土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY

本科毕业论文（设计）

题目：土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定

学院：生物科学与工程学院

姓名：

学号：

专业：生物工程

年级：

指导教师：职称：

二0一一年五月

摘要

目的：通过分离、筛选与纯化，从土壤中筛选出具有解磷能力的菌株。方法：根据解磷圈大小判断其解磷能力。从桔子、柚子、石榴3种不同植物根系土壤中分离出降解无机磷的解磷菌，通过平板法进行初筛，根据水解圈直径和菌落直径比值大小筛选到水解圈直径和菌落直径比值较大的菌株,连续纯培养五代，选择遗传稳定的解磷菌,进一步通过液体摇瓶培养复筛，最后筛选出分解无机磷能力较强且能稳定遗传的菌株。结果：从桔子根际土壤中分离降解出了三株透明圈明显的解磷菌，筛选出两株水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值较大的解磷菌，1号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.625，2号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.44，经过五代培养，将稳定性最好的菌株进行液体摇瓶培养7天，然后进行解磷能力测定，测得结果是菌株1号水溶性磷含量为31.13mg ∕L，菌株2号水溶性磷含量为25.43mg∕L，具有较强解磷能力。结论：通过菌落形态观察以及水溶性磷含量的测定结果可鉴定菌株为无机磷解磷细菌。

关键词：果树根际土壤，解磷菌，无机磷，分离，鉴定

Abstract

Objective: the separation, purification, from screening and soil were XieLin ability with the strain. Methods: according to the size XieLin circle XieLin judge its ability. From orange, grapefruit, pomegranate 3 kinds of different plant roots isolated soil degradation of inorganic phosphorus XieLin bacteria, through the flat screen, according to early method of hydrolysis circle diameter and colonies diameter ratio size screening to hydrolysis circle diameter and the ratio of larger diameter strains colony, continuous pure cultivate generation, choose the genetic stability XieLin bacteria, further through the liquid wave flask culture after screen, finally selected decomposition inorganic phosphorus ability stronger and can stable genetic strain. Results: from orange rhizospheric soil degradation out isolated transparent circle obvious reason XieLin bacterium, two strains were hydrolyzed circle diameter (D) and colonies diameter (D) XieLin bacterium, the ratio of larger diameter strains hydrolysis circle 1 (D) / colonies diameter (D) for 2.625, 2 strains hydrolysis circle diameter (D) / colonies diameter (D) for 2.44, after five dynasties, the best training for liquid stability strains flask culture seven days, wave XieLin ability and determination of measurement results is,

water-soluble phosphorus strains 1 for 31.13 mg/L, water-soluble phosphorus strains 2 for 25.43 mg/L XieLin ability, strong. Conclusion: through the colony morphology observation and the measured results of water-soluble phosphorus can be identified for inorganic phosphorus XieLin strains of bacteria.

Keywords:Fruit trees rhizosphere, XieLin bacteria, inorganic phosphorus, separation, appraisal

目录

绪论 (1)

1 材料与方法 (1)

1.1 供试材料 (1)

1.1.1 菌株 (1)

1.1.2 培养基 (1)

1.1.3 主要仪器设备及药品试剂 (2)

1.2方法 (2)

1.2.1 解磷细菌的生物富集 (2)

1.2.2 菌株初筛 (2)

1.2.3 解磷细菌的鉴定形态学鉴定 (2)

1. 2. 4 解磷细菌解磷能力的测定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2 结果与讨论 (3)

2.1 菌株初筛结果 (3)

2.2 解磷菌形态鉴定结果.............................. 错误！未定义书签。

2.3 解磷能力鉴定结果 (6)

3.小结和讨论 ............................................ 错误！未定义书签。参考文献 .. (8)

致谢 (9)

