生物技术在水产遗传育种中的研究进展与应用前景

生物技术在水产遗传育种中的研究进展与应用前景摘要：本文综述了生物技术在水产遗传育种中的应用与研究,包括人工雌核生

殖和雄核生殖, 多倍体诱导, 细胞核移植, 细胞和组织培养, 细胞融合和基因工

程等。

关键词生物技术；遗传育种；水产动物；应用

1 引言

生物技术是指人们运用现代生物学、工程学和其它基础学科的知识, 按照预先的设计对生物进行控制和改造或模拟生物及其功能, 用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域。近十几年来, 生物技术迅猛发展, 方兴未艾。

本文就人工雌核生殖和雄核生殖、多倍体育种、细胞核移植、细胞和组织培养、细胞融合和基因工程在水产遗传育种方面的研究进展作一综述。

2 人工雌核生殖和雄核生殖

2.1 雌核生殖

雌核生殖是指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。自然界存在这种单性生殖的水生动物, 人工诱发手段也可使未受精卵进行雌核生殖, 但产生的个体绝大多数是单倍体, 难以存活, 需紧接着二倍化的特殊处理。诱发雌核发育除了可以加快建立选育系和控制性别外, 还可以使一些稀有的隐性等位基因显现而产生新的优良胜状, 使具有重要经济性状的显性基因转为纯合状态, 雌核发育后代还可用来鉴定鱼类的近交衰退现象等。常用诱发雌核生殖的方法有射线照射、化学药品处理、带血玻璃针激活以及杂交(异质精子穿入卵但精核不参于发育)等。二倍化的方法通常使用温差(冷或热休克) 、水静压、药品（如秋水仙素和细胞松驰素B (简称C S) ）处理等。

我国蒋一硅等[1]和吴清江等[2]曾分别成功地应用了y射线辐射鱼类精液后诱导红螂鱼卵和鲤鱼卵的雌核生殖。在对虾方面的研究, 蔡难儿[3]首先报道了采用与研究鱼类人工诱导雌核发育相类似的四步诱导法对中国对虾进行人工诱导雌核发育, 育出三批雌核发育的个体但要大规模生产仍存在一定的困难。

2.2 雄核生殖

雄核生殖是指卵子只依靠雄性原核进行发育的生殖方式。人工雄核生殖同人工雌核生殖一样, 也要经过诱发雄核生殖并使之二倍化的两个步骤。目前诱发方法有去除卵核、射线破坏卵核、杂交和用过熟或老化的卵子受精等。

刘汉勤等[4]用类似方法使泥鳅精子与大鳞副泥鳅卵子授精后挑去雌核从而获得泥鳅雄核生殖单倍体。叶玉珍等[5]也用了射线处理鲤、鲤鱼类成熟卵, 获得了二倍体雄核发育鱼苗。另外, 许多研究证明不同种类的杂交可以产生雄核生殖。水产生物的雄核单倍体难以存活, 须在发育早期二倍化。

3多倍体育种

三倍体生物由于节省了繁育后代所需的能量消耗, 故生长个体大, 因此海产动物三倍体育种是应用生物技术提高海产品产量的有效途径。我国最早开展虾类多倍体育种是在1989 年6 ~ 12 月, 相建海[6]以锐脊单肢虾( Sicyonia ingentis) 为材料在国际上首次获得对虾三倍体幼体。该成果备受国内外学者的关注。近年中国科学院海洋研究所在对虾三倍体和四倍体研究中又取得进展, 经过条件的优化, 中国对虾三倍体的最高诱导率可达90% 以上; 在胚胎期检验, 四倍体最高诱导率达90%以上。

大连水产学院王子臣早在1986 年就开始对鲍鱼三倍体进行研究。近期他们在前期工作的基础上, 使北方皱纹盘鲍和南方九孔鲍增加染色体数量形成三倍体, 使稚鲍的成活率提高一倍, 生长周期缩短了三分之一, 此项技术产业化后已累计生产三倍体鲍400 多万枚, 首次实现了鲍三倍体的规模化生产。

