MultiCycle 中文操作说明

MultiCycle for Windows 32-bit

中文操作说明

Introduction

MultiCycle for Windows 32-bit分析软件适用于分析细胞内的DNA含量、细胞周期（cell cycle）分析以及细胞凋亡（apoptosis）分析，藉由全自动化分析（fully automated analysis）或是手动设定分析（manual analysis）功能，迅速获得各种统计资料。利用MultiCycle for Windows 32-bit进行分析包含几个步骤：

1.在EXPO32 or CXP软件内将flow数据转存盘为histogram格式（*.hst）

2.在MultiCycle for Windows 32-bit分析软件内开启欲分析的档案

3.决定cell cycles数目

4.排除细胞碎片（debris）

5.执行分析

6.分析数据

透过MultiCycle for Windows 32-bit软件内键的快速功能键，让cell cycle分析更快速也更加方便，分析标准步骤中，配合常用的快速功能键如下：

＊开启档案

＊决定cell cycles数目

＊执行分析

Example 1: 分析两种细胞周期族群

（Fitting of a Two Cell Cycle Histogram）不正常的细胞（如：肿瘤细胞）通常DNA含量也会发生异常现象（大多数会增加），因此利用流式细胞仪分析细胞样品的DNA含量时，通常会出现二倍体（diploid）以及异倍体（aneuploid）两种不同DNA含量的细胞族群同时存在的现象，如下图：

实际得到的histogram图形无法将个别的cycling populations分开，而是看到两个cell cycles结合在一起的histogram图形（如下图），此时必须藉由MultiCycle for Windows 32-bit软件进行分析。分析方法包括：全自动化分析以及手动设定分析，分析步骤如下：

方法一：全自动化分析

1.在EXPO32 or CXP软件内将flow图形转存盘为histogram格式（*.hst）。

a.将鼠标点选至欲分析的PI单参数图形上（Histogram Plot），此时该图形

上方的标题字段变成蓝色，接着点选软件主选单的[File-Save Histogram File As]。

b.出现下方对话窗口，输入HST文件名称，按下[存盘]。

c.此时在档案总管（Resource Explorer）的HST数据夹中便会出现新增的

HST档案

2.在MultiCycle for Windows 32-bit分析软件内开启欲分析的档案。

a.开启MultiCycle for Windows 32-bit软件

b.点选桌面Open功能键，选择欲分析的HST档案

（档案类型选择 FCS）

开启的HST档案如下：

3.根据开启的档案数据，软件将会自动分析适当的细胞周期数目，若符合您的

实验预期，直接按下[OK]执行自动化分析，分析结果如下：

软件根据“TwoCell Cycles”模式自动分析出两种细胞周期族群的图形以及数据，同时根据六种不同的细胞周期模式进行“信赖度分析”（Confidence analysis）。当软件显示“The S phase confidence is good”，表示分析得到的数据具备高信赖度。

若需调整图形的X、Y轴截距，可以点选软件主选单的[Options- Rescale X/Y]

或是按三次功能键（8倍放大）修改图形。

MultiCycle for Windows 32-bit软件内建四种不同的数据表现格式[Display1、2、3、4]，你可以点选工具列上的[Options - Display] 选择不同的表现格式。若是执行信赖度分析，建议选择[Display2] 或是[Display3] 。

若需要进一步以手动设定模式修正分析条件，可以点选软件主选单的

[Analyze -- Refit]或是功能键重新调整分析条件。

方法二：手动设定分析

当自动化分析结果需要做进一步修正，可以利用手动设定模式进行分析。若已经执行[Refit ] 动作，直接进入步骤4。

1.开启欲分析的HST档案

2.手动设定分析条件

a.建议您直接点选[Analysis-Auto Detect Cycles ] 或是功能键，让

软件自动侦测cycles数目（one, two or three cell cycles皆可使用此功能）。

b.此外，若分析的图形包含两个cell cycles (diploid and aneuploid)，也可以

直接点选[Analysis-2 Cycles] 或是功能键。画面上将会出现代表

二倍体平均值[G1 Mean]的红色直线，以及异倍体平均值[A1 Mean]

的绿色直线。

c.首先点选[G1 Mean] 功能键，然后将鼠标箭头移至二倍体cell cycle的

G0+G1 phase peak最高点（建议指在Peak顶点偏左边），按一下鼠标左键指定G1 Mean值。

d.接着点选[G2 Mean] 功能键，然后将鼠标箭头移至二倍体cell cycle的

G2+M phase peak最高点（建议指在Peak顶点偏右边），按一下鼠标左键指定G2 Mean值。

e.接着点选[A1 Mean]功能键，然后将鼠标箭头移至异倍体cell cycle的

G0+G1 phase peak最高点（建议指在Peak顶点偏左边），按一下鼠标左键指定A1 Mean值。

f.最后点选[A2 Mean]功能键，然后将鼠标箭头移至异倍体cell cycle的

G2+M phase peak最高点（建议指在Peak顶点偏右边），按一下鼠标左键指定A2 Mean值。

3.排除细胞碎片（debris）

a.勾选[Background Fit] 选项，出现相关窗口如右下图：

b.直接点选[OK]，此时软件自动分析出debris范围（如下图）。

Default

debris region

c.最后在Two Cell Cycle窗口内点选[OK]执行最后的分析，结果如下图：

4.输出分析结果

若希望将结果打印出来，直接点选[File-Print]。或是点选[File-Export] 选择要将分析图形输出成图形文件[Picture]，或是将分

析数据输出成 Excel 档案格式[Data]，或是两者都要。

5.信赖度分析（Confidence analysis）

MultiCycle分析软件提供六种不同信赖度分析模式，分别为：

Model 1 - 1 st Model Fit (SL S0)

