细胞融合技术

细胞融合技术综述

姓名徐帅班级10级生物工程学号14103401469

摘要：细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不

仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老

控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、

发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的

意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合技术的发展前景及其产生的

影响将日益显著。文章综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒、诱导法、聚乙二醇/ 化学诱导法、电融合诱导法、激光诱导法及此技术的最新研究进展：基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片等，并对它们的优缺点进

行讨论。并综述了有利于细胞融合技术完善的基础理论研究：细胞同步性和单方

的染色体丢失现象。同时提出了未来研究方向的设想。

前言：细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术[1]。细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合

(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核

或多核的杂合细胞的过程[1]。细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉

骨骼胎盘的发育[2] 、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供

了有力的手段[3] ,而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单

克隆抗体[4 - 5] 及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。

一 . 细胞融合技术发展的回顾

人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象,首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞,紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合。随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新的台阶。原生质体的大量制备技术限制了植物细胞融合技术的发展,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。然而,由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学物质PEG,作为病毒的替代物诱导细胞融合,这是一个里程碑式的发现,引起实验生物学的“无声革命”。但在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%-55%)对细胞毒性很大,因此人们又找到了新的方法来替代PEG介导细胞融合法,这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术等。总之,细胞融合技术在实践中不断发展和完善,细胞融合方法得到了不断的更新和改进,融合率也得到逐步的提高。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。

1.动物细胞融合

一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来

作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以

用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以

存活。当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融合研究中的又一次突破。他们的贡献在于证明了灭活

的病毒可以作为一般方法用来在一定的条件下融合动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合,融合的细胞可以存活。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ladda又进一步发展了去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验,开始了各种细胞重组的研究工作。从发现病毒能够诱导细胞融合之后,动物细胞融合的研究工作迅速发展起来。然而,由于HVJ诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们一直试图发现一种替代物作介质诱导细胞融合。

2.植物细胞融合

植物细胞融合技术的发展可追溯到1937年,Mi-chel用0. 5 mol/L硝酸钠处理原生质体使之凝集、融合。但那时还不能用酶法大量制备原生质体,使实验受到原生质体数量的限制,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到1960年Cocking 用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。1972年美国科学家Carlson等将粉蓝烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。20世纪70年代,细胞融合的研究范围又扩展到植物间、动物间、动植物间、甚至人体细胞与动植物细胞之间。

二.细胞融合的常用方法

1.生物法自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现

了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动

细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异

等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。

2. 化学法

2.1盐类融合法

此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。

2.2高钙和高 pH值融合法

Keller首先发现高 Ca2 +和高 pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内 2个光敏感突变体诱导融合成功并获得 100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。

2.3聚乙二醇融合法 ( PEG法)

加拿大籍华人高国楠 (1974)用聚乙二醇 ( PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合。此法比病毒更易制备和控制 ,活性稳定 ,用 PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内 ( 50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物,不同种类微生物对PEG分子质量的要求不尽相同。放线菌适用分子质量常为1 ku～1.5 ku,也有人使用0.4 ku～6 ku,真菌一般采用4 ku～6 ku,细菌用1.5 ku～6 ku。亲本原生质体制备好后,即可进行融合。关于促融机制,一般认为PEG本身是一种特殊的脱水剂,它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用,进而改变质膜的流动性能,降低原生质膜表面势能,使膜中的相嵌蛋白质颗粒凝聚,形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层区。在Ca2+存在下,引起细胞膜表面的电子分布的改变,从而使接触处的质膜形成局部融合,出现凹陷,构成原生质桥,成为细胞间通道并逐渐扩大,直到两个原生质体全部融合。

3.物理法

3.1电脉冲诱导细胞融合技术

电脉冲诱导细胞融合技术,产生于 20世纪 80年代 ,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高 ,是 PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害 ,可在显微镜下观察融合全过程。这一技术将电学与生物化学恰当结合,产生了缓和而高频率的原生质体融合效果。其原理是在短时间强电场的作用下,细胞膜发生可逆性电击穿,瞬时失去其高电阻和低通透性,然后在数分钟内恢复原状,当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时,即可诱导它们的膜相互融合,从而导致细胞融合。近年来,该技术在微生物中的应用日渐增多。

