免疫组化试题参考答案
免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：
1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。其不同点为三步法，且有放大作用，反应完全依赖于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应灵敏度高，背景低。注意一抗与复合物中的抗体必须来源于同一种动物，且二抗必须过剩。
4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。无标记的探针称裸探针。
5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。
6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术把握，是组织化学的关键环节，是取得满意效果的必要条件，是提高结果可信度的根本保证。
7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以转变成荧光分子。此技术目前主要应用在生物胺的显示中。其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。
8.定量分析：定量判断是结果判断中最重要也是具有意义的判断，其判断结果有助于统计学的分析处理。组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（最终阳性产物）进行测量，以数值反应被检测物质的含量。此法是阳性结果的进一步检测和分析，更加直观地反应实验结果，更有力地说明实验结果。常用有人工定量分析与仪器定量分析两类。
9.固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定，其作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抵制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。
10.组织化学：指在形态学基础上研究组织或细胞中物质的化学成分和活性，并进行定性、定位、定量及其代谢状态的学科。其目的是联系形态、化学万分和功能来了解组织或细胞的代谢变化。
11. ABC法：即亲和素-生物素-过氧化物酶复合物
法，其基本原理是在抗生物素和生物素之间形成共价和不可逆的结合，通过抗生物素在辣根过氧化物酶和第二抗体之间建立生物素桥联，使酶定位于所需测定的特异性抗体周围。其优点在于易于找到合适的第二抗体。
12.细胞骨架：指细胞内的结构网架，由一些细丝成分组成，包括微丝、微管、中间丝和微梁网格。
二、问答题
1.简述酶组织化学的基本原理。
答：在酶组织细胞化学方法中，从原理上讲，可分为两在类型。一类是酶是活性——酶组织细胞化学方法，属于一般组织细胞化学方法。一类是酶蛋白质的存在及存在的部位——免疫酶组织细胞化学方法，属于免疫组织细胞化学的内容。目前，通常是将两者结合起来，即显示酶活性，又酶蛋白的存在、分布及代谢情况。
2.用箭头表示免疫电镜技术（包埋前法）的过程。答：包埋前法实用于酶标法和PAP法。具体过程如下：取材→→固定→→冰冻切片（40~150μm）→→免疫染色（同酶标法和PAP法）→→选择阳性部位，在解剖显微镜下，取下阳性部位，裱于盖玻片上→→1%的锇酸固定，1~1.5h→→脱水→→平板包埋聚合→→修块、超薄切片（50~80nm）、裱于铜网→→重金属盐双重染色→→电镜观察、记录、照片。
3.简述核酸分子原位杂交组织化学的过程。
答：此过程包括：⑴杂交前准备：取材和固定→玻片及盖片的处理（粘附剂的使用）→器皿处理和溶液配制容器的处理→增加组织的通透性和核酸探针的穿透性→减低背景染色→防止RNA酶的污染；⑵杂交过程（杂交反应）：包括变性与杂交；⑶杂交后处理①冲洗：用一系列浓度不同的和温度不等的平衡盐液冲洗（一般原则是盐液的浓度由高到低，温度由低到高），并在冲洗的过程中防止切片干燥；②RNA酶消化处理：仅使用于RNA杂交。
⑷显示/杂交体的检测：①同位素标记者：用放射自显影技术显示。②非同位素标记者：应选择相应的方式显示。⑸对照实验：根据核酸探针和靶核苷酸的种类在现有可能条件下选定。
4.组织化学质量控制有哪些方法？
答：组织化学质量控制的方法有：⑴实验过程的质量控制：①试剂的质量控制，包括：试剂的特异性和敏感性；最佳的稀释度；在已知阳性和阴性的标本上，观察其染色结果的复合情况；要确定染色的温度和时间；保存的时间和有效期的时间。②操作步骤的质量控制，包括：组织标本制备的质量控制；操作过程各环节的质量控制a. 各种溶液的浓度、成分、PH值的控制，容器的质量标准。b. 特殊试剂的配制：c. 步骤中间环节的控制；⑵背景染色的控制①疏水作用②离子作用—电荷作用③内原性酶活性作用④抗体污染或/抗体纯度不高⑤内原性抗生物素/生物素蛋白结合活性⑥抗原的扩散⑦交差反应⑧其它原因。
5.比较PAP法和ABC法的异同。
PAP ABC 灵敏性低（1倍）高（20倍）
特异性高更高
背景一般有背景一般很少或无背景
复合物特点PAP复合物
只用于PAP法，且抗体与一抗的种族相同
ABC复合物
用途广，可通用，用生物素标记的均可
用途免疫组织化学（IHC）IHC、ELISA、原位杂交
6.简述PAP法的过程。
答：⑴处理切片，封闭内源性物质和避免交叉反应；
⑵抗孵育切片，湿室，37℃，30-60分钟；⑶PBS 漂洗，3次，5分钟/次；⑷2抗孵育切片，湿室，室温，37℃，30-60分钟；⑸PBS漂洗，3次，5分钟/次；⑹加入PAP复合物，孵育30分钟；⑺PBS漂洗，3次，5分钟/次；⑻染色0.01～0.02%H2O2+0.01～0.05%DAB+0.05～
0.10UMTris-Hcl(PH7.40)室温，3-5分钟，避光；
⑼漂洗，双蒸馏水洗涤；⑽复染；⑾漂洗，双蒸馏水洗涤；⑿脱水、透明、封片；⒀光镜观察，记录。
7.定量分析有哪些方法？
答：⑴人工定量分析；⑵仪器定量分析：①显微荧光分光光度计；②显微分光光度计/仪；③显微图像分析仪：灰度、长度、周边、面积、曲线长等；
④流式细胞计数仪；⑤激光扫描共聚焦显微镜技术。
8.增强组织化学染色的方法有哪些？
