利用ITS序列鉴定真菌
北方民族大学实验论文
题目：利用ITS序列鉴定真菌
学院：生物科学与工程学院
专业：生物技术
班级： 082
姓名：李晓飞李妍吾木尔古丽
张瑞莉陈波艾克拜尔
指导老师：刘建利
完成日期：2011年5月18日——2011年6月5日
利用ITS序列鉴定真菌
李晓飞李妍吾木尔古丽张瑞莉艾克拜尔陈波
（北方民族大学生物科学与工程学院银川750021）
摘要：采用实验室提供的两株酵母菌，活化培养后，经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，所测序列经Genbank比对后，两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株(Sporobolomyces sp)和假丝酵母ST-50菌株（Candida sp）。
关键词：ITS序列酵母菌PCR 菌种鉴定
1 材料与方法
1.1试验材料与试剂
实验室提供的红色掷孢酵母菌[1]和白色产香酵母菌。
YEPD液体培养基[2]配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，配成1L溶液，分装100/250ml，121℃灭菌15min。
裂解液[3]：1L裂解液中需加Tris1.2114g，EDTA8.767g，SDS5g，用1M的NaOH调至8.0，121℃灭菌30min备用。
醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。
氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。
70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。
10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。
1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。1.2主要仪器与设备
表一实验中使用的主要仪器
仪器名称型号产地
立式自控高压蒸汽灭菌器LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂
数显恒温水浴锅HH-4 国华电器有限公司
电泳仪DYY-12 北京市六一仪器厂
制冰机AF200PSC50R ΜSA
生物安全柜HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司电冰箱BCD-219D 青岛海尔股份有限公司Sigma高速离心机3K30 Germany
电子精密天平HR-200 上海精科天平
酸度计DELTA302 上海
电子可调电炉101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司双层恒温振荡器THZ-9511K 太仓市实验设备厂
紫外分析仪WD-9403C 北京市六一仪器厂
台式常温高速离心机Centrifuge 5415D Germany
微量移液器多型号Germany
生化培养箱LRH-250 上海一恒科技有限公司
基因扩增仪Palm-Cyeler Aμstralia
电泳槽DYCZ-24A 北京六一仪器厂
1.3实验方法
1.3.1酵母菌的活化及培养
采用本实验楼4楼保藏的红色掷孢酵母菌和白色产香酵母菌[4]，先将菌株接于斜面中，25℃培养24h，再转接入三角瓶中100ml/250ml，25℃培养24h，保存于4℃冰箱备用[5]。1.3.2酵母菌基因组DNA的提取
DNA的提取按照Makimura等[6]（1994）的方法进行。
⑴用移液器吸取1ml菌液，置于已灭菌的1.5ml的离心管内，常温下12000rpm离心1min，弃上清；
⑵加入250μl裂解液；
⑶100℃水浴15min；
⑷加入250μl 2.5M的醋酸钾后，置于冰上30min至1h；
⑸在4℃下13000rpm离心5min，上清夜移至一新1.5ml离心管内；
⑹加入500μl的氯仿-异戊醇（24：1），剧烈振荡，13000rpm，离心15min，移取上清夜至另一灭菌的1.5ml的离心管内；
⑺重复上一步，直到两相之间没有沉淀，将上清液移至另一灭菌的1.5ml的离心管内；
⑻加入500μl的冷的异丙醇，放置在-20℃静置15min；
⑼13000rpm离心15min；
⑽用1ml70%的乙醇洗涤沉淀；
⑾用1ml70%的乙醇再次洗涤沉淀；
⑿将沉淀置于室温下干燥；
⒀加入50μl已灭菌的ddH2O，在室温下溶解2h；
⒁放于-20℃冷藏备用；
1.3.3酵母菌基因组DNA的检测[7]
⑴制备琼脂糖凝胶：将10×TAE贮存液用蒸馏水稀释成1×TAE电泳缓冲液,待用，按1％称取适量琼脂糖,置于250ml锥形瓶中，加入对应量1×TAE稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水份蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复3次，至琼脂糖全部熔化，放置，待其稍冷却。
⑵胶板的制备：将制胶槽置于水平支持物上,选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后，小心拨出梳子，将胶块取出，置于已加入足量1×TAE电泳缓冲液得电泳槽内。
⑶加样：取20μlDNA样品与2μl6×加样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中，在第
一个上样孔或最后一个上样孔内加入5μl的100bpDNA ladder。
⑷电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以5V/cm（约100V）电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。
⑸成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的长波长紫外灯下观察胶块，DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带，用凝胶成像系统照相(本实验中仪器损坏，直接用相机拍照)。
1.3.4 ITS片段的PCR扩增及扩增产物的检测
1.3.4.1 PCR反应体系见下表，于冰浴下进行[8]。
表二核糖体基因反应体系的组成（25μl体系）
试剂浓度体积(μl)
PCR缓冲液(包含TaqDNA
聚合酶、Mg2+和dNTP)
2.5×10
正向引物10 μM 0.2
反向引物10 μM 0.2
模板DNA 10 ng/μl -1 μg/μl 1.0
ddH2O 13.6
1.3.4.2 根据下表的引物和PCR反应条件对目的序列进行扩[9]。
表三核糖体基因PCR反应所用引物和反应条件
扩增片段引物(5’-3’)PCR扩增反应条件
ITS1区ITS1:GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG
ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC
95℃5min；(94℃45s，52℃1min，
72℃30s)×30；72℃8min。
1.3.4.3 PCR扩增产物的检测，采用琼脂糖凝胶电泳系统检测同1.3.3。
1.3.5 ITS片段的测序
将PCR扩增产物邮寄至测序公司，由测序公司完成测序。
1.3.6 BLAST比对、鉴定属、种
登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST-点击Format-得到result of BLAST。
2 结果与分析
2.1基因组DNA电泳图
图一酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
如上图所示，标号“1”为红色掷孢酵母菌的基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为白色产香酵母菌的基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳图；C 为对照组，无任何条带；标号“M”为Mark ，共有15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp 等8类DNA 片段，根据原图对比，本次实验只可以检测到15000、10000、7500、5000、3000、1500bp 等6类DNA 片段。酵母菌的基因组DNA 破损片段较小，从图中可以看到，红色掷孢酵母DNA 片段小于5000bp ，集中于3000bp 以下；而白色产香酵母的DNA 片段有大于15000bp 的，集中区段为5000到1500bp 。ITS1片段大小为500bp 左右，故这样大小的DNA 片段可以满足PCR 要求。
2.2PCR 产物电泳图
图二 酵母菌ITS1片段PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图
如上图所示，标号“1”为白色产香酵母菌的ITS1片段PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图；“C ”为对照组，物任何条带；标号“M”为Mark ，共有1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp 等11类DNA 片段，根据原图对比，本次实验只可以检测到1500、1000、900、800、700、600、500、400bp 等8类DNA 片段。从图中可以看到，白色产香酵母菌和红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR 产物大小均位于500-600bp 之间，与预测结果相符，目的条带前端存在干扰小条带，可能为引物二聚体所致。
1 1
2 2 C M
2.3菌株序列与鉴定结果
2.3.1红色酵母菌鉴定结果
⑴红色酵母菌ITS1序列：共594bp。
1 tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tagtgaatct aggacgttca atttaacttg aagtccgaac 71 tctcactttc taaccctgtg catttgtttt ggttagtagg attcgtctga acacctcttc atttacaaac 141 acaaagtcta tgaatgtata aagtttataa caaaacaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca 211 tcgatgaaga acgcagcgaa atgtgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg 281 aacgcatctt gcactccttg gtattccgag gagtatgtct gtttgagtgt catgaattct tcaaccctct 351 cttttcttag tgattggagc ggagtttgga ttctgagtgt tgctcctaac ccgagctcat tcgtaatgta 421 ttagcatcca tatttgagtt tcggattgac ttggcgtaat aagactattc gctgaggaat ctaacttcgg 491 ttagaagccg tgtttgaact aggaagctac taatctagct taagtctact tttagattag acctcaaatc 561 agataggatt acccgctgaa cttaaagcat atca
⑵与Genbank比对结果
⑶鉴定结果
红色掷孢酵母属于Sporobolomyces sp，TY-241菌株。其分类学地位如下：
Eukaryota;Fungi;Dikarya;Basidiomycota;Pucciniomycotina;Agaricostilbomycetes; Agaricostilbomycetes incertae sedis;mitosporic Agaricostilbomycetidae; Sporobolomyces.
真核生物；真菌界；双核亚界；担子菌门；柄锈菌亚门；冬孢菌纲；黑粉菌目；掷孢酵
母科；掷孢酵母属。
2.3.2白色酵母菌鉴定结果
⑴白色酵母菌ITS1序列：共551bp。
1 aaaccaacag ggattgcctc agtaacggcg agtgaagcgg caaaagctca aatttgaaag cctcggcatt 71 gtaatttcaa ggcggcagac cacaccgacc acaagtccat tggaacatgg cgccacagag ggtgacagcc 141 ccgtaggtcg cagcgcgtgt cttccgccaa agagtcgagt tgtttgggaa tgcagctcta acggtggtaa 211 attccatcaa aagctaaata ccggcgagag accgatagcg aacaagtaca gtgatggaaa gatgaaaagc 281 actttgaaaa gagagtgaaa cagtacgtga aattgttgga agggaagggt ttgggagcag acacggttcg 351 gccgggccag catcaattac gcgcgcgcca caaaacgccc gagaacgtaa gccgtctcgg tggttatagc 421 tcggcgccat agcgcgcgcg tgattgagga cagcatattc aggatgctgg cgtaatgctt ccaaaccgcc 491 cgtcttgaaa cacggaccaa ggagtctaac gtccatgcaa gtgtttgggt gcaaaacccc a
⑵与Genbank比对结果
⑶鉴定结果
白色产香酵母菌属于Candida sp，ST-50菌株。其分类学地位如下：
Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Saccharomycotina;Saccharomycetes; Saccharomycetales; mitosporic Saccharomycetales;Candida.