绪论

磷是植物生长发育的重要物质基础之一,是植物体内核酸及多种酶、辅酶、ATP等的重要组成成分,这些物质对于细胞来说是至关重要的。作物的生物量和产量与其吸收的磷量呈显著正相关。植物缺磷将导致生长发育迟缓、生长量和产量下降。土壤中的磷总量并不低,但绝大部分处于植物不能直接吸收的状态,致使多数情况下作物缺磷而生长发育和产量受到限制。长期以来，为了提高农产品的产量，人们大量使用化学肥料和农药，磷肥在施用后往往很快就被固定形成无效态磷，变得不可利用，造成了作物的低吸收和磷元素在土壤中的大量积累。尽管有大量关于提高植物磷利用率的专门研究，但土壤中磷循环的某些进程还不是很清楚。能够使难溶磷溶解和矿化的微生物的作用被认为是至关重要的。国内外大量的研究表明土壤中存在许多微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态。因此，筛选出具有解磷能力的微生物，从而生产含有解磷功能较强的微生物有机肥料对解决植物磷素利用问题是一条很好的途径，具有这种解磷能力的微生物叫做解磷菌或溶磷菌，这是一种很好的微生物肥料。根据微生物分解磷酸盐能力的强弱，可将解磷细菌划分为无机磷细菌和有机磷细菌。目前，一般测定微生物是否具有解磷能力有平板法、液体培养和土壤培养3种方法。前面2种是目前实验室研究中最经常采用的方法。

本实验通过采集农大后街的桔子树、柚子树和石榴树三种果树的根际土壤，从中分离无机磷细菌, 筛选出有较强解磷能力的菌株, 以期为今后解磷菌的开发应用提供技术基础。

1材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株

作物、盆栽、树木根际土壤，翠湖、污水旁土壤等都含有大量解磷菌，我分别从桔树、柚子树、石榴树的根际采取土样，土壤采样深度为5-15厘米，将采回的土样自然风干，用研钵研细后贮存于透明封口袋内并编号，立即使用或4℃冰箱中保存，待用。

1.1.2 培养基

I 斜面保存和菌种鉴定培养基：

牛肉膏蛋白胨培养基。牛肉膏，0.5%；蛋白胨，1%；葡萄糖，0.5%；氯化钠，0.5%，琼脂2%。pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。

II 用于分离、鉴定无机磷细菌的固体培养基：

无机磷培养基: 解磷细菌Ca

3(PO4)

2

分离培养基：Glucose 10g，(NH4)

2

SO

4

0.5 g，NaC1 0.3

g，KC1 0.3 g，MgS0

4·7H20，0.3 g，FeSO

4

·7H

2

0 0.03 g，MnSO

4

·H

2

0 0.03 g，Ca

3

(PO

4

)

2

5.0 g，琼脂20g，定容至1000 ml，pH7.2。

1.1.3 主要仪器设备及药品试剂

仪器设备：4℃冰箱、电子天平、灭菌锅、超净工作台、28℃的全温振荡摇床、28℃生化培养箱、显微镜、15ml试管、1000μl或250μl移液枪以及枪头、250ml三角瓶、100ml 量筒、1000ml烧杯、玻璃棒、培养皿、接种针、游标卡尺、紫外分光光度计、容量瓶（50ml、100ml、200ml）

药品：浓硫酸、浓高氯酸、钼酸铵、酒石酸锑钾、磷酸二氢钾、抗坏血酸。

试剂：2g∕L,2,4-二硝基酚指示剂；4mol∕L氢氧化钠溶液；0.5mol∕L硫酸溶液；钼锑贮存液；钼锑抗显色剂；5ug∕ml磷(5ppmP)标准溶液。

1.2方法

1.2.1 解磷细菌的生物富集

分别称取保存的土样各1g加入到装有9ml无菌水的试管中编号，混匀，静置5min 左右后用移液枪吸取1ml土壤上清液至250ml三角瓶装液99ml的无机磷液体培养基中，贴标签标记，置于28℃的全温振荡摇床振荡培养3d。

1.2.2 菌体初筛

分别吸取l ml上述摇瓶培养液于盛有9 ml无菌水的试管中，吹打混匀，吸取1ml 菌悬液进行10倍梯度稀释，将浓度为10-4，l0-5，1O-6，10-7的稀释液各吸取0.1ml 分别接到无机磷固体培养基上，用涂布棒涂抹均匀后倒置于28℃生化培养箱中培养7d，无机磷固体培养基中的难溶性磷酸盐在微生物溶磷机理的作用下溶解，会在菌体周围形成一定的透明圈,依据透明圈大小进行平板筛选和鉴定。

选择有较大清晰水解圈的菌株继续接种到无机磷固体培养基上进行划线分离纯化，以获得较稳定的纯培养。用游标卡尺测量出水解圈和菌落的直径，将水解圈直径和菌落直径比值大且水解圈解圈清晰度高的菌株接种到无机磷固体培养基上，在28℃生化培养箱中培养2d后，连续培养5代，选择遗传稳定的解磷菌，4℃斜面保藏备用。