3.2激光融合技术

20世纪80年代中期发明了激光融合器,迅速崛起的激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动),可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触,然后对接触处进行脉冲激光束处理,使质膜发生光击穿,产生微米级的微孔。这样,由于质膜上微孔的可逆性,细胞开始变形融合,最终成为一个细胞。1987年和1989年德国海德堡理化研究所用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟,对融合产物观测,发现胞质仍在运动,说明融合后的细胞仍能存活。激光微束融合法与以前的病毒法、PEG法、电融合法相比较,可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时、定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌,无毒性。但它只能逐一处理细胞,不能像其他方法一样同时处理大量细胞。细胞间相互接触是实现细胞融合的前提,目前,最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触,即光镊(potical tweezers)利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间,在光斑直径与光波波长尺度相比拟时,指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力,该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处,从而实现对细胞的操作。

4.新的细胞融合方法

4.1基于微流控芯片的细胞融合技术

随着微机电系统(MEMS)技术和微加工技术的发展,微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟,加之微通道网络可以整合到生物芯片之上,这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台,利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。Strum-berg A等已经在微流控系统中实现了单个成对细胞的融合。证明了利用微流控技术使细胞之间可以实现可控融合,利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控,也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞,细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。此外,由于在微通道内的腔体容积很小,所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量,同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。

4.2高通量细胞融合芯片

高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在细胞融合芯片的微米范围内(10μm～40μm)产生的高强度高梯度辐射电场,使得细胞融合芯片中的细胞在此特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力,精确处理和刺激预定的细胞目标,从而使目标细胞按照预先设计的方向以预定的速度移动,从而可以按照设计要求准确地大批量地得到目标细胞配型,集成微电极阵列的微流控系统,可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移。该方法的优点是可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合,比如在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率。此外,二价阳离子(如Ca2+)以及蛋白酶对细胞的预处理,

融合率也可大幅提高。然而,截至目前各国与此相关的细胞融合实验工作只有几篇论文报道。

参考论文

[1] 李志勇.细胞工程[M].北京:科学出版社, 2003: 3-21. 2003: 3-21.

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宁波大学李登辉细胞融合技术的研究进展2011,6-13

细胞融合技术的应用与前景

细胞融合技术的应用与前景人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的台阶。原生质体的大量制备较为困难，限制了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因，人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50～55)对细胞毒性很大，因此人们又找到了新的方法来替代PEG，这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的方向发展。 1．细胞融合的意义所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交口]。如取材为体细胞则称体细胞杂交，体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围；细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视[2_引。经过长期反复研究和实践，细胞融合技术逐步发展和完善起来，已成为生物工程的基础技术之一。特别是近20年来，从理论和实践两个方面，有力地推动了生物科学各领域的发展。细胞融合方法得到了不断的更新，融合率也得到逐步的提高。 2．动物细胞融合技术动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的用。动物体细

原生质体细胞融合技术

食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术

原生质体细胞融合技术摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展正文：原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用

细胞融合技术的发展过程

细胞融合技术的发展过程生物方法融合：1957年，冈田善雄意外发现仙台病毒（HVJ），能诱导悬液中小鼠艾氏腹细胞（EAC）融合。然后Harris、Kada等用于诱导种间细胞融合，获得成功。化学方法融合:1972年，卡尔森首先用硝酸钠进行烟草两个种的细胞原生质体的融合，1974年K a o等，首先发现聚乙二醇（PEG）能诱导植物细胞原生质体融合产生杂交细胞。 1975年Pentecorvo发现P E G也能帮助哺乳类动物细胞的融合，1976年，Davidson更进一步证实这一结果，并且认为其具有简单快速、高效率等优点。因而，1975年之后聚乙二醇就逐渐取代了仙台病毒。电融合法电融合法:70年代未期和80年代初期发展起来的一种新的细胞融合方法。1970年，Senda首先应用电脉冲，通过微电极在显微镜下使植物细胞融合，奠定电融合技术基础。激光诱导卵细胞融合:激光诱导方法是最新的细胞融合方法，该法为张闻迪等人在1988年首先应用，他们利用激光微束的单色性、高功率密度、短脉宽和极小的作用范围等特点。对泥鳅受精卵进行融合试验，获得成功，且融合后的细胞可存活发育，经卵裂期、囊胚期、原肠期、孵化期、直至幼鱼。整个过程可通过显微镜观察，还可同时由电视摄象监视器观察和进行照相记录。典型试题解析