真核生物；真菌界；双核亚界；子囊菌门；酵母亚门；酵母纲；酵母目；隐球酵母科；假丝酵母属。
图三Sporobolomyces sp，TY-241图四Candida sp，ST-50
3 讨论
(1)酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果
由图一可知，所提取出来的基因组DNA片段比较小，只有5000bp以下，与酵母菌单染色体大小107bp相差较大。具体原因可能如下：在DNA提取步骤中，加完裂解液后要100℃水浴10min，时间可能过长，是DNA断裂较为厉害；在用氯仿异戊醇抽提蛋白质时，要剧烈摇动10min，这样的步骤也许会使DNA断裂；再者，使用高速离心机，其转速达到13000rpm，也可以使DNA断裂。Mark理论条带为8条，实际只有6条，可能原因为Mark量太少，上样时只用了5μl；或者TAE浓度有问题，浓度可能过高。
(2)酵母菌ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
由图二可知，酵母菌ITS1片段PCR产物大小为500-600bp，与文献中所说的情形类似。但是，在目的条带前端仍有模糊条带，可能为引物二聚体，原因为PCR反应体系中所加引物过多，产生了引物二聚体。
(3)菌株序列与鉴定结果
两株酵母菌的序列均与Genbank中对应菌株的序列一致，相似度100％，故可以将两株酵母菌鉴定出来，但Genbank中菌株没有具体名称，只有菌株编号，故这两株菌也只能具体到属，种名用菌株编号表示。
4 结论
采用ITS1片段鉴定酵母菌还是一种比较简便、快速、价格低廉的有效方法，此种方法也得到了广泛的应用。但在对酵母菌ITS1片段进行PCR扩増时，由于TaqDNA聚合酶存在一定的配错比，大概是10-6，可能使少数碱基发生改变，对测序产生一定的影响，尤其是对待新种的发表时。本实验中的红色酵母菌为掷孢酵母属(Sporobolomyces sp)TY-241菌株，白色产香酵母为假丝酵母属（Candida sp）ST-50菌株。
参考文献
[1]李明霞.不同掷孢酵母属产掷孢子的能力及担子菌酵母形成特大厚垣孢子的规律[J].真菌学报,1989.
[2]姜维,徐莹,刘文磊,汪东风,栾红蕾.生物吸附剂耐盐性鲁氏酵母培养基的优化[J].中国酿造,
分子生物学 常用引物序列
日常备库引物序列(5'-3') 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT 27F\8F AGAGTTTGATCCTGGCTCA 35S GACGCACAATCCCACTATCC 3'AD AGATGGTGCACGATGCACAG 3'AOX\AOX1rev GGCAAATGGCATTCTGACAT 3'BD TAAGAGTCACTTTAAAATTTGTATAC 5'AD\GAL4AD\P17110 TACCACTACAATGGATGATG 5'AOX\AOX1for GACTGGTTCCAATTGACAAGC 5'BD\GAL4-BD-Cfor TCATCGGAAGAGAGTAG 96gIII\M13-96 CCCTCATAGTTAGCGTAACG a-FACTOR\Alphafor TACTATTGCCAGCATTGCTGC BAC1 AACCATCTCGCAAATAAATA BAC2 ACGCACAGAATCTAGCGCTT BGH\pCDNA3.1R TAGAAGGCACAGTCGAGG CMV-24 TTAGGACAAGGCTGGTGG CMV-30 ATAACCCCGCCCCGTTG CMV-F\CMV-Profor CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG\ATGGGCGGTAGGCGT G CMV-R TCGTTGGGCGGTCAGC DuetDOWN1 GATTATGCGGCCGTGTACAA DuetUP1 GATCTCGACGCTCTCCCT DuetUP2 TTGTACACGGCCGCATAATC EBVrev GTGGTTTGTCCAAACTCATC EGFP-Cfor AGCACCCAGTCCGCCCTGAGC EGFP-Nrev CGTCGCCGTCCAGCTC GAL1-Profor AACATTTTCGGTTTGTATTACTTC GLP1 TGTATCTTATGGTACTGTAACTG GLP2 CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA
几种真菌的分离与鉴定教学文案
常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。
常用的β-actin 引物序列
human actin f ctc cat cct ggc ctc gct gt human actin r gct gtc acc ttc acc gtt cc product size:268 rabbit actin r agt gcg acg tgg aca tcc g rabbit actin f tgg ctc taa cag tcc gcc tag product size:295 mouse actin r cgt tga cat ccg taa aga cc mouse actin f aac agt ccg cct aga agc ac product size:281 rat actin f TCAGGTCATCACTATCGGCAAT rat actin r AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA product size:432 human actin r gag cta cga gct gcc tga cg human actin f cct aga agc att tgc ggt gg product size:416 mouse actin f tca tca cta ttg gca acg agc mouse actin r aac agt ccg cct aga agc ac product size:399 rat actin f CCCATCTATGAGGGTTACGC rat actin r TTTAATGTCACGCACGATTTC product size:150 rabbit actin f tct tcc agc cct cct tcc tg rabbit actin r cgt ttc tgc gcc gtt agg t product size:409 内参基因名称引物引物最佳退火扩增 基因库序列号引物名称序列位置Tm 温度C 长度 Human actin beta F305 ctgggacgacatggagaaaa 305-324 52.3 BC002409 R868 aaggaaggctggaagagtgc 868-849 52.6 59.4 564 F1379 agcgagcatcccccaaagtt 1379-1398 57.3 R1663 gggcacgaaggctcatcatt 1663-1644 56.3 54 285 Rat actin beta F18 cacccgcgagtacaaccttc 18-37 54.5 NM_031144 R224 cccatacccaccatcacacc 224-205 54.4 60.4 207 F694 gagagggaaatcgtgcgtgac 694-714 54 R1146 catctgctggaaggtggaca 1146-1127 53.2 57.1 452 Mouse actin beta F91 atatcgctgcgctggtcgtc 91-110 57.5 NM_007393 R607 aggatggcgtgagggagagc 607-588 57.8 60.4 517 F1566 gtccctcaccctcccaaaag 1566-1585 54.5 F1831 gctgcctcaacacctcaaccc 1831-1811 54.4 55.7 266 human GAPDH F369 agaaggctggggctcatttg 369-388 55.6 BC004109 R626 aggggccatccacagtcttc 626-607 55.1 57.5 258