答：⑴酶消化在抗原暴露中的作用：①胃蛋白酶：0.4%、37℃、20～30分钟。②胰蛋白酶：0.1%、 37℃、5～40分钟。③链霉蛋白酶：0.06%、室温、10分钟。⑵微波炉处理在暴露抗原中的作用：其原理在于通过微波管发射较高频率的电磁波而使组织内部的分子发生高速振荡，使组织温度升高，同时加速分子交联，促使组织中抗原决定簇暴露。步骤：脱蜡、水化的标本微波处理10～20分钟，功率600W→室温冷却15分钟以上→常规免疫细胞化学染色。⑶不同抗原组织准备方法的检测：主要在固定方法和固定剂上存在差异。①细胞外和基底膜相关蛋白抗原：交联固定剂碳二亚胺和蛋白沉淀类固定剂乙醇。②细胞膜和胞浆相关免疫球蛋白：首选蛋白沉淀类固定剂乙醇。③胞浆酶和胞浆激素：醛类固定剂。④各类组织和细胞抗原：低浓度的多聚甲醛4-5h（4℃）固定后直接进行冰冻切片。
9.简述结果的判断的类型及意义。
答：结果的判断类型：⑴定性判断，即实验结果真实性判断；⑵定位判断，即结果出现的部位的确定，可以协助定性判断；⑶定量判断是结果判断中最重要也最具有意义的判断。意义：实验结果的判断直接关系着实验的成败，因此，结果判断是整个实验工作的核心和结论，必须是真实的结果，特别是一些实验结果与前人或与其它文献报道差异较大时，作出结果判断时应特别慎重。
10.简述核酸原位杂交技术的特点。
答：核酸原位杂交技术的特点如下：①特异性与敏感性高。②在组织细胞内定位可检测的靶序列。③能够将组织学表现与基因功能的变化相结合。④可完好的保存组织与细胞的形态结构。⑤不需要从组织细胞中提取核酸，避免了抽提中核酸量的损失。
⑥对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性，可在1%细胞中检出目的核酸序列。⑦可用于研究个别细胞中的核酸，而不受组织中其他细胞的影响。⑧不需要破裂细胞，经适当处理后探针可进入细胞，与细胞内核酸杂交。
11.用箭头表示石蜡切片技术的步骤。
答：石蜡切片技术步骤：①取材→②固定→③脱水→④透明→⑤浸蜡→⑥包埋→⑦切片。
12.简述免疫组织细胞化学技术的全过程。
答：免疫组织细胞化学技术全过程：抗原提取和纯化→→免疫动物→→抗体的分离、提取、纯化和效价的确定→→标记抗体→→标本制备→→免疫反应过程→→观察及结果判断与分析。
13.常见的免疫组织化学方法有哪些？
答：常见的免疫组织化学方法：①免疫荧光组织/细胞化学技术；②免疫酶标组织/细胞化学技术；
③过氧化物酶一抗过氧化物酶法（PAP法）；④抗
生物素—生物素复合技术（ABC法）；⑤SPA免疫组织/细胞化学技术；⑥免疫电镜技术。
14.影响核酸杂交的因素有哪些？
答：影响核酸杂交的因素：①核酸分子的浓度和长度：核酸浓度大，单链核酸间的碰撞几率大，复性几率大。单链探针浓度越大，杂交效率高，但双链探针浓度过高会影响杂交的效率。②温度：温度过高不利于核酸的复性，温度过低不利于少数碱基配对形成的局部双链分离。③离子强度：离子强度低，杂交速度慢，随着离子强度增高杂交反应率增加。
④杂交液中的甲酰胺：甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可减低核酸杂交的Tm。⑤核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度，复杂性越高，形成正确配对难度越大，反应速度越慢。⑥非特异性杂交反应：为减少非特异性杂交反应，在杂交前将非特异性杂交位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。
15.简述核酸分子原位杂交的基本原理。
答：核酸分子杂交是依据DNA双链碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样品中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法。即双链核酸分子（DNA双链）分子分解为单链—变性（采用加热/提PH值来实现）→→杂交后单链聚合为双链—退火/复性。
16.简述组织化学的基本要求。
答：组织化学的基本要求：①保持组织细胞良好的形态结构。②具备高度的特异性。③应有一定的灵敏性。④可重复性。⑤生物反映的产物必须在原位沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。
17.简述免疫组化在人体研究中的主要用途。
答：免疫组化在人体研究中的主要用途：㈠免疫组化在肿瘤病理学的研究和诊断中的主要应用：（1）组织起源不明肿瘤的研究；（2）研究病原体与肿瘤的关系；（3）协助确定肿瘤的良恶性；（4）测定肿瘤细胞的增殖活性；（5）分化差的癌和肉瘤的鉴别；（6）确定转移性恶性肿瘤的原发灶；（7）恶性淋巴瘤的诊断和分型；（8）为制定肿瘤的治疗方案提供依据。㈡免疫组化技术在病原微生物的鉴定中的应用；㈢免疫性皮肤疾病在诊断中的应用。
三、填空题
1.影响酶催化反应的因素是酶浓度、底物浓度、激活剂浓度、抑制剂浓度、PH值、温度。
2.核酸杂交的一般步骤是待测核酸的制备与变性→探针的制备及标记→固相支持物的选择与处理→预杂交、杂交、漂洗→检测显示杂交信号→结果的判断分析。
3.增强特异免疫染色的方法有①蛋白酶消化法②合适的抗体稀释液③温育的时间长短30~60℃4℃过夜④多层染色，提高敏感度。
4. 常用的固定剂是醛类、非醛类、金属类。
5.核糖体是核糖核酸和蛋白质组成。
6.抗体常用的标记物有荧光素、酶、抗生物素—生物素—HRP、金属。
7.根据探针的核酸性质分基因组DNA探针，cDNA 探针，RNA探针，寡核苷酸探针四类。
8.仪器定量分析技术有显微荧光分光光度计、显微分光光度计/仪、显微图像分析仪、流式细胞计数仪、激光扫描共聚焦显微镜技术。
9.组织化学的基本要求是保持组织细胞良好的形态结构，具备高度的特异性，应有一定的灵敏性，可重复性，生物反映的产物必须在原位沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。
10.石蜡切片的5大步骤是①取材→②固定→③脱水→④浸蜡、包埋→⑤切片。
11.组化中常用的酶类：辣根过氧化物酶（HRP）、小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶。