试题：回答下列关于细胞工程的问题。（1）如图是细胞融合的示意图，据图回答。 ①若A、B是植物细胞，则在细胞融合之前已用处理过。用聚乙二醇诱导融合之后，体系中会出现未融合的细胞，原因是。 ②若A是小鼠骨髓瘤细胞，B是受到抗原刺激的B淋巴细胞，用灭活的仙台病毒诱导融合之后，需要用特定的选择性培养基进行筛选。在该培养基上，细胞和的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞（杂交瘤细胞）能够生长。杂交瘤细胞不止一种，原因是。（2）植物组织培养有一项应用是培育“脱毒苗”，动物细胞培养需要创造“无菌无毒的环境”，脱毒苗中的“毒”是指，“无菌无毒环境”中的“毒”是指。（3）制备单克隆抗体有一项重要的应用是作为诊断试剂，例如“早早孕诊断试剂盒”。“早早孕诊断试剂盒”通过检测被测试者尿液中人绒毛膜促性腺激素的含量，从而判断被测试者是否怀孕，其起检测作用的核心物质是。（4）动物的培育过程中需要进行细胞核移植，早期的细胞核移植操作会将供体细胞的细胞核取出，再植入去核的卵母细胞，但取出细胞核的过程会对细胞核造成一定的损伤。后期的核移植操作是直接将供体细胞注射到去核卵母细胞外的透明带位置，再通过电刺激的方法诱导，从而实现供体细胞核进入去核卵母细胞。【答案】：（1）①纤维素酶和果胶酶融合的成功率不是百分之百②未融合的亲本融合的具有同种核小鼠脾脏中分离的B淋巴细胞是多种（2）病毒代谢废物（3）抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体（4）克隆供体细胞膜与去核卵母细胞膜融合【解析】：植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术；单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞，再利用动物细胞融合技术将 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，经过两次筛选获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。据图分析，图示A细胞与B细胞融合，形成的C是正在融合的细胞，D是杂种细胞。

细胞融合技术的发展及应用

#专题综述# 细胞融合技术的发展及应用* 霍乃蕊a,韩克光b (山西农业大学a.食品科学与工程学院;b.动物科技学院,山西太谷030801) 摘要:细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段向操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。本文以细胞融合技术的发展历史为主线,对上述内容做了简要综述。关键词:细胞融合技术;发展;应用中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:100727146(2006)022******* C ell Fu si on T echn iqu e:its D eve l opm en t and App lica ti on s H U O N a i2ru i a,HA N Ke2guang b (Shanxi Agr i cu lt ura lUn i ve rs it y a.College of Food Sc i ence and Eng i neering; b.College ofAn i m a l Sc ience and Technol ogy,Ta i gu030801,Shanx,i Ch i na) Ab stra ct:C ell u l a r engi neer i ng i s o ne of t he f our techniques of biote chnolo gy,and as t he core of ce ll ular engi neering, the cell fusi on technique ha s acqu ired outstand i ng ach ieve m ents i n m any fields such as agr icu lt ure,m ed icine and envi2 ron m enta l protecti on.Its app licati on i s still i ncreasi ng i n nu m ber.The i m prove m ent of t he ce ll fusi on techn i que i nvol ves the fusi on agent,new m e t hods and the cells used i n fusi on.No w new cell fusi on m ethods are re sorti ng to the co m b i ned usage of phys i ca l and chem i ca lm ethods to deve l op a s i m p le and co nven i ent,easy quantificati on and a t t he sam e ti m e can i ncrease the fusi on rate.A ll these aspects were d i scussed i n th i s pape r centered aro und the h i story of the cell f usio n te ch2 n i que. K ey word s:ce ll fus i on techn i que;deve l op m ent;app licati on 细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合第15卷第2期2006年4月激光生物学报 ACTA LAS ER BI O LOGY SI NI CA Vo.l15No.2 Ap r.2006 *收稿日期:2005203210;修回日期:2005209222 基金项目:山西省科委攻关项目(04105523);山西省自然科学基金项目(20041094) 作者简介:霍乃蕊(1972)),女,博士,现为澳大利亚纽卡斯尔大学访问学者,主要从事生物工程方面研究. (电子信箱)sxndkgh@163.co m