真菌检测鉴定通用引物-Fungal Primers
ITS1: 5’-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Tm 55℃ NS17: CATGTCTAAGTTTAAGCAA NS3: GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC NS4: CTTCCGTCAATTCCTTTAAG NS22: AATTAAGCAGACAAATCACT NS24: AAACCTTgTTACgACTTTTA LR0R: 5’-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3’ LR3: 5’-CCGTGTTTCAAGACGGG LR3R: 5’-GTCTTGAAACACGGACC (complementary to RLR3R: GGTCCGTGTTTCAAGAC) LR5: 5’-TTAAAAAGCTCGTAGTTGAAC-3’ LR7: 5’-TACTACCACCAAGATCT LR12: 5’-GACTTAGAGGCGTTCAG Lr0R/LR5: Tm 50-52℃ NL1: 5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG NL1: 5′-TGCGTTGATTACGTCCCTGC (also called V9: TGCGTTGATTACGTCCCTGC) NL1: 5’-TGCTGGAGCCATGGATC-3 NL2: 5’-CTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCT NL2: 5’-AACGGCTTCGACAACAGC-3 NL2: 5’-CTTGTTCGCTATCGGTCTC (also NL2A: 5′-CTTGTTCGCTATCGGTCTC) NL2: 5’-TACTTGTTCGCTATCGGTCT-3' NL3: 5’-GAGACCGATAGCGAACAAG (also NL3A: 5’-GAGACCGATAGCGAACAAG) NL3: 5’-AGACCGATAGCGAACAAGTA NL3: 5’ NL4: 5’（similar to RLR3R：5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC) NL4: 5’-TAGATACATGGCGCAGTC-3
实验室常用缓冲液 常用引物序列汇总
实验常用试剂、缓冲液的配制方法 Na2HPO4，2 mM KH2PO4 1 M Tris-HCl 、11M Tris-HCl □组份浓度 □配制量□配制量1L 1L （pH7.4，7.6，8.0） □配置方法1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中。烧杯中。□配置方法1. 称量121.1gTris置于1L NaCl 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 8 g 2. KCl 0.2g 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 Na2HPO4 1.42 g 浓值 HCl pH KH2PO4 0.27g 7.4 约70mL 2. 向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解。 7.6 约60mL 3. 滴加HCl将pH42mL 8.0 约值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1L。 4. 将溶解定容至1L。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中pH注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的补充1mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。pH值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的值大约降低 6、10 M醋酸铵0.03个单位。□组份浓度10 M醋酸铵 □配制量100mL 1.5 M Tris-HCl 2、1.5 M Tris-HCl □组份浓度□配置方法1. 称量77.1g醋酸铵置于100～配制量pH8.8 （）□1L 200 mL烧杯中，加入约30 mL的去离子水搅拌溶解。1L1. □配置方法称取181.7gTris置于烧杯中。 2. 加入约800mL2.加去离子水将溶液定容至100mL。的去离子水，充分搅拌溶解。 3.使用8.8pH3. 用浓盐酸调值至。0.22μm滤膜过滤除菌。 4.密封瓶口于室温保存。。1L 4. 将溶液定容至 5. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。 7、Tris- HCl平衡苯酚□溶液的注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris配置方法 1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，pH值大约无需重蒸馏℃，溶液的值随温度的变化差异很大，温度每升高pH1便可用于分子生物学实验。0.03降低个单位。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其，□TE Buffer、310×组份浓度100 mM Tris-HCl10 mM EDTA
川芎内生真菌的分离与鉴定
川芎内生真菌的分离与鉴定 汪杨丽，严铸云，郭晓恒，宋杰，陈新，万德光 成都中医药大学药学院中药材标准化实验室，四川成都 (610075） E-mail：wangyangli27@https://www.360docs.net/doc/e310615368.html, 摘要：目的：探讨川芎内生真菌类群与川芎品种和产地的关系。方法：采用平板分离法分离川芎的内生真菌，采用点植法对分离菌株进行分类鉴定。结果：从6个产地的川芎根茎样品共获得内生真菌50株，经形态观察分类鉴定为1纲、3目、4科、13属。结论：不同产地及不同品种川芎的内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异，推测川芎的道地性可能和川芎内生真菌种群有关。 关键词：川芎，内生真菌，分离鉴定 川芎为伞形科（Umbelliferae）藁本属植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的功效，是著名的川产道地药材。四川都江、彭州为川芎的主要产区。此外，云南丽江、甘肃庄浪和华亭、江西等地也产，分别称“云芎”、“西芎”、“抚芎”[1～3]。有关不同产地及不同品种川芎的化学成分品质、药理、药效的研究报道较多[4]，但至今未见从川芎根茎分离内生真菌及其内生真菌种群多样性的研究报道。根据内生真菌和植物互惠共生的关系[5，6]，本文对不同产地及不同品种的川芎进行内生真菌的分离，探讨川芎在特定生境中的微生物群落结构的特征。 1. 材料与方法 1.1材料 1.1.1植物来源（见表1） 1.1.2 培养基 PDA培养基[7]（马铃薯葡糖糖培养基）＋青链霉素混合液[8]（用于分离）；PDA 培养基；促孢培养基（KH2PO41g、KNO31g、MgSO4.7H2O 0.5g、KCl 0.5g、淀粉0.2g、葡萄糖 0.2g、蔗糖 0.2g、琼脂15～20g、蒸馏水 1000ml、PH自然)。 