12. 固定基本原则是组织块要尽量小，固定要及时和适时，选择合适的固定剂，要注意固定剂的浓度、PH值和温度。
13.固定方法是浸入法和灌注法。
14.免疫组织/细胞化学特点是高度特异性，高度敏感性，方法和过程统一，形态、机能、新陈代谢等生命活动相结合。
15.核酸原位杂交技术的特点是
特异性、敏感性高；可检测的靶序列在组织细胞内定位；能够将组织学表现与基因功能的变化相结合；可完好的保存组织、细胞的形态结构；不需要从组织细胞中提取核酸，避免了抽提中核酸量的损失；对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性，可在1%细胞中检出目的核酸序列；可用于研究个别细胞中的核酸，而不受组织中其它细胞的影响；不需破裂细胞，经适当处理后探针可进入细胞，与细胞内核酸杂交。
16.内质网分粗面内质网和滑面内质网两类。
17.根据试剂或标记物的不同分一般组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、核酸分子原位杂交组织化学四类。
18.核糖体分游离核糖体、附着核糖体、多聚核糖体三类。
19.溶酶体分初级溶酶体、次级溶酶体、残余体三类。
20.细胞骨架是微丝、微管、中间丝和微梁网架组成。
21.确定最适PH的方法是查阅文献，根据前人的经验，预实验印证和实验测定最适PH值。22.实验过程的质量控制是试剂的质量控制、操作步骤的质量控制、背景染色的控制。
23.在酶组织化学中，根据其反应原则，显示酶的方法，可分为沉淀反应法和电子传递法两大类。
24.辣根过氧化物酶（HRP）显色原有DAB、AEC、CN、H-Y试剂。
25.荧光组织化学分为自发荧光、诱发荧光、荧光染色、免疫荧光、酶促荧光。
26.荧光图象的记录方法有描述法、荧光照相、暴光时间测定法、强弱表示法、显微荧光测定法。27.免疫反应的形成可分致敏阶段、反应阶段和效应阶段三个阶段。
28.PAP法的特点是抗体活性高；灵敏度高；背景染色浅，有利于观察和记录。
29.ABC法的优点是①敏感性强；②特异性强，背景染色浅；③方法简单，节约时间；④ABC试剂盒国内已大量生产，价格适中；⑤生物素具有与多种显示剂结合的能力，可用作双重或多重免疫染色。
30.免疫电镜技术的基本要求是保持超微结构完好，结构不改变；保存最多的抗原及抗原活性。31.免疫电镜技术分铁蛋白标记免疫电镜技术、酶标记免疫电镜技术、PAP法和胶体金免疫电镜技术四类。
32.胶体金免疫电镜技术优点是①金颗粒电子密度高，清晰可辩，形态规则；②方法简单一些，不如PAP法复杂；③同一组实验，可用不同直径的金颗粒可作多种抗原的区别研究，双标；④金标抗体能发生二次电子，可作用扫描电镜观察。
33.免疫电镜技术包埋后法缺点是①抗原及活性损失大；②部位不准；③得到阳性结果难度大。
四、实验设计题
（一）某实验室拟采用ABC法研究缺血性心肌损伤时ANP（ANF）的变化。请设计此课题。
1、准备哪些试剂和药品。
二甲苯；30% H2O2和浓盐酸；ABC免疫复合物试剂；抗大鼠ANP的特异性兔抗体（一抗）；生物素标记羊抗兔免疫球蛋白（二抗）；正常羊血清PBS 液；DAB显色剂；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；磷酸盐缓冲液PBS；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）等。
2、写出实验的思路或过程。
⑴实验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，实验组（缺血组）10只，对照组10只。
⑵实验组大鼠采用结扎冠状动脉方法制作缺血性心肌损伤模型，对照组（即假手术组）只暴露冠状动脉但不结扎。
⑶实验过程：①从实验组大鼠心肌损伤组织中按设计好的不同时间点取材（对照组取材部位、时间与实验组相同），制备石蜡切片标本；②石蜡切片脱蜡下水；③3%H2O2室温避光封闭20min，蒸馏水洗；④TBS微波修复抗原，0.01mLMPBS洗3min ×3次；⑤正常羊血清37℃，孵育20min，甩干不洗；⑥兔抗ANP37℃孵育1h，0.01MPBS洗3min ×3次；⑦生物素化羊抗兔IgG37℃孵育30min，0.01MPBS洗3min×3次；⑧加ABC复合物37℃孵育30min，0.01MPBS洗4min×4次；⑨DAB室温避光显色5～10min（镜下控制显色时间），自来水终止；○10切片脱水，透明封片。
⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。
⑸观察记录结果：出现棕黄色颗粒即为阳性结果。
⑹将实验组与对照组比较，用统计学方法分析，得出结论。（二）某实验室拟采用PAP法研究缺血性脑损伤时NPY的变化。请设计此课题。
1、准备哪些试剂和药品。
二甲苯；30% H2O2和浓盐酸；PAP免疫复合物试剂（来自于兔）；抗大鼠NPY的特异性兔抗体（一抗）；猪抗兔免疫球蛋白（二抗）；正常猪血清PBS 液；DAB显色剂；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；磷酸盐缓冲液PBS；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）等。
2、写出实验的思路或过程。
⑴实验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，实验组（缺血组）10只，对照组10只。
⑵实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉方法制作全脑缺血性动物模型，对照组（即假手术组）只暴露颈总动脉但不结扎。
⑶实验过程：①从实验组大鼠大脑皮质组织中按设计好的不同时间点取材（对照组取材部位、时间与实验组相同），制备石蜡切片标本；②石蜡切片脱蜡下水；③3%H2O2室温避光封闭20min，蒸馏水洗；④TBS微波修复抗原，0.01mLMPBS洗3min ×3次；⑤正常猪血清37℃，孵育20min，甩干不洗；⑥兔抗NPY37℃孵育1h，0.01MPBS洗3min ×3次；⑦猪抗兔IgG37℃孵育30min，0.01MPBS 洗3min×3次；⑧加PAP复合物37℃孵育30min，0.01MPBS洗4min×4次；⑨DAB室温避光显色5～10min（镜下控制显色时间），自来水终止；○10切片脱水，透明封片。
⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。
⑸观察记录结果：出现棕黄色颗粒即为阳性结果。
⑹将实验组与对照组比较，用统计学方法分析，得出结论。
（三）某实验室拟采用核酸原位杂交技术研究缺血性脑损伤时SPmRNA的变化。请设计此课题。1、准备哪些试剂和药品。
二甲苯；30% H2O2和浓盐酸；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）；0.1M PBS (pH7.2)；0.2M PB ((pH7.2)；0.1M甘氨酸；4%多聚甲醛；16×Denhardt溶液；预杂交液；20×SSC；抗体稀释液；TSM1；DIG DNA 标记检测试剂盒。
2、写出实验的思路或过程。
⑴实验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，实验组（缺血组）10只，对照组10只。⑵实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉方法制作全脑缺血性动物模型，对照组（即假手术组）只暴露颈总动脉但不结扎。
⑶实验过程：①麻醉大鼠后，用4%多聚甲醛灌流固定后取材，制备冰冻切片。②随机引物制备cDNA核酸探针，并用DIG DNA 标记检测试剂盒检测探针敏感性。③预杂交：滴加适量预杂交液，42℃30 min。④杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃过夜。（注意阴性对照）⑤洗片：4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min；0.05M PBS 洗5min×2次。⑥3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃30min.⑦滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过夜。⑧0.05M PBS洗15min ×4次; TSM1 10min×2次; 新鲜配制TSM2 10min ×2次。⑨显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。⑩将玻片置于TE中10-30min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。⑸观察记录结果：出现棕黄色颗粒即为阳性结果。
⑹将实验组与对照组比较，用统计学方法分析，得出结论。
（四）某实验室拟采用免疫电镜技术（包埋前法）研究缺血性脑损伤时NPY的变化。请设计此课题。
1、准备哪些试剂和药品。
二甲苯；30% H2O2和浓盐酸；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；0.01M PBS缓冲液；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）；0.5%戊二醛-2%多聚甲醛；30%蔗糖/PBS 溶液；1%牛血清；抗大鼠NPY的特异性兔抗体（一抗）；生物素标记羊抗兔免疫球蛋白（二抗）。
2、写出实验的思路或过程。
⑴实验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，实验组（缺血组）10只，对照组10只。⑵实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉方法制作全脑缺血性动物模型，对照组（即假手术组）只暴露颈总动脉但不结扎。
⑶实验过程：①麻醉大鼠后，经主动脉灌流0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定后取材，制成厚切片。②PBS漂洗3次，每次15min。③30%蔗糖/PBS溶液中室温下静置至沉底。④液氮冻融，增加细胞膜通透性。⑤1%牛血清孵育组织块30min后PBS漂洗3min×3次。⑥一抗4℃孵育过夜后室温继续放置2h后PBS漂洗5min×3次。⑦生物素化二抗室温孵育3-4h后PBS漂洗3min×3次。⑧2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h后PBS漂洗3min×3次。⑨DAB 室温避光显色5～10min（镜下控制显色时间），自来水终止；⑩1%锇酸固定30～60min后PBS漂洗，3min×3次。○11常规脱水，包埋。○12聚合。烤箱60℃24h。○13修块。聚合后的组织树脂片在显微镜下选取出阳性聚集的部位，用刀片修成1mm ×
1mm面积左右，粘于预先聚合好的树脂块上。而后依据阳性部位，将包埋块修成便于切片的形状和适当大小以提高电镜下的检出率。○14超薄切片。片厚60-100nm，置于100目铜网上。○15铅、铀染色：醋酸铀溶液染色8min，而后混合铅溶液染色8min。○16电镜观察。
⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。⑸观察记录结果：出现棕黄色颗粒即为阳性结果。
⑹将实验组与对照组比较，用统计学方法分析，得出结论。
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免疫组化技术全程原理
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
免疫组化临床意义
