分子生物学

第一章绪论

1．分子生物学的含义与研究内容：大分子的结构与功能

①广义的

②狭义的（P1）

狭义的分子生物学的研究内容：①核酸的结构与功能（DNA、RNA、非编码序

列）

②基因的结构与功能：基因概念的变迁

③基因的表达调控

④基因功能实现的过程：代谢途径的复杂性分子生物学与其他学科的关系

2．分子生物学发展简史：

①遗传学起始：孟德尔，奥地利人， 1865年发表《植物杂交试验》，1884

年逝世，1900年再发现。

摩尔根，果蝇（白眼）（1960―1915年找到85种突变型）：

启示：实验材料

与此同时：⑴染色体成对出现

⑵染色体一个来自父本，一个来自母本

⑶随机分配可解释经典定律

②1871年第一次提取到DNA

③1944年Avery提出DNA是遗传物质：（90%乙醇沉淀DNA）

光滑型致病（S）死

粗糙型（R）活

1952年 T2噬菌体研究外壳蛋白内装DNA Hershey(赫尔希)与学生

④1949年 Chargaff等发现A、G、C、T，A=T、G=C

同时：X射线技术证明DNA有螺旋结构，三螺旋？

⑤1953年 Watsm、Crick提出DNA右手双螺旋结构模型

Sanger纸电泳层析技术：揭示胰岛素一级结构，X射线衍射技术证明肌红蛋白、血红蛋白的三维结构。

⑥Jacob 、Monod 乳糖操纵子假说，1961年、仅负调控

预言mRNA存在，导致其发现，促使密码子开始被研究

⑦1961年第一个遗传密码子破译 Nirenbery与Ochoa等

精彩的实验设计 UUU→苯丙氨酸

⑧1972年伯格第一次实现DNA分子的体外重组

⑨哺乳动物克隆技术

3．面临的问题

①克隆人的伦理问题：我们是不是上帝，到底有什么是神灵不可侵犯的？ a：对传统家庭成员间关系冲击

b：对传统家庭构成的冲击，成长环境

c：克隆人的权利与器官移植

d ：生殖中基因退化问题（同基因人相遇）

②人类基因组计划与人类隐私权：种族主义

③基因工程是否安全：

无论如何分子生物学已成为带头学科：表现在诺贝尔奖上

1962年化学：测定肌红蛋白、血红蛋白的分子结构（三维）

1958年化学：Sanger 牛胰岛素一级结构

1989年化学：核酸测序

1993年化学：PCR 技术

第二章 生命的物质基础

1．生物进化的关键步骤

①有机物产生 ②生命产生

1953年Miller ：原始大气成分 2H O 、2H 、4CH 、3NH 80℃烧瓶放电一周，

出现简单的氨基酸以及一些有机酸如：甲酸、乙酸、丙酸、乳酸

2．生命的传统定义

四个特点：①新陈代谢 ②应激性 ③生长发育 ④遗传和变异

热力学观点：生命是一个远离平衡状态的稳态，是一个开放体系。

3．组成生命的元素

生命中元素含量与地壳不同：地壳中最多的是O 、Si 、Al 、Fe

生命中为 C 、H 、N 、0 96%

C 、H 、O 、N 的特点；

①它们易借共用一个或两个电子对以形成共价键，H 元素1个、O 元素2个、N 元素4个，同时C 、N 、O 均能形成双键

②它们是能形成这些共价键的最小元素

③C 原子可彼此接受，即可供出4个电子，又可接受4个电子，形成骨架

4．生物大分子

①生物大分子的特点：a.是由简单单体聚合而成的高分子有机物。 b.单体具有多效性

c.功能的发挥取决于其空间结构：酶的锁与钥匙学说

d.蛋白质分子一级结构携带了决定其空间构型的一切

信息，一物种与物种之间的生物大分子种类并无本

质区别，但其数量、比例却有很大区别

②生物大分子的构象与构型

手性、镜象关系、双键平面

5．生命中的化学键

①共价键

②离子键

③范德华力：产生基本原因、特征

④氢键：较大的原子与H 形成共价键后，H 带部分正电

水： ⑴高比热；⑵高气化热；⑶高分子内聚力；⑷很好的流动性；

⑸特殊密度性质；⑹电解为H+、OH-

夹角05.