动物的克隆----动物的细胞融合技术及其应用

第二章克隆技术第三节动物的克隆----动物的细胞融合技术及其应用【学习目标】 1.说出动物细胞融合技术的概念、原理及方法。 2.辨别细胞融合与细胞杂交。 3.简述单克隆抗体的制备过程。【学习重难点】 1.重点：动物细胞融合技术的概念、原理及方法；辨别细胞融合与细胞杂交；单克隆抗体的制备过程。 2.难点：辨别细胞融合与细胞杂交；单克隆抗体的制备过程。【课前导忆】写下植物体细胞杂交（原生质体融合）的原理和诱导方法。动物细胞克隆培养的方法和要求。【课堂任务】任务一：请阅读p31，完成以下问题细胞融合的概念：细胞杂交的概念：细胞融合的诱导方法：选择下列材料，为制备针对肝癌细胞的单克隆抗体提供思路原理：动物细胞的融合物理：诱导方法化学：生物：应用：【课堂练习】 1、人绒毛膜促性腺激素(HCG)是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗 HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图，请分析回答： (1)制备单克隆抗体过程中要用到_________和__________技术。

(2)制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的HCG相当于________，使小鼠产生分泌相应 ________的淋巴细胞，此过程属于特异性免疫中的______________免疫。 (3)在细胞内DNA合成一般有两条途径，主途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。 ①．利用DNA合成途径不同的特点配制的HAT培养基含有多种成分，其中添加的_________ 成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。 ②．最终筛选获得的杂交瘤细胞的特点是___________________。 (4)此过程生产的单克隆抗体可以与______________特异性结合，从而诊断早孕。

植物细胞融合的研究进展_综述_郭学民

河北科技师范学院学报　第19卷第1期,2005年3月 Jo ur nal o f Hebei N or mal U niver sity of Science&T echnolog y Co llege V o l.19　No1.1M arch2005 植物细胞融合的研究进展(综述) 郭学民1,2,徐兴友1,2,王同坤1,王华芳2,尹伟伦2 (1河北科技师范学院生命科学系,河北秦皇岛,066600;2北京林业大学生物科学与技术学院)摘要:概述了原生质体分离和培养的影响因素,介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。关键词:细胞融合;原生质体;筛选与鉴定中图分类号:Q321+.2 文献标识码:A 文章编号:1672-7983(2005)01-0065-05 细胞融合(cy to mixis),亦称细胞杂交(cell fusio n),是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程[1]。植物细胞融合可分为体细胞杂交(somatic hybridizatio n)和配子-体细胞杂交(gameto-somatic hy br idizatio n),前者是指不经过有性过程,而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[2],后者是指性细胞(如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等)原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[3]。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支,是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径,原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。自1960年Cocking[4]用酶法分离出番茄根原生质体后,Natag a和T akebe[5]1970年首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株;1975年以色列的Vardi等[6]首次从木本植物Sham onti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株;在禾本科植物中,除在珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料,较早获得原生质体再生植株外,直到1985年Fujim ur a[7]等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株,才出现了重大突破。现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进,植物细胞融合获得了巨大成功。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。 1　原生质体的分离和培养 1.1　起始材料起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。在以往的双子叶植物培养中,大多以叶片为分离原生质体的材料,近年来,起始材料的适用范围有了较大扩展。目前,以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式;禾本科植物原生质体培养获得成功的试验,几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。 1.2　基因型同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同,所以在相同条件下,不同品种的再生能力不同。王光远和夏镇澳[8]在水稻原生质体培养中曾用26个品种进行组织培养,其中仅有3个品种(粳稻农虎6号、国香1号和上农香糯)能成功地用于原生质体培养,获得再生植株。据统计,小麦获得原生质体再生植株的基因型只有大约10个[9]。基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用,它不仅影响原生质体的产量和活力,而且还影响植株的再生。Cheng和Veillenux证明芙薯(Solanum phureja)从原生质体培养到愈伤组织形成受2个独立位点的显性基因的调控[10]。因此,现有收稿日期:2004-03-09;修改稿收到日期:2004-12-12