4 细胞核移植技术

这是一种将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术, 是50 年代初由美国学者Briggs 和King 首创的[7]。他们以豹蛙为材料, 将囊胚期的动物极细胞核移入另一去核的卵子中, 获得正常发育的胚胎, 引起了国际上的重视。而后这一技术广泛地应用于细胞分化、核质关系和发育机理等重大生物学问题的研究。1961 年童第周率先在金鱼和鱼旁鱼皮鱼中进行同种鱼的细胞核移植[8], 证明细胞核移植也可以在鱼类中进行。之后, 童第周等在这两种鱼间进行亚科之间的细胞核移植, 获得多种核质杂种鱼, 严绍颐等将鲤鱼胚细胞核移植到鲫鱼去核卵中, 获得的核质杂交鱼具有较高的养殖价值[ 9]。谢忠明等以鲤鲫移核鱼二代为父本, 黑龙江散鳞镜鲤为母本, 经常规有性杂交获得第1 代杂交种颖鲤, 已在20 个省、市、自治区推广养殖[10] 。细胞核移植已在水产生物的遗传育种中发挥重要作用, 但仅局限于鱼类和两栖类, 对于虾、蟹、贝、藻类还一无所知。另外, 并非所有核质杂交种都可以培育成新品种, 也不是所有的核质杂交种都有受体物种的性状, 如鲫鱼细胞核和鲤鱼细胞质配合的杂种鱼基本上相似于供体鱼( 鲫鱼) 的性状, 更不是所有的种间杂交屏障都可以借助细胞核移植技术来突破, 因此, 该技术应用于水产生物的育种还有大量工作需要完成。

5 细胞和组织培养

细胞和组织培养技术是把生物的细胞或组织分离、培养、诱导再生或快速繁殖的技术。目前, 这项技术已广泛应用于鱼类细胞、珍珠贝外套膜上皮细胞以及海藻组织和细胞等的培养。水产动物细胞培养起始于鱼类, 己有许多鱼类细胞株相继建成。这些细胞系具有多方血的用途, 可代替活体动物用于病毒研究, 可用于染色体制作等遗传学研究, 用于制作细胞疫苗, 作为细胞核移植育种研究中供体细胞核来源, 以及毒性和水质监测等的指示生物(细胞比鱼体对有毒物质史敏感)等。

鱼类细胞培养与细胞核移植结合使用, 在良种培养中起着重要作用。陈宏溪等[11]把鲫鱼胚胎的继代培养细胞核转移到鲫鱼的未受精去核卵中,培养出世界上第1 尾无性繁殖鱼。他们还用类似技术, 由短期培养的性成熟鲫鱼的肾细胞, 获得1尾发育到性成熟的体细胞工程鱼, 使鱼类细胞水平上的遗传育种成为可能。余来宁等[12]采用电融合结合继代移核法, 将对草鱼出血病病毒( FRV) 有抗性的草鱼肝细胞株(GLA) 的细胞核,移植到草鱼未受精卵内, 获得了一批不同

发育期的胚胎和存活的仔鱼。可见, 用细胞工程育种的方法, 培育抗病草鱼是大有前途的, 也为鱼类体细胞育种提供了依据。

6 细胞融合

细胞融合技术是一种将两个不同遗传性的细胞合并为一个杂种细胞的技术, 因此也称细胞杂交技术。它可以用于不同种间、属间、甚至动物、植物细胞之间或动植物与微生物细胞之间的融合。它为构建生物新品种或新的细胞类型提供了一条有效的途径。

在水产生物方面, 该技术具有难以估量的前景。张大力已将长石莼与袋礁膜原生质体融合, 并将融合体培养了20 d, 形成自养细胞团。易泳兰[13]等已把大鳞副泥鳅( 雌) @鳗尾泥鳅( 雄) 杂交囊胚细胞与大鳞副泥鳅卵融合, 培育了1617% 的融合鱼, 其外形兼有双亲的特征, 类似于杂交卵发育的个体[ 18] 。同时他们还将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合, 培育了315%的融合鱼苗。这些融合鱼各具两对触须, 形态类似鲤鱼。易泳兰的工作还表明鱼类囊胚细胞与未受精卵的电融合可以简化细胞核移植的操作过程, 1 次可以处理的卵数相当于1 次核移植卵数的2~ 3 倍。可见, 利用细胞融合技术可获得通常难以杂交或不可能杂交的不同物种间的杂交后代, 培养更多更好的新品种。