10-S

104、每分子与其他分子形成4个氢键、半衰期11

⑤配位键：P20

6．过程的自发性：

过程按降低自由能的方向自发进行。

自由能：在常温下、常压下可用于做功的能。

第三章细胞

1．原核细胞与真核细胞：

原核细胞：无内膜系统（核膜、细胞器）、细胞体积小、表面积大、DNA为环

状、无染色体结构

2．E．coli

杆状菌，大小0.5?2μm，革兰氏阴性，DNA双链环状，DNA含1400以上基因，

基因组总为4.6?6

10bp，总长1100-1400μm。

质粒：存在于细胞中的一类独立于染色体的自主复制、表达的遗传成分，绝大多数为环状双链DNA分子，可稳定处于主DNA外，但在一定条件下会

可逆地整合在寄主的主DNA上，随主DNA复制而复制，并通过细胞分

裂传给子代。

第四章 DNA的结构

DNA结构与基因表达有密切关系：DNA结构决定基因与蛋白质的结合功能

1．多核苷酸链

值得注意的是：P上带有负电荷，影响稳定，在细胞中由碱性组蛋白与离子等结合

DNA与RNA的区别：2’位O有无，影响RNA稳定性

①RNA分子自发水解：特别在强碱下，原磷酸键与 2’-OH形成 2’, 3’-磷

酸二脂而后进一步水解成2’-单核苷酸，3’-单核苷酸。

pH11.5时以上过程迅速发生

②2位点存在的OH是RNA酶的作用位点。RNA酶180℃十小时失活，无需二价

阳离子做辅酶或辅基

③多为单链，易遭攻击。

2．DNA构象家族

右手家族：A-DNA、B-DNA、C-DNA，局部左手螺旋：Z-DNA

Watson与Crick ：B-DNA 钠盐在一定湿度下结构

当B-DNA脱水时，B-DNA C-DNA逐渐拧紧变为A-DNA（分子遗传P13）

由于多核苷酸骨架中磷酸二酯键的两个O-P与多核苷酸的N-苷键可转动，构象是一系列的家族

Z-DNA：发现时使用的是d（CpGpCpGpCpG）

目前发现生理状态下的DNA有Z型，其存在条件表明,构象间随条件不同而相互转化，可能是基因调控的方式

3．超螺旋DNA（质粒DNA）

开始在环形DNA中发现（SV40），其后发现在几乎一切DNA中（环型、线型DNA中）均存在

双螺旋DNA放松可得负超螺旋，拧紧可得正超螺旋。

超螺旋使DNA上储备了能量，约占总DNA 5%

单链泡状结构

效应：使DNA拧得更紧，电泳率加大

拓扑异构酶：使DNA骨架上形成暂时性断裂，DNA多核苷酸链得以穿越，改变螺旋状态，不改变序列

真核生物的负超螺旋存在于核小体的缠绕上

4．DNA分子的变性与复性

①什么是DNA的变性：

增色效应变性特点 Tm值（P4）

热变性，pH11.3以上时碱变性，盐浓度低于0.01mol/L

②什么是复性

成核作用与拉拉链作用

a.变性不完全时

b.变性完全时：碰撞下组合与长度、浓度、复杂程度有关，

非原配分子

cot曲线：变性越快，cot越陡

③分子杂交：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA，标记，分子杂交实验

④DNA分子的呼吸作用分子遗传P9

5．遗传物质的存在状态

①大肠杆菌DNA：（亦有人称染色体）其它与基因表达有关的蛋白质

在其对数生长期，有细胞有2-4个同样的DNA分子：

类核： DNA结合蛋白位于核心，将双链环状DNA结合成脚手架结构，约100个小区

②真核生物染色体

a．DNA的蛋白质

真核生物的DNA蛋白质：非组蛋白质：复制、重组、转录有关

蛋白质：DNA 2：1（质量比）

组蛋白是染色体的结构蛋白，与DNA组成核小体，组蛋白分为5种：H1、

H2A、H2B、H3及H4（现代分子生物学P19）组蛋白有如下特征：⑴进化极端保守性：特别是H3与H4

⑵无组织特异性

⑶AA分布不均匀

⑷修饰作用

非组蛋白：多种多样（与基因调控有关，也可能与染色体稳定有关）

b．染色体组织方式

染色体平时以染色质的形态出现，电子显微镜观察是由核小组成的念珠

状结构，可以看到一条细丝连接着的一串直径为10nm的球状体。核小

体间的DNA 称为接头DNA ，从无特异性的DHaseI 切割可得n 200的单位，表明其它部分受保护；10nm 每圈6个形成直径30nm 中空管。