表1 各种川芎的样品情况 药材名原植物部位采集地采集时间 川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 根茎四川彭州敖平2006.5.20 川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川都江堰石羊2006.5.22 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川彭州小鱼2006.7.24 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川汶川水磨2006.8.10 西芎L. sinense Oliv. 根茎甘肃平凉市华亭马峡2006.9.14 云芎L. chuanxiong Hort. cv. Jinxiong根茎云南丽江泸沽湖2006.8.17注：以上品种经成都中医药大学严铸云副教授鉴定 1.2方法 1.2.1. 内生真菌的分离先去掉新鲜川芎的须根，用自来水将川芎根茎表面洗净，用5%的NaClO溶液浸泡5min，用自来水反复的漂洗，稍干后切成适宜大小的小块，在无菌的条件下，用75％酒精中浸泡5 min，用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干，然后用无菌刀片将表皮削去，分别切成5 mm×5 mm×1 mm的小块种植于PDA培养基内，每个培养皿中放7小块，每个样品6个培养皿，置28℃恒温箱中培养3～15d，观察到培养基上从各植物组织块内部向周围
ISSR通用引物序列
ISSR通用引物序列
UBC Primer Set #9 (Microsatellite) 引物名称序列 801 ATA TAT ATA TAT ATA TT 802 ATA TAT ATA TAT ATA TG 803 ATA TAT ATA TAT ATA TC 804 TAT ATA TAT ATA TAT AA 805 TAT ATA TAT ATA TAT AC 806 TAT ATA TAT ATA TAT AG 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 812 GAG AGA GAG AGA GAG AA 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT 814 CTC TCT CTC TCT CTC TA 815 CTC TCT CTC TCT CTC TG 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT 817 CAC ACA CAC ACA CAC AA 818 CAC ACA CAC ACA CAC AG 819 GTG TGT GTG TGT GTG TA 820 GTG TGT GTG TGT GTG TC
821 GTG TGT GTG TGT GTG TT 822 TCT CTC TCT CTC TCT CA 823 TCT CTC TCT CTC TCT CC 824 TCT CTC TCT CTC TCT CG 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 828 TGT GTG TGT GTG TGT GA 829 TGT GTG TGT GTG TGT GC 830 TGT GTG TGT GTG TGT GG 831 ATA TAT ATA TAT ATA TYA 832 ATA TAT ATA TAT ATA TYC 833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 837 TAT ATA TAT ATA TAT ART 838 TAT ATA TAT ATA TAT ARC 839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG
产纤维素酶真菌的分离和鉴定
产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定 一、采样 地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛 用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套 采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化 二、培养基： （1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。 （2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。 （均需要加入抗生素100μg/ml） 产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。 1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。 0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓 0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。 刚果红染液：2% 刚果红溶液。 NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。 三、实验方法 3.1 真菌菌株的分离 取土样方法如前所述。取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。培养5-7d后用刚果红染色、NaCl脱色后筛选菌落周围有明显透
常用的通用引物序列
常用之Universal Primer 序列 Primer Primer sequence Applicable vectors T7 TAATACGACTCACTATAGGG pGEM-T, pGEM-T-Easy, pCRII, pET, pBlueScript, pcDNA3.1, pT7Blue SP6 TATTTAGGTGACACTATAG pGEM-T, pGEM-T-Easy, pCRII T3 ATTAACCCTCACTAAAGGGA pBlueScript pUC/M13 Forward (-40) GTTTTCCCAGTCACGAC pUC, pGEM-T, pCRII, pBlueScript pUC/M13 Forward (-21) TGTAAAACGACGGCCAGT pUC, pCRII, pBlueScript pUC/M13 Reverse TCACACAGGAAACAGCTATGAC pUC, pGEM-T, pCRII, pBlueScript T7 Terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG pET pGEX 5’GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG pGEX pGEX 3’CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG pGEX pQEF GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG pQE pQER CATTACTGGATCTATCAACAGG pQE polyhedrin F AAATGATAACCATCTCGCAA Stag GAACGCCAGCACATGGACAGC pET-4x BGH reverse TAGAAGGCACAGTCGAGG pcDNA3.1, pTracer-CMV 5’ AOX GACTGGTTCCAATTGACAAGC pPlCZα α-factor TATTGCCAGCATTGCTGC pPlCZα 3’ AOX GCAAATGGCATTCTGACATCC pPlCZα
常见真菌的分离与鉴定