1.2.3 解磷细菌的鉴定形态学鉴定：

将筛选出来的具有最大解磷能力的菌株在琼脂平板上培养，观察细菌菌落生长特征，注意其生长速率（快、中等、慢）、表而特征(光滑、粗糙、皱纹、同心环、辐射

状等)、形状、大小、颜色、透明度、边缘特征(光滑、锯齿状、波浪状、纤维状)、降起形状( 凹、凸、平)等，并作记录。同时用接种环挑取单菌落上的细菌进行革兰氏染色，镜检，记录结果。

1.2.4解磷菌解磷能力的测定：

将斜面保存的菌种接入装有液体无机磷培养基的三角瓶，摇床振荡培养7d，7d后，在4℃下以10000 r／min的转速离心5min，取上清液20ml用钼锑抗比色法测磷含量，将培养物定期取样，离心，测定水溶性磷含量，以培养时间(d)为横坐标，以溶磷浓度为纵坐标绘制曲线。同时用划平板的方法培养细菌，3d后观察并记录细菌生长量。

2 结果与讨论

2.1 菌株初筛结果

来源于桔树根际土壤中的菌种筛选结果表明，从中可以筛选出大量解磷能力强的菌种。本次实验在桔子树的根际土壤中共筛选出来了3株具有较明显水解圈的菌株，有2株水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值(D／d)大于2.4，分别编号1、2号，其中有一株水解圈直径(D)与菌落直径(d)最大比值达到2.6 以上，解磷效果最为明显。

表1 三种土壤筛选结果

Table 1 three soil screening results

土样结果

桔树平板上菌株生长正常，经7天培养后有三个菌落周围有明显水解圈

柚子树平板上有菌落生长，浅黄色，呈圆形，黏腻，无水解圈

石榴树平板上有菌落生长，浅黄色，呈圆形，无水解圈

表2 菌落直径与水解圈直径

Table 2 colonies diameter and hydrolysis circle diameter

菌株编号水解圈直径菌落直径水解圈直径(D)／菌落直径(d) 1号 10．5mm 4mm 2.625

2号 11mm 4.5mm 2.44

图1 无机磷解磷菌初筛平板

Figure 1 inorganic phosphorus early XieLin bacteria screen plate

2.2 菌株形态学鉴定结果

2．2．1 形态学鉴定

通过菌落形态特征的观察，可判断筛选到的2株溶磷菌都为细菌。对筛得的1号菌株解磷菌在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线培养，28℃培养72h，对菌落特征进行观察，并取单个菌落进行革兰氏染色，对细菌菌体形态特征进行观察。结果见表3、表4、图2、图3。

表3 菌落形态特征

Table 3 colony morphology characteristics

菌株形状外观边缘颜色透明度与光泽

1号近似圆形

扁平表面湿润

易挑起

不规则乳白色不透明

有光泽表4 细菌形态特征

Table 4 bacteria morphological characteristics

菌株菌体形态革兰氏染色1号菌体微小，短杆状，单个或呈短链状排列阴性

图2 菌落的形态特征

Figure 2 colonies morphological feature of

图3 细菌的革兰氏染色

Figure 3 gram's staining of bacteria

2.3 菌株解磷能力鉴定结果

在初筛的基础上对筛选到的2株水解圈直径与菌落直径比值(D／d)较大的菌株进行液体摇瓶复筛，结果如下。

表5 磷标准曲线的绘制

Table 5 p standard curve

ppmP标准磷溶液0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 吸收值0 0.151 0.264 0.387 0.505 0.621 0.744

表6 解磷细菌的摇瓶复筛结果

Table 6 XieLin bacterial wave bottle after screening results

菌株水溶性磷含量菌浓

1号31.13mg∕L 5x1010个∕ml

2号 25.43mg∕L 4.2x1010个∕ml

通过复筛结果发现，水解圈直径和菌落直径比值大的，复筛测得的可溶性磷含量也高。

3 小结和讨论

本试验通过对桔树、柚子树、石榴树三种果树的根际土壤所含解磷细菌进行初筛，五代连续纯培养，液体摇瓶复筛测定解磷能力，以及解磷细菌的形态学初步鉴定，得到结果如下：

1、初筛结果表明：在桔树的根际土壤中分离纯化出可以溶解磷酸钙的无机磷细菌，但是没有在柚子树和石榴树的根际土壤中分离出解磷菌，可能是我采集的这两种植物根际土壤所含解磷菌量微小甚至根本没有，而且操作过程中染了杂菌。经过实验发现，培养基的PH最好控制在7.0，如果偏碱或者偏酸则培养出来的菌株呈黄色鼻涕状，无透明

