是物理变化 加热、紫外线照射、剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性，主要是破坏蛋白质分子中的氢键，在变化过程中也没有化学键的断裂和生成，没有新物质生成，因此是物理变化。 否则，鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了。而我们知道，熟鸡蛋依然有营养价值，其中的蛋白质反而更易为人体消化系统所分解吸收。 5）复性
硅烷偶联剂的使用方法
硅烷偶联剂的使用方法 硅烷偶联剂的使用方法主要有表面预处理法和直接加入法，前者是用稀释的偶联剂处理填料表面，后者是在树脂和填料预混时，加入偶联剂的原液。 (1)表面预处理法 将硅烷偶联剂配成0.5～1%浓度的稀溶液，使用时只需在清洁的被粘表面涂上薄薄的一层，干燥后即可上胶。所用溶剂多为水、醇（甲氧基硅烷选择甲醇，乙氧基硅烷选择乙醇）、或水醇混合物，并以不含氟离子的水及价廉无毒的乙醇、异丙醇为宜。除氨烃基硅烷外，由其它硅烷偶联剂配制的溶液均需加入醋酸作水解催化剂，并将pH值调至3.5～5.5。长链烷基及苯基硅烷由于稳定性较差，不宜配成水溶液使用。氯硅烷及乙氧基硅烷水解过程中伴随有严重的缩合反应，也不宜配成水溶液或水醇溶液使用，而多配成醇溶液使用。水溶性较差的硅烷偶联剂，可先加入0.1～0.2%(质量分数)的非离子型表面活性剂，然后再加水加工成水乳液使用。硅烷偶联剂配成溶液，有利于硅烷偶联剂在材料表面的分散，溶剂是水和醇配制成的溶液，溶液一般为硅烷（20%）、醇（72%）、水（8%），醇一般为乙醇（对乙氧基硅烷）甲醇（对甲氧基硅烷）及异丙醇（对不易溶于乙醇、甲醇的硅烷）因硅烷水解速度与PH值有关，中性最慢，偏酸、偏碱都较快，因此一般需调节溶液的PH值，除氨基硅烷外，其他硅烷可加入少量醋酸，调节PH值至4—5，氨基硅烷因具碱性，不必调节。因硅烷水解后，不能久存，最好现配现用，最好在一小时内用完。 (2)直接添加方法 将硅烷偶联剂直接加入到胶粘剂组分中，一般加入量为基体树脂量的1～5%。涂胶后依靠分子的扩散作用，偶联剂分子迁移到粘接界面处产生偶联作用。对于需要固化的胶粘剂，涂胶后需放置一段时间再进行固化，以使偶联剂完成迁移过程，方能获得较好的效果。实际使用时，偶联剂常常在表面形成一个沉积层，但真正起作用的只是单分子层，因此，偶联剂用量不必过多。 硅烷偶联剂具体使用方法 （1）预处理填料法 将填料放入固体搅拌机(高速固体搅拌机HENSHEL（亨舍尔）或V型固体搅拌机等)，并将上述硅烷溶液直接喷洒在填料上并搅拌，转速越高，分散效果越好。
什么是包涵体
包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。 包涵体（inclusion body） 基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。 特性 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 形成 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 在基因重组技术得到迅速发展之前，研究者就已经发现，细胞内人工引入反常的蛋白质（这些蛋白质可以看作是细胞的外源蛋白质），这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。这些蛋白质聚集的形态是明显的球形，这些球形的物质全部是蛋白质，并且通过非共价键的作用力形成，必须使用变性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）或者盐酸胍才能溶解。自从基因工程的蛋白质在大肠杆菌表达以后，人们逐渐发现这些外源蛋白质基因在细胞中的过量表达同样形成不溶性的状态。
偶联剂的运用