常见真菌的分离与鉴定 发表时间：2010-08-20 发表者：皮肤科 (访问人次：361) 作者：上海长征医院皮肤科徐红 2005年6月13～19日全国各地举行了第8届中国护足周，主题是“积极治疗足病，杜绝家庭传染”。 在中国,每2个人中就有1人罹患足病，其中成年人发病比例高达75%；超过60%的足病为真菌感染，其中足癣发病率为45.2%，甲真菌病(俗称甲癣)占15.5%；40%的足癣患者是被家人传染的；在真菌患者中只有23.8%寻求治疗，其中50%的患者症状稍有好转就不继续治疗。 真菌其实很常见，真菌就生活在我们身边。 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由 孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状， 称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交 织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子
RT-PCR常用引物序列
RT-PCR常用引物序列 RT-PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） β-actin 人有意义链CCTCG CCTTT GCCGA TCC 反义链GGA TC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 kb β-actin* 大鼠有意义链TACAA CCTCC TTGCA GCTCC 反义链GGA TC TTCA T GAGGT AGTCA GTC 0.62kb β-actin 小鼠有意义链GTCGT ACCAC AGGCA TTGTG A TGG反义链GCAAT GCCTG GGTAC ATGGT GG 0.49 kb GAPDH 人有意义链GGTGA AGGTC GGAGT CAACG反义链CAAAG TTGTC ATGGA TGHACC 0.50kb GAPDH 大鼠有意义链GATGC TGGTG CTGAG TATGR CG反义链GTGGT GCAGG ATGCA TTGCT CTGA 0.20 kb Dynein 小鼠有意义链GCGGG CGCTG GAGGA GAA反义链GGA TC TTCA T GAGGT AGTCA GTC 12.3 kb Polymerase ε 人有意义链CGCCA AATTT CTCCC CTGAAA反义链CCGTA GTGCT GGGCA ATGTT C 6.8 kb Polymerase ε 人有意义链AAGGC TGGCG GATTA CTGCC反义链GA TGC TGCTG GTGAT GTACT C 3.5 kb Tuberous Sclerosis 人有意义链GGAGT TTATC ATCAC CGCGG AAATA CTGAG AG反义链TATTT CACTG ACAGG CAATA CCGTC CAAGG 5.3 kb 18S rRNA 大豆有意义链CTTTC GATGG TAGGA TAGTG GCCT反义链CAATG A TCCT TCCGC AGGTT CACCT AC 1.5 kb *引物不会扩增假基因 PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） HIV gag region 病毒SK 38ATTAAT CACTA TCCAG TAGGA GAAAT SK 39TTTGG TCCTG TCTTA TGTCC AGAAT GC 0.11kb β-globin 人(29923)GGTGT TCCCT TGATG TAGCA CA (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 4.1kb β-globin 人(31194)GCTGC TCTGT GCATC CGAGT GG (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 2.8kb
引物设计常用序列
RT-PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） β-actin 人有意义链CCTCG CCTTT GCCGA TCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 kb β-actin* 大鼠有意义链TACAA CCTCC TTGCA GCTCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62kb β-actin 小鼠有意义链GTCGT ACCAC AGGCA TTGTG ATGG反义链GCAAT GCCTG GGTAC ATGGT GG 0.49 kb GAPDH 人有意义链GGTGA AGGTC GGAGT CAACG反义链CAAAG TTGTC ATGGA TGHACC 0.50kb GAPDH 大鼠有意义链GATGC TGGTG CTGAG TATGR CG反义链GTGGT GCAGG ATGCA TTGCT CTGA 0.20 kb Dynein 小鼠有意义链GCGGG CGCTG GAGGA GAA反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 12.3 kb Polymerase ε人有意义链CGCCA AATTT CTCCC CTGAAA反义链CCGTA GTGCT GGGCA ATGTT C 6.8 kb Polymerase ε 人有意义链AAGGC TGGCG GATTA CTGCC反义链GATGC TGCTG GTGAT GTACT C 3.5 kb Tuberous Sclerosis 人有意义链GGAGT TTATC ATCAC CGCGG AAATA CTGAG AG反义链TATTT CACTG ACAGG CAATA CCGTC CAAGG 5.3 kb 18S rRNA 大豆有意义链CTTTC GATGG TAGGA TAGTG GCCT反义链CAATG ATCCT TCCGC AGGTT CACCT AC 1.5 kb *引物不会扩增假基因 PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） HIV gag region 病毒SK 38ATTAAT CACTA TCCAG TAGGA GAAAT SK 39TTTGG TCCTG TCTTA TGTCC AGAAT GC 0.11kb β-globin 人(29923)GGTGT TCCCT TGATG TAGCA CA (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 4.1kb β-globin 人(31194)GCTGC TCTGT GCATC CGAGT GG (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 2.8kb 序列来源nvitrogen 公司
Invitrogen中国测序通用引物序列