研究表明：核小体是由,,,,4322H H B H A H 各两个分子生成的八聚体和大

约200bpDNA 组成。H 1在核小体外面

c ．一些DNA 序列的不寻常结构

DNA 的不寻常结构并非一个专有名词，揭示现有的DNA 结构：如Z-DNA 、

十字形结构、单链泡状结构

要指出的是：所有不寻常结构均是按生物大分子的形成规则去形成的，

只是由于其组成成分特殊而形成不寻常的结构。（书P94）

第四章 DNA 的复制

一．DNA 复制

1．DNA 复制的半保留与半不连续

先导链与后随链、岗崎片断、1968年岗崎：H 3-脱氧胸苷标记

N15→N14 第一代中间，第二代轻链与中间各一半 。

2．DNA 复制的方向与速度

①复制起始原点

复制子：原核一个，真核多个

大肠杆菌：a. A-T 56%

b ．部份序列保守，部份数目恒定

c ．无大于20密码子ORF

②方向与速度：多为双向同速

a ．Q 复制（西塔）：证明E.coli 双向等速复制（插入或缺失）

b ．D 复制：线粒体（动物）：一条合成60%以上

c ．Σ复制（西格马）\滚环复制：双链切断，5’可结合蛋白，

3’甩出，某些噬菌体DNA ￠X174

3．原核生物DNA 聚合酶特性 《现代分子生物学》（第二版）P47

Ⅰ Ⅱ Ⅲ

5’-3’聚合 √ √ √ 5’-3’外切

√ × × 3’-5’外切 √ √ √ 5’-3’内切 √ × ×

为什么只从5’-3’？

a ．三磷酸不易正确配对

b ．修复时该结点仅一个磷酸

4．参与原核生物DNA 复制的蛋白质

①DNA 螺旋酶：促进DNA 分子解链，与SSB 协同作用，作用于DNA ，具有

ATP 水解酶活性

②拓扑异构酶：与负超一起协同解链

③SSB蛋白：原核生物有协同作用，牛、鼠、人中无，保持单链稳定

④引发酶：RNA聚合酶

5．E．coli复制起始（许多与起始有关的蛋白并不参与复制）

①起始蛋白DnaA识别并与oril结合→可促进DNA解链或使DNA发生扭曲

使DNA解螺旋酶能进入，帮助与复制叉组装和功能有关的其它因子加入

②可能DnaB进入（螺旋酶）：识别潜在单链结构与拓扑酶结合解链，SSB

稳定，DnaB与6个DnaC形成DnaB/DnaC复合体，与oril结合形成预引

发体

③预引发体引入其它蛋白并引入引发酶形成引发体，在后随链上前进，生

成短的RNA引物

④先导链RNA的形成很可能是RNA聚合酶的转录而成（转录激活）：

RNA聚合酶对利福霉素敏感，引发酶不敏感。

二．岗崎片断还是尿嘧啶片断：

dUTP：dTTP=1：300 如在体外进行无dUTP

H3-胸腺嘧啶→片断数目是预期2倍左右，1000-2000b

尿嘧啶糖是酶，AP内切酶

三．DNA复制中的5末端缺失（环形分子无）（《分子遗传学》）张玉静P133）

1．少数噬菌体环化

2．T4连环分子末端冗余

3．某些生物以蛋白质为引物

腺病毒

四．端粒与端粒酶：

1．端粒：30-40年代Muller、Moclintock：端粒不融合，保证染色体间不融合、末端不受酶切（以P.保护）

1978年 Blackburn等人，单细胞四膜虫，短的（TTGGGG），不同个体重复的数量不同，总长度约：370n520bp

2．端粒酶：1984年，Blackburn将合成的端粒与四膜虫提取液混合在一起，发现端粒得到延伸〈在低等真核生物中〉

是一种含RNA的蛋白复合体，所含RNA长约150核苷酸，并约含1－5拷贝的CyAx序列，可能是合成端粒的模板，其蛋白质有逆转录酶活性

①端粒酶在单细胞生物体中应存在，但在体细胞中因找不到

②1989年，Morin首次在人的癌细胞系中发现了端粒酶，但并非所有肿瘤

均有端粒酶

五．癌基因与抑癌基因

1926年菲比格（丹麦）：寄生虫致癌学说（J.Fibiger）

1966年劳斯（美国）：对致癌病毒的研究（F.P.Rous）

1975年杜尔贝科（R.Dulbecco）、巴尔的摩（D.Baltimore）、特明（H.M.Temin）美: 发现病毒在体内的致癌机理

1988年埃利昂(女)(G.Elion) 、希钦斯(G.Hithings)美: 抗癌药物及机理1989年毕晓普(M.Biahop)、瓦慕斯(H.Varmus)美: 正常细胞中存在原癌基因

1.病毒癌基因:

1910年美国洛克菲勒医学研究所的Rons发现提取自鸡肉瘤的无细胞滤液中有一种病毒→放弃，几十年后，1966年获诺贝尔奖

①病毒中的癌基因

某些RNA病毒可通过逆转录合成DNA，具有使细胞癌变的能力→肿瘤病

急性转化病毒：真正携带可诱发癌症的遗传信息

慢性转化病毒：并不携带癌基因，可能因其基因插入宿主细胞某些基因

附近而引起癌变

分离到的癌基因有几十种，其中很大一部分有癌基因产物

2、细胞癌基因

能与病毒癌基因杂交→有一部分是病毒癌中没有的，近百种

①病毒癌基因与细胞癌基因相比较，通常失去了两端的某些序列

②病毒癌基因缺乏内含子，而细胞癌基因中有，其外显子序列与细胞癌同

源性强（mRNA=cDNA）

③病毒癌基因与细胞癌基因的外显子有细微的差别（所以其具有转化能力）

原癌基因产物：维持细胞增长、分化

⑴生长因子有其类似物。⑵信号传递蛋白→引起细胞递增。⑶蛋白激酶。

⑷细胞生长核因子（DNA结合蛋白）

激活癌基因的因素：

⑴原癌基因突变⑵获强启动子⑶甲基化程度下降⑷拷贝数增加⑸基

因易位或重排

3．抑癌基因：功能不太明晰

①参与细胞黏合

②细胞周期负调控因子：终止细胞生长，促进细胞衰老、死亡

将单一抑癌因子导入癌细胞中未必能终止癌变

4．增变基因：

负责维持染色体组完整性和信息传递的保真度，该类基因的突变导致DNA错误率上升。

第五章转录

一．编码链与模板链、反义链

上游，下游转录起始位点：+1

二．RNA聚合酶

1．E．coli的RNA聚合酶：

大部分原核生物的RNA聚合酶的结构十分类似

E．coli中一个细胞中大约有7000个RNA聚合酶分子，其中一般有2500-5000个在参与RNA合成，速度在37℃下约为40b/s（有多种说法）

①核心酶：α2ββ，， +δ称为全酶

a．各亚基的作用：

⑴β亚基：可能具有与底物（NTP）及新生成的RNA链结合的能力

利福霉素可阻断新生成的RNA链转移至RNA酶的结合位点，阻断新生

RNA链的第3或4个核苷酸增加

链霉溶菌素可抑制延伸反应，二者均是与β结合的

⑵β亚基：可能与模板结合

肝素可与β亚基结合而抑制转录，并且可以与β亚基竞争DNA的结合

位点

⑶α亚基：可能参与全酶组装与全酶识别启动子，还可能与一些转录因

子结合

大肠杆菌T5和T7噬菌体RNA聚合酶仅一条多肽链，表明一条链即可完成合成，E .coli的多条链可能与功能复杂性有关（识别1000个以上转录单位的启动子）→真核生物的更复杂。

b．核心酶与DNA结合

松驰型结合，结合常数 2/mol半衰期60min，属DNA磷酸基因与蛋白质碱性基因间非特异吸附

③δ因子：α2ββ+δ＝全酶

a．作用：负责模块链的选择和转录的起录，是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子→加入δ因子后使RNA聚合酶与DNA上非

特异结合下降了几百-几千倍，使结合半衰期小于1s，使酶与启动子

区结合常数提高几百倍，半衰期达数小时甚至数十小时。

例：核心酶在T7噬菌体DNA上有约1300个结合位点，平均结合常数

2 X 1011，加入δ后，两大类，大部分在108-109间，仅8个在1012-1014 b．δ因子的替换

E．coli中，δ因子与转录因子协同可识别不同启动子

通常情况下，E.coli中用δ70（rpoD编码），rpoH编码δ32热休克

蛋白，rpoN编码δ54缺氮使用。

分子伴侣：概念及其特征

在枯草杆菌中有约10种δ分子，δ因子的更替意味着生活史的更替，

δ55主要出现在营养细胞中，δ29主要出现于孢子形成阶段

噬菌体SPO1感染：早期基因 4-5min后中期，8-12min后晚期基因

早期基因有与寄主相同启动子，由宿主α2ββδ43转录，中期基因

转录28编码δ因子（gp28）以修饰宿主RNA聚合酶，中期基因33、

34（gp33、gp34）代替gp28

2．真核生物的RNA聚合酶

定位转录产物相对活性

对鹅膏蕈（xun）碱敏感

性

RNA polⅠ核仁tRNA 50%-70% 不敏感RNA polⅡ核质核RNA 20%-40% 敏感

RNA polⅢ核质tRNA 10% 不同种类的敏感性不同

分子量均很大为500KD以上，由8-14亚基组成（不能正确选择启动子）线粒体与叶绿体中还存特殊的RNA聚合酶

三．启动子

指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合区

1．确定启动子区域的方法

①足迹法：内切酶切割末端标记的DNA分子

②修饰法：结合部位不被修饰

2．原核生物的启动子

①转录起始位点〉90%以下的为嘌呤，绝大多数为A

②-10区（Pribnow框）：TATAAT， RNA聚合酶的牢固结合位点，解链区

③-35区 TTGACA（Sextama框）：δ因子识别位置，初始结合位置

④-10—-35区距离：17b

3．真核生物启动子：

①RNA聚合酶Ⅰ的启动子：只转录rRNA，核心启动子（-45--+20），上游调

控元件（UCE -180—-107）

②RNA聚合酶Ⅱ的启动子：最复杂

a．帽子位点，转录起始位点，大多为A（非模块链）

b．TATA框（Hogness框）：-30处 TATAA（T）AA（T）

c．CAAT框 -75bp GGC（T）CAATCT 影响最大

d．GCbox：-90Ｂ左右 GGGCGG 每启动子可有多个拷贝

③DNA聚合酶Ⅲ的启动子：（5SrRNA、tRNA、SnRNA）

5SrRNA、tRNA：内部启动子

4.转录起始

①原核生物，RNA聚合酶与启动子结合后，与DNA形成封闭型启动子复合物，

然后-10区左右的DNA发生熔解，形成12-17b的单链区，形成开放型启动子复合物，二者均为二元复合物。这时RNA聚合酶大约与75bp的DNA（-55-+20）相互接触，在开放型启动子起始复合物中，RNA聚合酶上的起始位点和延伸位点被相应的NTP占据，在β亚基的催化下形成第一个磷酸二酯键，从而形成三元复合物，δ因子解离下来，形成复合物，此时核心酶约与55bp（-35-+20）的DNA相互接触