临床免疫组化意义 1恶性肿瘤免疫组化耐药预后标志全套4项：P-gP, GSTt, TOPOI, Ki-67。 2、乳腺癌免疫组化耐药预后标志全套7项：P-gp, GSTr, TOPO, Ki-67 , ER PR C-erbB- 2。 3、意义：标志物作用阳性部位临床意义 (1) 、多药耐药基因蛋白(P-Gp)药泵作用胞膜/胞浆，阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。 (2) 、谷光甘肽S转移酶(GSTr)解毒作用胞浆，阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。 ⑶、拓扑异构酶n(TOPO )靶点作用胞核，阳性率越高，对下列药物越无效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26阳性率高者对VP16尤其无效。 ⑷、雌激素受体(ER性激素作用胞核，阳性率越高，肿瘤对内分泌医治越无效，预后越好。 (5) 、孕激素受体(PR) 性激素作用胞核,阳性率越高,肿瘤对内分泌医治越无效,预后越好。 ⑹、C-erbB-2癌基因产物，胞浆阳性率越高，肿瘤恶性水平越高。ER PR阳性而C-erbB-2 也阳性者,用三苯氧胺医治效果不好。 (7) 、Ki-67 细胞增殖标志, 胞核阳性率越高肿瘤增殖越快,恶性水平越高。 Ki-67为细胞增值的一种标志，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多 肿瘤分化水平、浸润、转移、预后亲密相关。PCNA增埴细胞核抗原)。 (8) 、CEA 少数腺癌表达CEA (9) 、Rb (retinoblastoma 视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因,调理细胞周期。 (10) 、P53在免疫组化中均为渐变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 (11) 、Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。目前已被普遍使用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、喉癌等多种恶性肿瘤的检测。简直一切的研讨都标明，nm23蛋白高表达患者淋巴结转移率绝对较低，存活期绝对较长。 (12) 、E-Ca, E钙粘附蛋白，介导细胞间粘轮作用的跨膜糖蛋白，其功用丧失惹起细胞之间衔接的毁坏,次要用于肿瘤侵袭和转移方面的研讨。 (13) 、PS2(雌激素调理蛋白)，其表达和ER表达有关，可作为内分泌医治和预后判别的目标 之一。 (14) 、CK18 低分子量角蛋白,主要标志各种单层上皮包括腺上皮,而复层鳞状上皮常阴性, 主要用于腺癌诊断。 (15) 、CK19 散布于单层上皮和间皮,常用于腺癌诊断,肝细胞不表达,而胆管为阳性反应。 (16) 、Hep par 1, 肝细胞抗原,正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性,低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 (17) 、CK20用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、 肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 (18) 、CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 (19) 、Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin 通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上 皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾本质的上皮细胞中(特别是近曲小管)。Villin 在胃肠 道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有分明腺样构造的肿瘤上没有 villin 表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的能够性极低。乳腺癌也常常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别扫除的一种疾病。由于在转移癌组织上察看到分明的villin 免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极不能够为乳腺来源。其他villin 免疫组化染色通 常为阴性表达的肿瘤还有：如卵巢浆液性癌、尿道移行细胞癌和前列腺癌。间皮瘤也常常为villin 阴性表达，因而在一些状况下Villin 还可以作为鉴别间皮瘤和腺癌运用抗体的一种。 但是也有一些非胃肠道来源的肿瘤可表达villin ，如子宫内膜样腺癌、卵巢粘液性癌、肾细胞癌和小局部肺癌。也有一些专家报道Villin 在局部宫颈内膜腺癌病例中表达。 肝癌的诊断
免疫共沉淀实验原理与方法
免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀（CoIP）概述及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势： 与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项： 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到； 2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；
3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大； 4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高； 5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测； 6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1] 免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理及步骤 免疫组化操作规程 一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。 二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。 三、试剂配制 1. 