1.钛酸酯偶联剂 钛酸酯偶联剂的分子可以划分为六个功能区，它们在偶联机制中分别发挥各自的作用。六个功能区如下图所示： 功能区①（RO)m -起无机物与钛偶联。 钛酸酯偶联剂通过它的烷氧基直接和填料或颜料表面所吸附的微量羧基或羟基进行化学作用而偶联。 由于功能区①基团的差异开发了不同类型偶联剂，每种类型对填料表面的含水量有选择性，各类型特点： 1、单烷氧基型； 单烷氧基钛酸酯在无机粉末和基体树脂的界面上产生化学结合，它所具有的极其独特的性能是在无机粉末的表面形成单分子膜，而在界面上不存在多分子膜。 因为依然具有钛酸酯的化学结构，所以在过剩的偶联剂存在下，使表面能变化，粘度大幅度降低，在基体树脂相由于偶联剂的三官能基和酯基转移反应，可使钛酸酯分子偶联，这就便于钛酸酯分子的变型和填充聚合物体系的选用。 该类偶联剂（除焦磷酸型外）特别适合于不含游离水，只含化学键合水或物理键合水的干燥填充剂体系，如碳酸钙、水合氧化铝等。 2、单烷氧基焦磷酸酯型： 该类钛酸酯适合于含湿量较高的填充剂体系，如陶土、滑石粉等，在这些体系中，除单烷氧基与填充剂表面的羟基反应形成偶联外，焦磷酸酯基还可以分解形成磷酸酯基，结合一部份水。 i-单烷氧脂肪酸酯型
ii-单烷氧磷酸酯型 iii-单烷氧焦磷酸酯型 3、配位型： 可以避免四价钛酸酯在某些体系中的副反应。如在聚酯中的酯交换反应，在环氧树脂中与羟基的反应，在聚氨酯中与聚醇或异氰酸酯的反应等。该类偶联剂在许多填充剂体系中都适用，有良好的偶联效果，其偶联机理和单烷氧基型类似。 4、螫合型： 该类偶联剂适用于高湿填充剂和含水聚合物体系，如湿法二氧化硅、陶土、滑石粉、硅酸铝、水处理玻璃纤维、灯黑等，在高湿体系中，一般的单烷氧基型钛酸酯由于水解稳定性较差，偶联效果不高，而该型具有极好的水解稳定性，在此状态下，显示良好的偶联效果。 氧乙酸螯合型 乙二醇螯合型 功能区② -（--O……）--具有酯基转移和交联功能。 该区可与带羧基的聚合物发生酯交换反应，或与环氧树脂中的羧基进行酯化反应，使填充剂、钛酸酯和聚合物三者交联。 酯交换反应性受以下几个因素支配： 1、钛酸酯分子与无机物偶联部份的化学结构；
包涵体变性、复性及纯化
一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? "
蛋白质变复性
变复性的过程 E.coli 中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物。 生产研究中为了得到较高的目的蛋白的表达量，通常会采用较强的启动子(如λPL 、T7 或串联启动子) ,使外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的10 %～50 %. 然而胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性 .绝大部分高表达的重组蛋白质往往聚集成不溶的、无活性的包涵体形式, 极大地影响到后续的结构分析和活性研究工作, 开展对这些包涵体的复性工作已成为一个重要的研究方向。 包涵体是由蛋白质折叠中间体的聚集而形成的,任何影响中间体稳定的因素(如pH 值、离子强度、温度等) 都可导致包涵体的形成. 包涵体形成原因 1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。 3. 重组蛋白所处的环境，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间 体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。 蛋白复性的必要性 细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。复性过程是变性蛋白的重折叠过程。 对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠（即变性溶解) ,然后采用合适的复性方法促进变性，蛋白再折叠进而恢复活性. 一．包涵体的分离纯化 ①含包涵体的宿主菌细胞的破碎； ②将破碎液离心除去可溶蛋白（9000r 15min 4℃），获得包涵体； ③洗涤包涵体,以除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤，温和去垢剂TritonX-100等洗涤包涵体,然后离心（12000r 5min 4℃）取上清洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白。