②真核生物RNA酶需其他辅助因子作用才能起始转录

对Ⅱ：通用启动子指RNA聚合酶Ⅱ可起始转录的最短的启动子序列，可在任何细胞内表达而无组织特异性，能使这类启动子起始转录所需的辅助因子称为基础转录因子

四．转录的终止（原核生物）

1．不依赖ρ因子的终止

终止位点上游存在一个富含GC碱基的二重对称区，由其产生的RNA很易形成发夹结构。随后有-4—8个A，转录为U，A-U不稳定，终止效率取快于发卡与U的长度

2．依赖ρ因子的终止

ρ：5

2 六聚体蛋白，有依赖于RNA的ATPase活性，RNA长度要大于50nt。

10

3．抗终止作用

①破坏茎—环结构②蛋白质抗终止→基因表达调控的一种方式

五．原核生物与真核生物mRNA特征比较

1．原核生物mRNA特点（原核生物rRNA、tRNA要进行转录后加工，而mRNA则不）

①半衰期短：一般认为转录开始1min后，降解就开始了

②以多顺反子形式存在：第一蛋白合成后，核糖体分解（但往往第一对第二有调控作用，打开mRNA二级结构）

③无5’帽子、3’尾，有SD序列与16SrRNA3’端反向互补

16SrRNA该与SD配对区自身可形成二级结构（解释）

2、核生物mRNA的特点

①5’加帽，反应快速，5’终端是一个在mRNA转录后加上去的甲基化鸟嘌呤。加“G”是由腺苷酸转移酶完成的，GTP与原mRNA上5’三磷酸腺苷缩合，第一个甲基出现在所有真核细胞mRNA中，由尿苷酸7’-甲基转移酶催化为“0”号，第二个是在第二个核苷酸2-OH上由2-δ-甲基是转移酶加一个甲基。“1”

号，真核生物以之为主，第二位为腺嘌嘧时，6

N甲基化。在1号基础上，第三位2’-OH上甲基化称“2”帽。

作用：a.为核糖体识别mRNA提供信号

b．增加mRNA稳定性

c．某些RNA病毒的正链RNA合成有关

②.3’加尾：多数真核生物（酵母外）mRNA3’有poly（A）尾巴：组蛋白无

poly（A）

poly（A）并非加于3’末端上，首先由一360KD内切酶与其他蛋白识别切割位点上游13-20碱基的AAUAAA与下游的GUGUGUG（少数例外），切除一段序列后，由RNA末端腺苷酸转移酶催化，以ATP为前体，在3’端加上poly（A）AAUAAA 保守性很强，过程很复杂。

Poly（A）是mRNA由细胞核进入细胞质中的必需形式，大大提高了mRNA在细胞质中稳定性。

③.内含子的剪接、编辑与化学修饰

RNA的编辑是指某些RNA特别是mRNA的一种加工方式，它导致了DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。

a.核基因mRNA的剪接。

⑴5’（左剪接点）GT-AG（右剪接点3’）内含子3端约302上b处有一

高度保守A

供体位点受体位点分支位点（高等生物无A时取靠近A的类似序列）。

⑵snRNA与剪接体

snRNA：核内小核糖核蛋白

真核生物细胞的细胞核与细胞浆中，存在着很多小分子RNA，长度在100-300个b，在酵母中可达到1000个b，细胞核中的小分子称为snRNA，位于胞质中的

称为scRNA，它们均以核蛋白形式存在，分别称为snRNP和scRNP，一个snRNP 一般含有一个RNA分子和10个左右蛋白质分子

参与剪接的成分形成一个剪接体系，称为剪接体（snRNA参与）

snRNp

⑶剪接机制：在剪接体参与下

转酯反应：UACUAAC的A向5’点发动攻击，开成酯键，游离的外显子3’端攻击受体切割位点换出一个套索结构

b.第一类内元的剪接，自剪切：中部核心结构

内部可形成明显二级结构，以之提供自剪活性位点

四膜虫rRNA内含子：体外进行无需能量，需要一价离子，二价离子，鸟苷酸辅助因子（GTP、GDP、GMP）只要求3’-OH，第一次G3-OH攻击5产生G3’-内含子与外显子3’-OH，外显子3’-OH，外显子3-OH攻击别一外显子并与之连接，入出线性内含子（可环化）

c.第二类内元的剪切：自剪切

最早发现于线粒体：剪切机制与真核mRNA相似，但无需外来因素协助

d.酵母tRNA剪接

分两步进行：第一步由核酸内切酶切断磷酸二酯键，该反应属非典型核酸酶反应不需ATP。第二步由RNA连接酶将断裂端连接形成tRNA分子，需ATP参与。由于切开的两个tRNA半分子每个5’为-OH，3’为2’-3’环形磷酸基因，需加入ATP使2’-3’磷酸变为’2-磷酸基团与3’-OH，5’-OH需磷酸化为磷酸基团，连接后还需去除2’磷酸，剪切才能完成