0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml ； 1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH 2 PO 4 2·H 2 O ＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B （A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2·H 2 O ：15.6 g in 500 ml ddH 2 O ； B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O ：71.632 g in 1000 ml dH 2 O ）。 2. Citrate Buffered Saline （0.01 M 柠檬酸缓冲液， PH6.0 ）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O （A.Citrate acid
（柠檬酸）：10.5 g
加双蒸水至 1000 ml ； B.Citrate sodium （柠檬酸钠）： 29.41 g 加 双蒸水至 1000 ml ）。 3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3% 双氧水和 0.5%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ，再接着 加 120 ul TritonX-100, 并加热一儿，冷却至临用前加 0.4 ml 30 ％ H 2 O 2 。 4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。 5. 含 0.03 ％ H 2 O 2 的 0.05 ％DAB （避光） ：用 20×DAB （1％， 10 mg/ml ）5 ul ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。 6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7. Xylene 、梯度 Ethanol （100 ％×2、95％、80％、70％、50％）、 双蒸水、中性树胶（封裱剂）。 8. 苏木精染液： 四、操作步骤 1 、脱蜡、水化 60 ℃× 20 min →Xylene 2 × 10 minut ；es 80% ethanol 2 minutes ； 70% ethanol 2 minutes ； distilled water:5 min ； PBS 洗 3 次×3 min 。 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 100% absolute ethanol ：2 ×5 minutes ； 95% ethanol 2 minutes ；
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
免疫组化与免疫荧光的区别
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
免疫共沉淀详细顺序
精心整理 免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互白质Y beads ）蛋1.RIPABuffer 配制： 基础成分： Tris-HCl （缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl （盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 EDTA RIPA 激活的 NaF（ 2. 配制 1) 直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4 2)加10ml10%的NP-40 3)加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 4)加1ml100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5)理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度： 预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2.加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)； 3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；
免疫组化评分标准
免疫组化评分标准 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
免疫组化评分标准： The immunohistochemical staining results were assigned a mean score considering both the intensity of staining and the proportion of tumor cells with an unequivocal positive reaction. Each section was independently assessed by 2 pathologists without prior knowledge of patient data. 免疫组织化学染色结果分配一个平均评分，既考虑一个明确阳性反应染色强度和肿瘤细胞的比例。 Positive reactions were defined as those showing brown signals in the cell cytoplasm. For δ-catenin, a staining index (values, 0-12) was determined by multiplying the score for staining intensity with the score for positive area.