圈，说明不是解磷菌。温度也是影响微生物生长和代谢的一个重要原因，当温度在微生物的最适范围内变化时，它的生长和代谢正常且平稳，超过这个范围，则生长代谢急剧下降甚至停止代谢，从而透明圈过小，甚至没有菌株出现，所以摇床温度和生化培养箱温度最好控制在28°C至30°C。

2、五代连续纯培养结果表明：在培养基配制正常的情况下连续培养，部分菌株到了第三代就没有水解圈出现，而到了第五代仍出现水解圈的菌株，其透明圈的大小相对变小，解磷能力减弱，据Kucey报道，在菌株纯化过程中，有近50%的解磷细菌会失去解磷能力。我对这种现象产生的机制并不明了，可能与培养基PH有关。

3、液体摇瓶复筛结果表明：分离纯化所得的磷细菌体中有大量水溶性无机磷存在，说明菌株能够对无机磷酸盐进行过量吸收并大量贮藏在细胞内。相比较同伴们的实验结果，我测得的1号和2号菌株的水溶性磷含量不高，可能是由于固体和液体培养基条件的不同、操作的差异以及菌株本身解磷能力的差异等造成的。根据透明圈的大小只能定性地检测菌株解磷能力，而用液体定量测磷的方法能更准确地确定菌株解磷能力的大小，因此在解磷菌的筛选中，液体的摇瓶复筛是很重要的一个步骤。实验数据表明水解圈直径和菌落直径比值大的，复筛测得的可溶性磷含量也高：1号菌株的水溶性磷含量为31.13mg∕L，2号菌株的水溶性磷含量为25.43 mg∕L，这和大部分前人结果一致。但是有的前人的实验中，水解圈直径与菌落直径比值大的复筛测得的可溶性磷含量反而低，D∕d小的反而可溶性磷含量高，这可能和微生物解磷时分泌的无机解磷酶与无机磷的接触面积有关。

4、解磷菌的研究对发展持续高效农业具有深远的战略意义。土壤中解磷菌的数量受土壤物理结构、有机质含量、土壤类型、土壤肥力、耕作方式和措施等因素的影响, 因而不同土壤中解磷菌的数量存在较大差异, 而大部分解磷菌均出现在植物的根际土壤中。从土壤中筛选出高效解磷微生物，研制成解磷菌剂拌种或直接施入土壤，将土壤中难溶性磷活化出来供作物有效吸收，可以大幅度增加产量。本次试验只是从果树根际土壤中分离出解磷细菌并做了初步鉴定，但要想进一步应用到实际生产中，还必须进行田间试验。

参考文献

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[11]Kucey RMN．1983．Phosphate．solubilizing bacteria and fungi in va．rious cultivated and virain Alberta soils．Can J Soil Sci，63：671—678.

致谢

本论文是在刘好桔老师的悉心指导下完成的。从论文的选题、设计、实施到论文的攥写和修改过程，刘老师给予了我极大的关心和帮助，在此我向她致以最诚挚的感谢。课题实施期间历经的时间很长，实验过程中我们遇到了许多问题，比如药品缺乏，刘老师就亲自赶来为我们向别的老师寻借，实验中间环节出现错误，我们找不出原因，刘老师会细心帮我们讲解，有时候我们操作手法不规范，刘老师就不厌其烦地为我们做示范等等。因为有刘老师严谨不苟、无微不至的指导，我才能够有条不紊地完成各项操作。通过这次实验，我对刘老师严谨治学的态度、敏锐的洞察力和耐心细致的指导印象深刻，受益匪浅，这些都将激励我在以后的工作中更加勤奋努力。

论文的实验是在江西农业大学生物科学与工程学院微生物实验室完成的，在此过程中我得到了院领导、各位老师以及读研的学长学姐们的大力帮助，在此我向他们表示衷心的感谢！同时，非常感谢四年来我的任课老师，如果没有他们的细心教导，我不会懂得这么多理论知识，从而完成本论文，所以再次真诚的感谢他们！