六．hnRNA

真核生物细胞核中有一类核RNA，十分不稳定，平均长度比mRNA要长，序列的复杂程度非常高，称为hnRNA。hnRNA以与蛋白质结合的状态存在，形成hnRNA，体外研究表明hnRNA的形状为一个球体和一个与之相连的纤维状结构。应该是mRNA的前体

①在真核生物细胞核中存在，代谢十分活跃，平均大小7

2?，大小十分不

10均一，细胞质中mRNA的平均相对分子质量仅为6

5.1?

10

②hnRNA很不稳定,半衰期仅5-15min,真核mRNA寿命较长

③以放射性同位素作脉冲标记表明，75%被标记的RNA是hnRNA，大部分位于

核内，只有1%进入细胞质

④hnRNA占细胞全部RNA的3%，表明其无法累积

⑤hnRNA也有poly（A），以标记表明，45-95%poly（A）RNA在核内，150min

后20%poly（A）RNA被运到细胞质中

遗传密码子：1。密码子的简并性，简并密码子的特征→第三位

AUG 、GUG 、UAA 、UAG 、UGA

2．密码的偏奇性

3．摆动学说：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱

基配对原则，第三对有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA 可以识别1个以上的密码子

tRNA 受体臂上3’末端未配对，最后三个永远是：3ACC 最后一个碱基的3’或2’自由羟基（-OH ）可以被氨酰化

tRNA 的稀有碱基有70余种，每个tRNA 到少含有2个稀有碱基，最多可有19个，多数位于非配对区，特别是反密码子3’端邻近位置出现频率最高，对于维持反密码子环稳定及密码子与反密码子配对是很重要的

核糖体必须包括至少5个活性中心：mRNA 结合部位，结合或接受AA-tRNA 部位（A 位），结合或接受肽基tRNA 的部位，肽基转移部位（P 位），形成肽键的部位（转肽酶中心）

小亚基：负责对序列特异的识别过程，如起始部分的识别，密码子与反密码子的相互作用等，mRNA 结合位点即在此亚基上

大亚基：负责氨基酸及tRNA 携带的功能，如肽键的形成、AA-tRNA 、肽基-tRNA 的结合等，所以A 位、P 位、转肽酶中心等主要在大亚基上

第六章 原核生物基因表达调控

一．乳糖操纵元

1961年Jacob 、Monod 提出

分解代谢的基本思路：外界有要分解的东西就开，无就关

1．基本结构 lacI ：阻遏蛋白，可与O 区结合，O 区以前称操纵基因，现称操纵子

lacZ ：β-半乳糖苷酶，将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，还可水解其它β-半乳糖苷

lacY ：透过酶，运输乳糖进入细胞

lacA ：乙酰基转移酶，将乙酰基转移到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖，在乳糖的利用中非必要成分，Z 基因的分解产物往往不能被进一步代谢，易积累产生毒害

2．负调控

①基本过程

②安慰性诱导物：乳糖↓，含硫乳糖类似物，异丙基巯基半乳糖苷（IPTG ）和 lacI P O LacE lacy lacA

多肽 1040 82 3510 780 825

3.8* 1.25* 3.0* 3.0* 四聚体 四聚体 膜蛋白 二聚体

阻碍子

巯甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用生色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。