Invitrogen中国测序通用引物序列 引物名称序列(5'-3') M13R CAG GAA ACA GCT A TG ACC M13F TGT AAA ACG ACG GCC AGT M13F(-47) CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC M13R(-48) AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA M13(-96) CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG SP6 A TT TAG GTG ACA CTA TAG T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG T7 terminator TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG T3 A TT AAC CCT CAC TAA AGG GA pGEX-4T-5' GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG pGEX-4T-3' CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG GLp1 TGT A TC TTA TGG TAC TGT AAC TG GLp2 CTT TA T GTT TTT GGC GTC TTC CA RVp3 CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC RVp4 GAC GA T AGT CA T GCC CCG CG pcDNA3.1R TAG AAG GCA CAG TCG AGG PinPoint primer CGT GAC GCG GTG CAG GGC G pCMV-F TCT AAA AGC TGC GGA A TT GT pCMV-R TCCAAACTCA TCAA TGTA TC pTRC99C-F: TTG CGC CGA CA T CA T AAC pTRC99C-R: CTGCGTTCTGA TTTAA TCTG pCEP-F: AGA GCT CGT TTA GTG AAC CG EBV-R : GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC pIRES2-EGFP.P5’:GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG pIRES2-EGFP.P3’: AAC GCA CAC CGG CCT TA T TC 3'AD: AGA TGG TGC ACG A TG CAC AG CMV -F CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG S1 CAA CGT GAA AAA A TT A TT A TT CGC S6 GTA AA T GAA TTT TCT GTA GTA GG 5`AOX1 GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC 3`AOX1 GCA AA T GGC A TT CTG ACA TCC α-Factor TAC TA T TGC CAG CA T TGC TGC GAL4 AD TAC CAC TAC AA T GGA TG pACT2-R GTGCACGA TGCACAGTTGAA pB42ADF: CCA GCC TCT TGC TGA GTG GAG A TG
RT引物序列
-RT引物序列：AGGTCCACCACCCTGTTGCTGT 内参引物： GAPDH F: GTACGACTCACTATAGGGA AGGTCCACCACCCTGTTGCTGT GAPDH R: AGGTGACACTATAGAATA AACAGCGACACCCACTCCTCCA 通用引物： Universal F: GTACGACTCACTATAGGGA Universal R: AGGTGACACTATAGAATA I tube BV1 AGGTGACACTATAGAATA CTTGCACTCTGAACTAAACC BV2 AGGTGACACTATAGAATA TACCGTTCCCTGGACTTTC BV3 AGGTGACACTATAGAATA CAAAGTAACCCAGAGCTCG BV4 AGGTGACACTATAGAATA CCTGGACAGAGCCTGACA BV5 AGGTGACACTATAGAATA GAGWVRV ARAGGAAACTTCCCT II tube BV6 AGGTGACACTATAGAATA RMKCTCAGGTGTGATCCAA BV7a AGGTGACACTATAGAATA AACCTTCACCTACACGCCC BV7b AGGTGACACTATAGAATA TBCCTTCACCTACACACCC BV8 AGGTGACACTATAGAATA ATGCRRGGACTGGAGTTG BV9 AGGTGACACTATAGAATA AATGAAACAGTTCCAAATCGC III tube BV11 AGGTGACACTATAGAATA CGAGGAATGGAACTACACC BV12a AGGTGACACTATAGAATA TGAGATGTCACCAGACTGA BV12b AGGTGACACTATAGAATA TGACGTGTCACCAGACTTG
常用引物信息列表
3’AOX5′-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3‘ 3‘AD5′- AGA TGG TGC ACG ATG CAC AG-3‘ 3‘BD5′-TAA GAG TCA CTT TAA AAT TTG TAT C-3‘5’AOX5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3‘ A-FACTOR5′-TAC TAT TGC CAG CAT TGC TGC-3‘ CMV-F5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3‘ CMV-R5′-GTTCACGGTGCCCTCC-3‘ EGFP-Nrev5′-CGT CGC CGT CCA GCT C-3‘ GLP15′-TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TG-3‘GLP25′-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA-3‘ M13(-96)5′-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3‘ M13-205′-GTA AAA CGA CGG CCA GTG-3‘ M13F5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3‘ M13F（-47）5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3‘ M13F-215′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3‘ M13R5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3‘ M13R（-48）5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3‘ P125845′-TTTTCAGTATCTACGAT-3’ P171105′-TACCACTACAATGGATG-3’ pbd-gal4-f5′-GCCTCTAACATTGAGACAGC-3‘ pbd-gal4-r5′-AAGAGTTACTCAAGAACAAGAA-3‘ pbi-121(35s)5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3‘ PBV220F5′-AAGAAGGGCAGCATTCAAAG-3‘ PBV220R5′-CTG CGT TCT GAT TTA ATC TG-3‘ PCDNA3.0-R25′-GGC AAC TAG AAG GCA CAG TC-3‘PCDNA3.1F5′-CTAGAGAACCCACTGCTTAC-3’ PCDNA3.1R5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’ PCMV-F5′-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3‘ PCMV-5F5′-TTCCAAAATGTCGTAATAAC-3‘ PCMV-R5′-TCCAAACTCATCAATGTATC-3‘ PCMV-5R5′-ATTATAGAGGACACCTAGTC-3‘ PEGFP-C-3’5′-TATGGCTGATTATGATCAGT-3‘ PEGFP-C-5’5′-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3‘ PEGFP-N-3’5′-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3‘ PEGFP-N-5’5′-TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG-3‘ PGEX-3’5′-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3‘ PGEX-5’5′-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3‘PIRES2-EGFP-F5′-GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG-3‘PIRES3-EGFP-R5′-AAC GCA CAC CGG CCT TAT TC-3‘ pMAL-C2X-F5′-TGC GTA CTG CGG TGA TCA AC-3’ pMAL-C2X-R5′-CTG CAA GGC GAT TAA GTT GG-3’ PQE30F5′- TGA GCG GAT AAC AAT TTC AC-3‘ PQE30R5′- GTT CTG AGG TCA TTA CTG G-3‘ RVP35′-CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC-3‘
16SrRNA扩增常用引物
16S rDNA常用引物序列 Normally, we used following primers to amplify bacterial 16S rRNA genes (27F and 1492R pair) and sequencing them (using other primers). The primer sequencs are all listed in the reference: Lane DJ (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M (eds) Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Wiley, Chichester, pp 115-175 27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3' PCR and sequencing, most eubacteria 357F 5' CTC CTA CGG GAG GCA GCA G 3' Most eubacteria 530F 5' GTG CCA GCM GCC GCG G 3' Most eubacteria and archaebacteria 926F 5' AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG 3' Most eubacteria and archaebacteria 1114F 5' GCA ACG AGC GCA ACC C 3' Most eubacteria 342R 5' CTG CTG CSY CCC GTA G 3' Most eubacteria 519R 5' GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3' Most eubacteria and archaebacteria 907R 5' CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT 3' Most eubacteria and archaebacteria 1100R 5' GGG TTG CGC TCG TTG 3' Most eubacteria 1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3' PCR and sequencing, most eubacteria 1525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3' PCR and sequencing, most eubacteria M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 Any primer's reverse complement sequence is its revers prime. For example: 519R 5' GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3' then 519F 3' CWT AAT GGC GCC GKC GAC 5'
常见引物序列及相关数据
常见引物序列及相关数据 所属类别名称序列5'→3'长度/bp MW Tm/oC RDP匹配情况—非特异 细菌8F AG AGTTTGA TC A TGGCTCAG AGAGTTTGA TC C TGGCTCAG AGAGTTTGA TC M TGGCTCAG 20 20 20 6125 57.8 21114/690149 112729/706103 147961/836814 27F 27FM AGTTTGATC A TGGCTCAG AGTTTGATC C TGGCTCAG AGTTTGATC M TGGCTCAG 18 18 18 5485 55.02 27693/690149 139957/836814 167795/836814 50F A ACACA TGCAAGTCGAAC G ACACA TGCAAGTCGAAC G A ACACA TGCAAGTCGAAC ACACA TGCAAGTCGAAC 19 18 18 17 125623/690149 148982/706103 25951/690149 145627/690149 338F ACTCCTACGGGAGGCAGC 18 482403/706103 341F CCTACGGGAGGCAGCAG 17 5239 54 561521/836814 357F CTCCTACGGGAGGCAGCAG 19 481725/706103 517F GCCAGCAGCCGCGGTAA 17 5200 54 499021/706103 CAGCAGCCGCGGTAATAC 18 460959/706103 ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 20 480068/706103 968F AACGCGAAGAACCTTAC 17 227055/706103 1055F ATGGCTGTCGTCAGCT 16 198160/706103 341R CTGCTGCCTCCCGTAGG 17 5164 54 561521/836814 513R CGCGGCTGCTGGCACGTA 18 245632/706103 517R TTACCGCGGCTGCTGGC 17 54 585412/836814 518R ATTACCGCGGCTGCTGG 17 545228/836814 519R GTATTACCGCGGCTGCTG 18 53 541216/836814 907R CCGTCAATTC C TTT G AGTTT CCGTCAATTC A TTT G AGTTT CCGTCAATTC M TTT G AGTTT CCGTCAATTC C TTT A AGTTT CCGTCAATTC A TTT A AGTTT 20 20 20 19 306382/ 706103 56371/706103 2707/690149 116/690149