细胞融合的原理与技术 (2)

细胞融合的原理与技术摘要：细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。 1.细胞融合原理细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。细胞融合大体分三个阶段进行。第一阶段是制出细胞融合体。首先要用氧把细胞分散开，再把细胞壁溶解掉，这时的细胞就成了原生质体。原生质体用聚乙烯乙二醇(PEG)处理后，再把PEG洗掉，形成原生质体的结合。第二阶段是融合子的鉴定。利用利于融合子生存的培养基删选出已经融合的杂种细胞。第三阶段是培养融合细胞阶段。融合细胞在细菌培养基或是不含有细菌的液体培养基中进行培养，结合细胞反复分裂后，形成细胞团，把细胞团移植于含有植物激素的培养基里长出茎、叶，再把它们移植于土壤之中或嫁接于植物体上，继续生长形成新植物。 1.1动物细胞融合一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融

综述：无缝克隆与基因融合(中文版)

无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。这是获得杂交基因的理想情况。以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。蛋白质功能研究和蛋白质工程蛋白质由有功能结构域构成。为了阐述一个蛋白某个结构域的功能，需要构建该结构域删除或者被相似结构域替换的突变体。这种结构域删除或者互换实验将在很大程度上得益于相关元件的无缝融合，来消除有操作序列所带来的潜在的负面影响。更加概括地说，不同结构域的无缝融合对于蛋白质工程是非常重要的，包括获得新的杂交分子和抗体改造。对于抗体改造，互补决定区嫁接（CDR-grafting）和定点突变是经常要做的。嵌合体蛋白也可以通过內含肽介导的蛋白拼接和连接获得。只要含有內含肽的前体蛋白没有多余的序列，精确蛋白融合就可以实现。蛋白质表达标签和融合伴侣的使用促进了蛋白质的表达。它们赋予蛋白的可溶性和稳定性并促进接下来的目的蛋白的亲和纯化。在目的蛋白的活性不受到融合伴侣或者标签影响的情况下，整个融合蛋白可以直接用到接下来的研究中。对于酶学研究和测定，通常是这种情况。然而，在许多情况下，移除融合蛋白是必要的，这可以通过改造的蛋白酶酶切位点来完成。这个过程需要蛋白酶切位点和目的蛋白之间无缝的连接。为了进行功能研究，在一些情况下携带一个短标签（比如his标签）的融合蛋白被成功地结晶，移除这个标签是不必要的。然而，如果带有标签的蛋白无法结晶，就难以估量标签的影响，标签的切除通常是必要的。在表达成熟和有活性蛋白的过程中，常常需要表达蛋白氨基酸序列与原来的一样。例如