③本底水平表达： a.第一个如何进入

b.真正诱导物是异构乳糖，如何生成？（ONPG）

非诱导状态下少量lacmRNA合成，每代大约1-5个mRNA分子

④Z：Y：A=1:0.5:0.2

与实际应用相区配：a.核糖体脱离

b.A此Z易于降解

⑤P区与O区 P→I基因结束到mRNA转录起始位点，共长82bp（-82）

O→－7—+28

P－ O重叠从而形成竞争，整个调节区划15bp，约为DNA螺旋12圈

⑥I、O、Z的突变（局部二倍体）

I+O-Z+/I+OcZ+ I-、Z-、Oc 永久表达、永久失活、诱导表达3．正调控

①葡萄糖抑制表达的可能机理：a.阴止了诱导物所引起的阻谒物失活

b.除去负调控外，还有其它基因共同调控lac

表达

②cAMP与CAP

cAMP：是在腺苷酸环化酶的作用下产生的（ATP），可受葡萄糖分解中一些产物调节

CAP：分解代谢物激活蛋白 /CRP：环腺苷酸受体蛋白

E.coli由Crp基因编码

③正调控机理：葡萄糖↑、cAMP↓、葡萄糖↓、cAMP↑

4．其它问题

①P区、O区与蛋白质的结合：O区-７－+28有对称性、对称中点位于+11

P区-67n-52有一对称区：可能是cAMP-CAP复合物结合位点

②影响乳糖操纵子的因素

a.I-、O-、Z-在局部二倍体中的排列

b.真正的诱导物是异构乳糖，如细胞中有能清除它的物质

https://www.360docs.net/doc/e213174867.html,cI的表达是弱启动子永久合成的，如其获得强启动子

https://www.360docs.net/doc/e213174867.html,c系统酶很稳定，停止诱导mRNA后，其酶活性需通过分裂次数上升而稀

释

e.当几个降解物敏感型启动子同时出现问题时，很可能是cAMP或CAP的合成

基因出现问题

f.阻遏物与RNA聚合酶谁先占据位点，则谁发挥作用

g.相对于Z来说，I的合成速度要慢得多，所以将I+Z+导入I-Z-中去时，Z

会先表达

二．色氨酸操纵子

合成代谢型操纵子的一般策略：外界有则关闭，外界无则打开

１、基本结构

P与O区也有很大重叠，O区20bp中的18bp形成反向重叠的对称结构。

2、阻遏系统

辅阻遏蛋白+trp+操纵区→不表达

辅阻遏蛋白+操纵区→不结合、表达

3、弱化系统：+123—+150缺失造成效率上升，如存在时，很多只转录出140bRNA 片断

前导区有AUG与UGA→14个aa多肽→前导肽（未提取到）10、11上连继两个trp

组氨酸：7个，苯丙氨酸7个

trpL转录后1、2、3、4区，弱化子有终止子结构，正常1-2、3-4、3-4配对形成终止子（茎环+poly（U））

多trp时，tRNA上带trp多，快速通过两个trp，转录出4时，到达2，2-3无法形成

少trp时，tRNA上带trp少，回忆录出4时，在1，2-3配对，3-4无法形成4．弱化与阻遏的关系

①可能是粗调与微调的关系，另可能阻遏物的空间结构转变慢

②当外界有大量trP时，防止140b前导RNA合成，防止浪费

三．原核生物的SOS修复系统

1．SOS机制的RecA、LexA

①SOS修复机制的特点：放松DNA聚合过程中的校正活性，并启动一些修复机

制表达

②RecA与LexA

RecA：在正常重组中起重要作用

a.重组活性

b.单链DNA结合活性

c.蛋白酶活性（需单链DNA）

RecA以依赖单链DNA的蛋白酶活性，作用于极少数蛋白，其中有LexA

有人认为是LexA具有潜在的蛋白酶活性，在RecA的诱导下激活，自体催化裂解

a. 当DNA受重伤时，RecA↑、LexA也拼命合成

（1200分子/C，上升50倍）

b. DNA完好时LexA↑关闭

③噬菌体的阻遏蛋白

噬菌体的适应性反应

四．魔斑核苷酸水平的调控

大肠杆菌营养缺陷（trp-his-）在缺少任何一种必须氨基酸的培养基上，不仅蛋白质合成速度立即下降，RNA合成速度也下降，称为严密控制（基因型rel+）而另一种突变型则RNA合成速度不变，称成松散控制（rel-）,rel+可合成鸟苷四磷酸（PPGPP），鸟苷五磷酸（PPPGPP）rel-则不能合成，因为这两种化合物是在层析谱上检出的斑点，称为魔斑。（GTP+ATP→PPPGPP+AMP→PPGPP）rel+的初始信号是空载tRNA比例的上升，由于将AA-tRNA转运到正在延伸的多肽链上需GTP，也许是大量GTP的积累启动了魔斑合成。PPGPP是多效的，但它是主要作用可能是影响RNA聚合酶与启动子结合的专一性，从而成为严密控制的关键。

SD序列的微小变化，可使表达效率上百倍甚至上千倍改变

SD与AUG之间相距一般以4-10个b为佳，9个b最佳。

第七章真核生物基因组结构及其基因表达调控

一．真核生物基因的重复序列

1．轻度重复序列

2-10个拷贝，中度重复序列10-几百个，高度重复序列(卫星DAN)

2．卫星DNA的等级结构及起源进化

小鼠卫星DNA234→117（有22个不同）→58bp（4个58bp的差异达40%）→（α亚单位）30bp（β亚单位）→三种9个相似重复单位

3 (原本相同）→27→58→116

9

不均等交换： XababababY

XabababXababY

XababababY

XababXabababY

二．真核生物的基因表达调控

1．顺式作用元件

①启动子

②增强子：

首先发现在SV40病毒中，在真核细胞中可能是通过启动子来增强转录的一种远端调控元件，在真核细胞中一般跨度为100-200bp，其核心常由8-12bp，可以有完整或部分的回文结构，常有数个8-12序列