Model 2 - Sliced Nucleus Debris ( Sliced Bkgd)

Model 3 - G2/G1 Ratio Constraint (+G2/G1 Fixed)

Model 4 - Aggregate Modeling (+Aggregates)

Model 5 - S Order = 1 (+S order=1)

Model 6 - CVs Fixed (+CVs Fixed)

你可以点选软件主选单的 [Analyze-Confidence ] 选择想要使用的信赖

度分析模式，或是直接点选桌面上

功能键，即可

得到信赖度分析结果。

信赖度评语 : 针对多倍体给予简洁的描述，显示S phase 以及G2 phase 的 统计百分比，以及对于S phase 的信赖度评语。

Summary Table :

显示六种信赖度模式分析得到的S phase 以及G2 phase 统 计数值。

信赖区间

Example 2: 分析三种细胞周期族群

（One Diploid And Two Aneuploid Peaks）

1.开启欲分析的HST档案（档案类型选择 FCS）。

2.选择[Analyze - 3 Cycles]或是桌面上功能键。

Note:若你执行自动化分析功能[Auto Detect Cycles ]，软件将会自动选择three cell cycle分析模式。

3.排除细胞碎片（debris）

a.任意改变Three Cell Cycle fitting options不一定能得到最佳的分析结果，

若你之前已经分析过其它数据，[Background Fit ]功能将会被软件自动

执行。若你尚未分析任何数据，请点选[Background Fit] 功能将细胞

碎片排除，然后按下[OK] 让软件自动执行分析。如下图：

b.按下[OK] 执行分析，分析结果如下：

4.信赖度分析（Confidence analysis）

a.点选软件主选单的[Analyze-Confidence] 选择想要使用的信赖度分析

模式。以此实验为例，选择将aggregate modeling加入sliced nucleus background fitting，需点选[+Aggregates] 选项，或是直接点选桌面上

功能键，即可得到信赖度分析结果。

b.你可以点选桌面上其它功能键，以执行另外五种

信赖度模式分析。注意分析图表内的信赖度评语以及图表下方的6-model

summary table，以及图表右方S and G2 confidence intervals数据。

5.最后你可以点选[File-Print] 打印分析结果，或是重新进行分析

[Analysis-Refit ]。

Example 3: 同时分析一个细胞周期以及一个DNA Peak

（ONE Cell Cycle And One Additional Peak）当细胞发生凋亡现象（apoptosis），其DNA发生断裂而出现大小不同长度的DNA片段，此时，细胞以酒精固度并且于细胞膜上打出小洞，于是小片段DNA 会漏出细胞外，因此细胞核内的DNA含量会出现少于2n的现象，称之为亚二倍体（Sub-G1 phase）。

然而，当我们使用MultiCycle for Windows 32-bit软件自动分析此类实验数据时，软件常常会选用two cell cycles模式进行分析，导致分析结果出现误差，因此必须选用[One Cycle + Overlapped Peak / Apoptotic] 功能进行数据的分析。

1.点选桌面Open功能键，开启欲分析的HST档案（档案类型选择 FCS）。

2.软件会先出现[Analyze TwoCell Cycles] 自动分析窗口，点选[Cancel]

关闭自动分析功能。

3.点选软件主选单的[Analyze – One Cycle + Overlapped Peak]。

4.当次目录出现，点选[Apoptotic] 选项进行分析。如下图：

Note:要选用何种 overlapped peak类型进行分析，必需根据先前对实验的了解，以及参考相关文献。

5.在 [Added Apoptotic Peak]窗口中，

确认 [G1 Mean]、[G2 Mean] 以及

[Apop. Pk Mean]位在希望的位置

上。

6.点选[Background Fit] 功能将细胞

碎片排除，并且将[Order of S] 设定

为 [1]，最后按下[OK] 执行分析，

结果如下：

7.分析结束，你可以点选工具列上的[Options - Display] 选择不同的数据表

现格式。若是执行信赖度分析，建议选择[Display2] 或是[Display3] 。最后选择将分析结果打印出来，或是以图档格式输出，或是以其它模式重新分

析。

Example 4: 细胞同步化程度分析

(Synchronized Cultured Cells in S Phase) 当使用细胞周期抑制剂（cell cycle blocking agents）处理细胞时，会造成细胞发生同步化现象而停滞在特定位相（例如：S位相）。此时分析细胞样品的DNA 含量，即可发现异常的细胞周期。MultiCycle for Windows 32-bit软件提供的同步化分析功能即适用于分析细胞同步化程度之相关研究。

1.点选桌面Open功能键，开启欲分析的HST档案（档案类型选择FCS）。

2.软件会先出现[Analyze TwoCell Cycles] 自动分析窗口，点选[Cancel]

关闭自动分析功能。

3.点选软件主选单的[Analyze – Synchronous S-Phase]选项，或是直接点选

桌面上功能键，软件执行[Synchronous S-Phase] 分析功能。

4.软件自动分析出[G1 Mean]、[G2 Mean] 以及[S Peak Mean]位置，你可

以重新指定这三个位相平均值的位置。一般而言，建议将 S Peak Mean 放在细胞周期数据的正中间，或是 S-phase peak 最高点。此外，系统会自动勾选[G2 CV = G1 CV] 功能，此功能有助于分析同步化细胞数据。因为往往许多的细胞同步化实验中，G1 phase 或是 G2 phase 细胞无法和 S phase 细胞明显区分，此时藉由[G2 CV = G1 CV] 功能，能够帮助你更容易地进行数据分析。

5.最后按下[OK] 执行分析。你可藉由图表右方的统计数据计算细胞发生同

步化的比例。结果如下：