细胞融合技术及其研究进展

细胞融合技术及其研究进展摘要：自1958年Okada首次表明紫外灭活的仙台病毒可以诱导体外培养细胞融合形成多核体以来，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术，已在医药、环保、免疫学、医药、食品以及农业等领域的基础研究和应用开发。本文综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒（HVJ）诱导法、聚乙二醇（PEG）化学诱导法、电融合诱导法及激光诱导法的基本原理和研究进展。关键词：细胞；细胞融合；细胞工程 1 引言在细胞融合是 20 世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定的条件的诱导下使两个或多个细胞(原生质体) 相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，从而形成杂种细胞。细胞融合所形成的新细胞( 杂合细胞) 得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性[1]。细胞融合逐渐成为细胞工程的一项核心技术，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛应用价值[2]。它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。随着研究的不断深入，细胞融合技术的应用领域越来越广，产生的影响也日益显著，本文就其现有的研究情况进行讨论。 2 细胞融合技术 2.1仙台病毒(HVJ)诱导法 2.1.1仙台病毒诱导法原理 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由仙台病毒引起的细胞融合成多核细胞的现象[2]。由于仙台病毒诱导细胞融合法较简便,特别是许多种类的细胞对其敏感,所以常选用仙台病毒作为细胞融合的诱导剂。仙台病毒属于RNA病毒,其质膜表面存在两种糖蛋白,一种是HANA 蛋白,它具有凝集红细胞能力和神经氨酸普酶活性。一种是F蛋白,它具有质膜融合能力(质膜和细胞膜融合的能力)、细胞融合能力和溶血能力。仙台病毒诱导细胞融合的能力与共质

细胞工程在细胞融合技术上的应用

摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用，使细胞融合的方法和手段向操作更为简便，便于量化研究，同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。关键词：方法动物细胞融合植物细胞融合应用 1.细胞融合常用的技术 1.1生物法仙台病毒HVJ诱导法 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象+ 冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础, 细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视。 1.2化学法 1.2.1盐类融合法此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。1.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 1.2.2聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 1.3物理法 1.3.1电脉冲诱导细胞融合技术电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。 1.3.2激光融合技术 1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。 2细胞融合技术的最新进展

细胞融合技术研究进展

细胞融合技术研究进展年级专业课程学生姓名学号指导教师

摘要：人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多，其应用范围也越来越广。对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。关键词：细胞融合;机理;方法;应用细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。 1细胞融合的机理最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。 2细胞融合的方法 2.1生物法自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。 2.2化学法 2.2.1盐类融合法此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 2.3物理法 2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。

细胞融合的应用

细胞融合的应用细胞融合技术已在农业、工业、医药等领域取得了开创性的研究成果，应用领域不断扩大。该技术不仅为核质关系、基因定位、基因调控、遗传互补、细胞免疫、疾病发生、膜蛋白动力学等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发育生物学，在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物菌种选育，绘制基因图谱等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的台阶。原生质体的大量制备较为困难，限制了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因，人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50%～55%)对细胞毒性很大，因此人们又找到了新的方法来替代PEG，这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的方向发展动物细胞融合技术动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。动物体细胞杂交技术主要应用于以下几个方面。 2.1 用于基因定位和绘制人类基因图谱 JP2 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。 2.2 用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答反应，树突状细胞（dendritic cells,DCs）与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，无论是在动物研究还是在人体早期临床试验中都证明这是一种方便、安全、可行的方法[4]。并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的免疫应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫。肿瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式与DCs结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs中，使其内源性地表达抗原，这两种方法在抗肿瘤免疫应答中均有效[5-9]，但适于免疫的肿瘤抗原及其基因难以鉴定从而限制了其应用[2]，有实验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的免疫原性不及肿瘤细胞与树突状细胞直接融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给免疫系统，今后肿瘤疫苗的研究工作将集中在疫苗的

PCR 技术综述

08检二陈勇0803010049 PCR技术综述聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。能通过体外（试管内）扩增将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。目前，这项已广泛应用于分子生物学的各个领域，在医学检验中也显示广阔的应用前景。PCR技术的展简史 1953年沃森（Watson）与克里克（Crick）提出的DNA结构模型。 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。 1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶等特点。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA Polymerase。此酶的发现使PCR得以广泛应用。 20世纪90年代中期，随着多种自动化PCR扩增仪的问世，PCR 技术迅速普及，其应用范围也越来越广泛。近年来，PCR技术从原来的定性检测迅速发展到实时定量检测，它克服了传统PCR的许多不足，在分子诊断及其他相关领域发挥着重要作用。 PCR技术的基本原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA的方法,反应原理与细胞内的DNA 半保留复制相似,但PCR的反应体系要简单的多,主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3 ’末端互补的合成引物、四种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。基本过程是以待扩增的DNA片段为模板,首先高温变性,将混合物加热到94℃维持15到30秒,使模板DNA双链解旋成两条单链；然后逐渐降温退火,温度降到55℃,使引物与模板DNA单链碱基互补配对结合；最后在引物、四种dNTP、DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。理论上每次循环结束后靶DNA扩增一倍，即靶DNA数目以