阳性反应被定义为那些细胞浆显示棕色信号的。对于δ-catenin，一个染色指数（0-12）被定义为染色强度和染色区域的乘积。 The intensity was scored as follows: 0, negative; 1, weak; 2, moderate; and 3, strong. The frequency of positive cells was defined as follows: 0, less than 5%; 1, 5% to 25%; 2, 26% to 50%; 3, 51% to 75%; and 4, greater than 75%. 染色强度的分数被定为：阴性0分；弱1分；中等2分；强阳性3分。阳性细胞的频率被定义为：少于5%，0分；5%-25%，1分；26%-50%，2分；51%-75%，3分；大于75%，4分。 When the staining was heterogeneous, we scored it as follows: each component was scored independently and summed for the results. For example, a specimen containing 75% tumor cells with moderate int ensity (3 × 2 =6) and another 25%
免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
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常用免疫组化指标的意义
常用免疫组化指标的意义 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞核抗原)。 多数腺癌表达CEA Rb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。 E-Ca，E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2（雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。 CK18，低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应Hep par 1,肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。 CK20，用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。 CK7 卵巢、肺和乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠道上皮阴性。 Villin 绒毛蛋白，正常组织中，villin通常只表达于有刷状缘的细胞上，如胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极不可能为乳腺来源。其他villin免疫组化染色通常为阴性表达的肿瘤还有：如卵巢浆液性癌、尿道移行细胞癌和前列腺癌。间皮瘤也经常为villin阴性表达，因此在一些情况下Villin还可以作为鉴别间皮瘤和腺癌使用抗体的一种。 但是也有一些非胃肠道来源的肿瘤可表达villin，如子宫内膜样腺癌、卵巢粘液性癌、肾细胞癌和小部分肺癌。也有一些专家报道Villin在部分宫颈内膜腺癌病例中表达。 肝癌的诊断: Villin免疫组化染色可以显示出毛细胆管结构，因此它也可能在表达部分肝癌的管状结构上很有用。多克隆CEA是用于此目的的第一种试剂，而且CD10 (CALLA)在表达肝癌的该结构上也非常有用。多克隆CEA、villin和CD10 (CALLA)在肝癌病例上的表达，相互之间并没有任何的冲突，因此如果怀疑肝癌的可能性，建议将这三种抗体共同使用以协助疑难病例的诊断。 Villin在神经内分泌肿瘤上的应用: Villin在神经内分泌肿瘤的研究上也很有帮助。众所周知，类癌和胰腺的胰岛细胞肿瘤具有相相似的形态学特征，仅在形态学上区分这两种肿瘤几乎是不可能的。Villin在这种情况下特别有用，因为据文献报道在85%的胃肠道类癌病例中有villin的表达，但在胰岛细胞肿瘤上未见阳性表达报道。Villin在类癌上的表达通常为胞膜阳性。另外，有一些证据表明villin在胃和下消化道的小细胞癌上的表达率比在其他部位的小细胞癌上要高。如：肺、食道、膀胱或前列腺等。据文献报道，
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法 一、基本概念 免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。 不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。 二、抗体的选择 （一）多克隆抗体 多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。 （二）单克隆抗体 与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。 三、免疫沉淀方法 免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者，免
免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
免疫组化意义