特征：a.作用于同一条链DNA上

b. 无基因特异

c.许多有细胞或组织特异性

d.可在基因外或基因内

e. 无方向性

f. 可远离转录起始位点，常在1-4kb，多达30kb处

作用机制： a.影响模板附近DNA双螺旋结构

b.帮助RNA聚合酶寻找启动子

c. 增强子区可作为反式作用因子或RNA聚合酶Ⅱ进入染色质结构

的入口。

③沉默子

④绝缘子

效应无件：位于一组基因前端使该组基因应答同一转录调控因子的DNA序列。热效应元件（HSE）、血清效应元件（SRE）、糖皮质激素效应元件（GRE）

2．反式作用因子

①类固醇受体：与特定类固醇结合而得到激活

②锌指结构： Cys2/His2 Cys2/Cys2

锌指本身约23个aa 经常是锌指连锌指

③螺旋-转角-螺旋：（H-T-H）

这一类蛋白质中至少有2个α螺旋，中间由短侧链aa形成“转折”

④螺旋-环-螺旋：

每种两螺旋一侧有疏水残基表面，另一侧有带电基团形成的亲水表面：二聚体的任何一个无碱性区均缺乏与DNA结合的能力

⑤亮氨酸拉链：每隔6个aa后出现一个亮aa二聚体

⑥同源域蛋白：同源域指编码60个保守aa序列的DNA片断，可能与有机体

的生长、发育和分化密切有关。

3．金属硫蛋白基因的多重调控（P284）

BLE（基础水平元件，组成型表达）

TRE（组成型表达及应答，佛波酯试剂信号）

MRE（负责应答金属）：重金属中毒时表达,与金属结合再排出体外

GRE（应答类固醇信号）:糖皮质激素

第八章实验技术简介

（详见多媒体课件）

一．限制性核酸内切酶（分子遗传P151）

1．限制-修饰现象：

K B C

K 1 4

10-

10-4

B 4

10-

10- 1 4

C 1 1 1

2．限制修饰系统：

①Ⅰ：EcoK与EcoB为代表

限制R，修饰 M，识别 S，三个基因编码

S亚基起独立作用，R-M+只修饰，R+M-表现为R-M-→万一保守机制

Ⅰ类酶与识别位点结合之后，其必须M亚基与S-腺苷甲基硫氨酸（SAM）结合使酶变构处于始化状态，以便识别位点结合，半甲基化时以酶-SAM甲基化,非甲基化时限制

切割位点在1000bp以上，特异性差

②Ⅲ：K.亚基与MS亚基，R-则R-M-，MS中如负责识别的突变则R-M-，如发生

在M上，由R+M-，其修饰位点往往在A上，由于其识别序列常仅有一

条链有A，所以子代中一个完全无甲基化，可能限制，也可能修饰。③Ⅱ

二．核酸的分离与纯化

1．母液的配制

①减少系统误差与偶然误差

②方便使用，省时省力

注意：易分解物质不可用

2．酚-氯仿抽提核酸

3．质粒DNA提取

4．大分子量DNA提取

5．RNA提取

三．核酸电泳

1．Acr

2．琼脂糖凝胶电泳

①1oading buffer 、制胶与上样

②核酸显色

③回收DNA

四．DNA与cDNA文库

1．DNA与cDNA文库的基本制作方法

2．c DNA合成

3．DNA与cDNA文库区别

五．分子杂交

1．Southern, Northern, western,斑点：狭缝

2. Southan杂交

六、PCR

七、DNA体外操作

1、绪论

1.1 分子生物学发展历史掌握

1.2 分子生物学与各学科的关系了解

1.3 分子生物学的研究内容掌握

2、染色体与DNA

2.1 DNA的空间结构掌握

2.2 DNA的超螺旋结构掌握

2.3 DNA的变性与复性掌握

2.4 染色体的组成掌握

3、DNA复制

3.1 DNA聚合酶掌握

3.2 DNA复制的起始、延伸、终止掌握

3.3 DNA复制的末端处理掌握

3.4 端粒与端粒酶掌握

3.5 序列测定掌握

4、转录

4.1 RNA聚合酶掌握

4.2 转录的起始、延伸与终止掌握

4.3 真核生物转录后加工掌握

4.4 启动子掌握

5]、翻译（选讲）

5.1 密码子

5.2 tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶

5.3 蛋白质合成的起始、延伸与终止

5.4 蛋白质的翻译后加工、转运

6、原核生物的基因表达调控

6.1 乳糖操纵元掌握

6.2 色氨酸操纵元掌握

6.3 阿拉伯糖操纵元了解

6.4 半乳糖操纵元了解

6.5 魔斑水平的调控掌握

7、真核生物的基因表达调控

7.1 顺式作用元件掌握

7.2 反式作用因子掌握

7.3 真核生物基因组的可变剪接掌握

7.4 金属硫蛋白的调控掌握

8、DNA分子的突变与修复（选讲）

8.1 染色体变异

8.2 基因突变

8.3 修复机制

8.4 限制与修饰9、分子生物学实验技术（选讲）10、现代分子生物学前沿（选