PEG诱导细胞融合

实验十一 PEG诱导细胞融合一、实验目的 1．了解聚乙二醇诱导细胞融合的原理与技术。 2．学会鉴别融合细胞。二、实验原理细胞融合又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的现象。细胞融合技术是细胞工程骨干技术，除了用于一些基础性研究外，在植物方面主要用于合成新种；动物方面主要用于生产单克隆抗体。细胞融合的诱导因素主要有以下三种： 1、生物融合因子：如病毒。 2、物理因素：如电融合仪,主要用于植物细胞。 3、化学因素：如聚乙二醇（PEG），分子量200－6000都可用，以1000较好。聚乙二醇最早用于诱导植物原生质体的融合，现已普遍用于多种细胞。其优点是:材料易得、操作方法简单、效果稳定。病毒介导的细胞融合常用灭活的仙台病毒，主要用于动物细胞融合。其优点是融合率高，对各种动物细胞都适宜；缺点是不稳定，在保存过程中融合活性降低，并且制备过程繁琐。细胞融合，即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。人工诱导细胞融合始于20世纪50年代，并迅速成为一门新兴技术。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合：细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。三、实验材料及用品实验材料：鸡红细胞、鸡白细胞实验器材：普通离心机，水浴锅：50oC，37oC，细胞计数板四、实验步骤 1、配50％PEG：称取10gPEG，加入带盖离心管中；将带盖离心管放入电炉上的沸水中，加热使PEG熔化；待冷却至50oC时，加入等体积预热至50oC的HanKs液或不加血清的培养液混匀，保存于37oC水浴中。 2、准备鸡血：加2ml肝素抗凝鸡血于10ml带盖离心管中，800rpm离心5min，去血浆；再加5ml Hanks液洗红细胞一次，800rpm离心，去上清；配制成2%鸡血。 3、分离鸡白细胞：1ml淋巴细胞分离液+1ml鸡血，2000rpm离心20分钟，吸出白细胞放入另一个离心管中加入5ml Hanks液1000rpm离心5min,弃上清。 4、混合细胞：取0.5ml鸡红细胞加入白细胞沉淀，用手轻弹离心管底部，使沉淀松散。 5、PEG介导融合：吸取1ml 50％PEG，在37oC水浴中1分钟内加入细胞沉淀中，边加边振摇离心管，使PEG与细胞混匀； 6、终止PEG作用：向试管中加入8－10ml Hanks液轻轻吹打混匀，在37oC水浴中静置5min （稀释PEG终止其作用，并降低介质密度，便于离心）；

细胞融合论文

细胞融合技术班级：生工（2）学号：姓名：摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。文章综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒、诱导法、聚乙二醇/ 化学诱导法、电融合诱导法、激光诱导法及此技术的最新研究进展：基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片等，并对它们的优缺点进行讨论。并综述了有利于细胞融合技术完善的基础理论研究：细胞同步性和单方的染色体丢失现象。同时提出了未来研究方向的设想。关键词：细胞融合；应用研究；常用方法；基础理论研究；设想正文：细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程 [1]细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育。 [2肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段。 [3]被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体。 [4] 动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。一.细胞融合的常用方法 1生物法自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。 2 化学法盐类融合法。此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。高钙和高pH值融合法。Keller 首先发现高Ca2 + 和高pH值可以诱发融合。Melchers 用此法将烟草种内2 个光敏感突变体诱导融合成功并获得100 余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。聚乙二醇融合法(PEG法) 。加拿大籍华人高国(1974) 用聚乙二醇(PEG) 为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50 %～55 %) 对细胞的毒性应进一步减小。 3 物理法电脉冲诱导细胞融合技术。该技术融合效率高,是PEG的100 倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程。激光融合技术。1987 和1989 年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟。该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可