7 基因工程

基因工程是20 世纪70 年代初兴起的新兴遗传育种技术。1982 年, 科学家首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵中, 获得了个体比对照组大 1 倍的转基因/ 超级鼠0。这为动物基因工程定向育种研究领域显示了新曙光。继转基因超级鼠研制成功后, 转基因猪、免、羊等也相继问世。我国朱作言[14]等首先运用基因转移技术将人的生长激素基因导入泥鳅、银鲫、鲫鱼、鲤鱼受精卵, 使135 日龄泥鳅、208 日龄银鲫和153 日龄镜鲤的体重分别比对照组提高2 ~ 316 倍、718% 和914% , 从而证明了外源基因在受体鱼内的整合、表达和促进生长作用以及通过性腺子代的传递, 建立了完整的转基因鱼模型, 目前, 已先后在金鱼、鲤鱼、鲫鱼、银鲫、泥鳅获得人生长激素基因的转基因鱼。大量研究表明, 该技术在水产生物的品种改良中有巨大潜力。除生长激素基因外, 抗冻蛋白基因、抗病蛋白基因的转移也受到重视。为使缺乏抗冻基因的名贵鱼在寒冷环境中生存, Hew 等把抗冻蛋白基因注射到大西洋鲑受精卵内, 有3% 的个体整合了抗冻蛋白基因。整合的抗冻蛋白基因具有遗传的稳定性和组织表达的特异性, 但表达量受季节影响。整合的转基因鱼中抗冻蛋白的量还不足以产生抗冻效果。今后要通过提高启动子的增强效应或增加基因剂量来加强该转移基因的表达效果。在抗病基因转移方面, 因为鲤与草鱼有很近的亲缘关系, 很多草鱼易患的疾病如出血病、肠炎等不易在鲤鱼中发生, 因此, 张怀云等认为鲤鱼体内具有抗病基因, 因而将鲤鱼作为抗病基因供体, 分离出总DNA, 然后以精子载体导入草鱼受精卵, 获得了体形体色变异的个体。变异了的红色草鱼的获得证明了以总DNA 导入, 也能在鱼类中实现确定性状的转移。有关抗性基因转移方面的研究还有待深入。

从安全性、外源基因的表达强度以及基因产物的生物学效应方面考虑, 鱼类育种方面的基因转移采用的是人生长激素基因、牛生长激素基因, 启动调控顺序使用最普遍的是小鼠的重金属结合蛋白(MT) 基因启动子, 或来自病毒的启动子, 如SV40、RSV 等。用这些元件的重组体培育具有实用价值的转基因鱼是欠妥当的。因为, 这种转基因鱼如释放到天然水体中会不会造成环境污染, 食用这种含

有人生长激素的转基因鱼是否会对人体产生不良影响, 常用的病毒基因启动子是否会诱发人的恶性肿瘤, 都是必须考虑的问题。为此, 人们正在探讨利用全部来自鱼类的基因元件培育转基因鱼。目前, 已经克隆了多种鱼的生长激素基因、金枪鱼与鲤鱼和草鱼的生长激素、大麻哈鱼的催乳素基因、美洲拟鲽的抗冻蛋白基因。朱作言也成功地克隆了鲤鱼和草鱼的肌动蛋白基因, 并获得了具有调节功能的肌动蛋白基因启动子。沈孝宙也获得了鲤鱼金属结合蛋白( MT) 基因的启动子。将这些完全来自鱼类的元件装配后, 进行基因转移, 获得的转基因鱼将更实用。Du 等, 最先使用全鱼基因0向大西洋鲑受精卵转移生长激素基因, 获得的转基因鱼个体重量比对照组大318 倍, 转基因鱼子一代个体重量比对照组大512 倍。美国把虹鳟生长激素基因导入鲇鱼, 缩短了养殖周期, 可增产20% ~ 40%。这些成果使鱼类转基因技术从实验室向生产应用迈进了一大步。