免疫组化常用标记物 一、常用标志物 1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖 组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。免疫组织化学表达： 成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。 2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。存于某些恶性肿瘤组 织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。嗜铬素是位于神经分 泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～120 kDa，分布广泛。含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。几乎所有的神经内分泌肿瘤中 均可检测到嗜铬素。嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。 4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱 CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。 5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。因此，可用于鳞癌和腺癌、间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。支气管上皮基底细胞、间皮；鳞癌、大细胞癌、移行细胞癌、间皮瘤阳性。大多数腺癌为阴性。 6. 细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）---（阳性部位：细胞浆）。CK7是分子量为54 kDa的一种碱性细胞角蛋白，存在于大多数正常组织的腺上皮和移行上皮细胞中，一般 非上皮来源的细胞无表达。在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈阳性反应，而胃肠道的腺癌阴性。 7. 细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）---（阳性部位：细胞浆）。CK20（46kDa） 存在于正常的胃肠道上皮、移行上皮、Merkel细胞及其来源的肿瘤，而乳腺癌、肺癌和 神经内分泌肿瘤不表达。 CK7 positive CK7 negative CK20 positive uninformative c olorectum CK20 negative lung uninformative 8. 细胞角蛋白（高分子量）（cytokeratin，HMW）---（阳性部位：细胞浆）。高分子 量细胞角蛋白抗体（34βE12）可以识别68kDa、58kDa、56.5kDa和50kDa的细胞角蛋白。 9.上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）(MUC1)---（阳性部位：细胞浆）。上皮膜抗原是一种高分子量（400 kDa）跨膜糖蛋白，广泛分布于各种上皮细胞及其来源
免疫组化超详细步骤
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序
免疫组化的在病理中的临床意义
1 3、意义：标记物--作用--阳性部位--临床意义 物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。 药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。 蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其有效。 效，预后越好。 效，预后越好。 性而C-erbB-2也阳性者，用三苯氧胺治疗效果不好。 Ki-67为细胞增值的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增埴细胞
核抗原)。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。目前已被广泛应用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、喉癌等多种恶性肿瘤的检测。几乎所有的研究都表明，nm23蛋白高表达患者淋巴结转移率相对较低，存活期相对较长。 胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 断的指标之一。 常阴性，主要用于腺癌诊断。 CK19，分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应 多弱阳性或阴性。 乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。
胃肠道上皮细胞、胰腺和胆管上皮细胞以及肾实质的上皮细胞中（特别是近曲小管）。Villin在胃肠道癌、胰腺癌、胆囊癌和胆管癌组织中有很高的表达率，具有明显腺样结构的肿瘤上没有villin表达，则这个肿瘤为胃肠道、胰腺、胆囊或胆管来源的可能性极低。 乳腺癌也经常成为女性患者未知原发部位转移癌要鉴别排除的一种疾病。因为在转移癌组织上观察到明显的villin免疫组化阳性染色，则这个肿瘤就极不可能为乳腺来源。其他villin免疫组化染色通常为阴性表达的肿瘤还有：如卵巢浆液性癌、尿道移行细胞癌和前列腺癌。间皮瘤也经常为villin阴性表达，因此在一些情况下Villin还可以作为鉴别间皮瘤和腺癌使用抗体的一种。但是也有一些非胃肠道来源的肿瘤可表达villin，如子宫内膜样腺癌、卵巢粘液性癌、肾细胞癌和小部分肺癌。也有一些专家报道Villin在部分宫颈内膜腺癌病例中表达。 肝癌的诊断：Villin免疫组化染色可以显示出毛细胆管结构，因此它也可能在表达部分肝癌的管状结构上很有用。多克隆CEA是用于此目的的第一种试剂，而且CD10 (CALLA)在表达肝癌的该结构上也非常有用。多克隆CEA、villin 和CD10 (CALLA)在肝癌病例上的表达，相互之间并没有任何的冲突，因此如果怀疑肝癌的可能性，建议将这三种抗体共同使用以协助疑难病例的诊断。Villin在神经内分泌肿瘤上的应用：Villin在神经内分泌肿瘤的研究上也很有帮助。众所周知，类癌和胰腺的胰岛细胞肿瘤具有相相似的形态学特征，仅在形态学上区分这两种肿瘤几乎是不可能的。Villin在这种情况下特别有用，因为据文献报道在85%的胃肠道类癌病例中有villin的表达，但在胰岛细胞