在转基因鱼研究中, 还有一个值得考虑的问题是无论用哪种基因转移方法, 目前都还达不到外源基因的定点整合。这是今后的重点和难点。

总之, 基因工程育种技术已在鱼类和其他水产生物改良方面展现了光明的前景。可以预言, 随着基因克隆技术的不断提高, 各种优良性状的基因终将陆续得以分离。转移这些优良性状的基因, 定将为水产动物的育种开辟新途径。

8存在问题与建议

( 1)海水养殖优良品种缺乏现代生物技术打破了传统育种的束缚, 开拓了育种的新领域, 加快了育种的进程。应当充分利用现代生物技术的优点, 借鉴淡水鱼类育种的成功经验, 瞄准海水经济鱼类, 大力开展选育、培育优良新品种的研究工作, 争取在较短时间内克服海水优良种苗短缺的局面。

( 2)育种技术有待改进与完善近年来, 各种现代生物技术不断发展完善, 但许多技术仍然不尽人意。如转基因技术存在定点整合难、表达率低、产品安全性等不足。因此, 还应继续加强育种新方法和新手段的研究, 提高育种的效率和安全性。

( 3)加快功能基因研究, 特别是与经济性状有关的功能基因的定位、分离和克隆研究目前对许多海水经济鱼类的功能基因了解很少, 特别是与经济性状密切相关的功能基因了解不多。还应继续加强海水经济鱼类功能基因的研究, 鉴定和克隆更多的与经济性状紧密联系的功能基因, 为转基因育种等打好基础。

( 4)建立具有优良性状的海水鱼类家系、品系、纯系目前, 许多海水经济鱼类已成功进行了人工繁殖; 还有一些利用现代生物技术改良的品种陆续出现, 但还没有形成稳定的家系、品系、纯系。应利用各种有利手段与方法, 快速建立各种经济鱼类的家系、品系和纯系, 为海水鱼类育种的进一步工作提供便利条件。

( 5)继续构建经济鱼类遗传图谱在海水经济鱼类中除虹鳟、牙鲆等少数种类已初步构建遗传图谱外, 至今还没有一个种类构建了完整的遗传图谱。构建鱼类遗传图谱是现代育种的重要依据。应利用分子标记技术, 建立各种遗传图谱, 为鱼类育种提供材料。

( 6)开发利用与资源保护兼顾环境问题是当今人类面临的共同问题, 在开发利用海水鱼类资源的同时, 应注意保护好海洋资源和海洋环境, 应积极开展海洋资源调查, 了解海洋生物的相互关系, 保护海洋生物多样性。在开展育种过程中, 应提高环保意识, 科学评估转基因生物的地位与作用, 尤其是对环境的

影响和安全性不容忽略。海洋鱼类资源是人类的宝贵财富, 保护和合理开发海洋鱼类资源是关系到人类生存的重要课题, 大力发展海水经济鱼类养殖是减少海洋捕捞压力、增加渔业产值、保护鱼类资源的重要途径, 而选育、培育优良性状的鱼类品种、发展海水鱼类养殖是当前海水鱼类育种的重要任务。

9 结束语

综上所述生物技术在水产养殖上的应用是相当广泛的，前景也是相当美好的随着相关学科的不断发展, 生物技术的内涵将不断扩展。利用现有在哺乳类和鸟类等应用研究较成熟的生物技术和开创新的生物技术对水产经济动植物展开更加广泛的研究是紧迫需要的。我国在这方面的研究较为薄弱, 因而必须给予高度重视。在资金投入和人才方面制定相关优惠政策, 加强国际合作，建立信息网络和研究中心, 选定优先发展的重点如鳗鲡、真酮、对虾、鳖等重要养殖种类的遗传育种、野生种群遗传多样性和种质资源等的研究, 组织协作攻关, 以推动我国水产业的高速发展。

参考文献

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