同源序列克隆法

同源序列克隆法

抗病基因的分离、克隆不仅有助于我们深入理解植物－病原物的识别过程及其专性抗病分子机制，而且对于作物的抗病育种具有极大的应用价值。 1992 年，第一个抗病基因Hml被克隆 (Johal and Briggs, 1992) 。迄今已经从不同植物中克隆了约 50 个抗病基因，分别赋予植物体针对病毒、细菌、真菌、线虫和昆虫等广泛病原物类型的特异性抗性（汪旭升等， 2005 ）。尽管这些基因来自上十个不同的植物种属，特异识别的病原物类型各自不同，其核苷酸序列的同源性也较低，但是，其编码的蛋白质产物在结构上却有极大相似性，它们都拥有一些共同的结构域，如富含亮氨酸重复序列（ LRR ）、核苷酸结合位点（ NBS ）、丝氨酸－苏氨酸激酶区域（ STK ）、 Toll 和白介素－ 1 区域（ TIR ）和亮氨酸拉链（ LZ ）等。考虑到尚未被克隆的抗病基因其编码产物可能也存在类似结构域， 90 年代，许多研究者便提出了利用同源序列法快速克隆抗病基因的设想，其基本思路便是依据这些结构域中的高度保守区域，设计特异性的简并引物，通过 PCR 扩增 R 基因同源序列（ Resistance gene analogs, RGAs ），最后利用这些 RGAs 来快速分离 R 基因。

同源序列法克隆抗病基因相对于传统方法具有一定的优越性。传统的基因克隆方法主要有图位克隆法和转座子标签法，这两种方法都相当耗时耗力，并且在应用上有一定限制。例如大麦和小麦等作物的基因组较大并且重复序列较多，很难构建高密度的分子标记连锁图谱，因而图位克隆法分离基因相对困难；果树难以建立理想的分离群体，同时又缺乏合适的转座子系统，因此经典克隆抗病基因的方法都不适合。同源序列法分离 RGAs 的过程快速、简捷，并且应用上没有限制，因而能够在广泛植物中得到普遍应用。目前，已经从大豆（ Kanazinet al., 1996 ）、豌豆

（ Timmerman-Vaughan et al., 2000 ）、马铃薯 ( Leister et al., 1996) 、番茄 (Zhang et a1., 2002) 、柑橘 (Deng et al., 2000) 、苹果（ Lee et al., 2003 ）、葡萄 ( Donaldet al., 2002) 、辣椒（ Pflieger et al., 1999 ）、莴苣（ Shen et al., 1998;Meyers et al., 1998 ）、亚麻（ Dodds et al., 2001 ）、拟南芥（ Aarts et al,. 1998 ）、玉米 (Collins et al., 1998,1999 and2001 ; Ramalingam et al., 2003 ) 、水稻 (Wang 等，1998;Chen et al., 1998; Leister et al., 1998 and1999; Mago et al., 1999; Wang and Xiao, 2002) 、大麦 ( Leister et al., 1999; Mohler et al., 2002;Madsen et al., 2003 ) 、小麦 ( Feuilletet al., 1997;Chen et al., 1998) 等植物中扩增出大量 RGAs ，并利用这些 RGAs 鉴定到一些抗病候选基因。

同源序列法在野生稻抗病基因克隆方面的应用

野生稻是一个宝贵的资源库，是水稻育种的重要物质基础, 是天然的基因库，保存着栽培稻不具有或已经消失了的遗传基因。它具有许多优良特性，如抗逆、抗病、再生性强等，这些野生稻优良基因的发掘和利用对水稻生产有重要意义。疣粒野生稻（Oryza meyeriana Baill．）对白叶枯病高抗或接近免疫，高抗细菌性条斑病和褐飞虱，同时抗稻瘟病、螟虫，是一种优质的种质资源，国家二级保护渐濒危物种[34]。研究发现疣粒野生稻中没有与Xa1、Xa21

同源的基因，加之独立进化，推断其具有新的优异抗白叶枯病基因，值得深入研究和发掘利用[35]。刘继梅等[36]根据已报道的NBS－LRR 类和STK类抗病基因结构中的氨基酸保守区域，设计简并引物，通过PCR 扩增及克隆，从普通野生稻（O．rufipogonGriff．）、药用野生稻（O．officinalis Wall．）、疣粒野生稻中共获得14 类NBS－LRR 类抗病基因同源

序列、5 类STK 类抗病基因同源序列，其中疣粒野生稻中有6 类NBS －LRR 类，氨基酸同源性比较分析表明与已克隆的抗病基因同源性很低。李强等[37]用同源序列法从3 种野生稻中克隆出11 条NBS－LRR类抗病基因同源序列，经分析与水稻抗病基因RPR1 具有较高的同源性。周玮斌等根据NBS 的保守区设计引物，从普通野生稻基因组中克隆了4 个不同的同源序列。杨明挚等用高保真PCR 技术，从云南元江普通野生稻中克隆了抗稻瘟病Pi－ta 同源基因的编码区及Pib 基因的部分同源序列。在水稻中至今已鉴定了许多抗白叶枯病基因，大部分抗病基因都含有LRR 区[5,7－8]，由此可以推测疣粒野生稻抗白叶枯病基因也含有NBS－LRR 抗病结构域。水稻基因组测序的完成为抗病基因的克隆

提供了许多便利。本实验室根据网上发布的水稻基因组序列和基因芯片分析结果及氨基酸保守结构域设计引物，摸索条件，已从疣粒野生稻中克隆出4 个抗病基因同源序列，并连接到表达载体。其中一个已得到了全长cDNA。这4 个同源序列分别是TGA 基因家族成员，含有碱性亮氨酸拉链结构（bZIP）；RP1（rustresistance－like protein）基因同源基因，含LRR

结构；Xa 基因家族成员（严成其等，未发表）。序列比对结果显示，从疣粒野生稻中得到的序列与网上预测的栽培稻序列的差异较大。

同源基因克隆存在的问题与展望

同源序列法与图位克隆法和转座子标签法相比，更容易分离得到抗病基因。但对已克隆的抗病

基因同源序列片段与已知抗病基因的比较可以看出，抗病基因同源序列与抗病基因主要有3 种关系：抗病基因同源序列与目的抗病基因无关；抗病基因同源序列与目的抗病基因紧密连锁；抗病基因同源序列本身就是抗病基因或其假基因的一部分。这表明抗病基因同源序列与植物的抗病基

因仍有较大区别。因此，应用这种方法要注意一些问题。首先，在设计引物时应尽可能考虑到可能出现的问题和目的基因可能的类别，如进行PCR 检验时所设计引物是否会扩增出非目的片段。其次，抗病基因在植物中多成簇或以基因家族的形式存在，难以判断克隆产物是否为目的基因片段，且植物中有一些蛋白含LRR 或NBS 结构，如ATP 或GTP 结合蛋白，因此对获得的RGA 必须进行转基因检验，以最终确定是否为真正的抗病基因。第三，一些新的抗病

类型不属于保守域结构，具有新的编码蛋白，用此方法不能得到目的基因。目前应用同源序列法还未见得到完整抗病基因的报道。只得到了结构上与抗病基因类似的片段（RGA），但该方法对抗病基因的研究和克隆所显示的潜力是很诱人的。我们认为，在今后的研究中应当开发更有效的技术手段来发现新的抗病基因，运用生物信息学方法快速识别抗病基因，这将可能成为水稻抗病基因克隆和基因组分析的一大发展趋势和方向；同时，优化RGA 的分离克隆方法，结合当前先进的基因芯片等技术，用更短的时间从更多的植物中分离获得最多的RGA，并通过对同源序列的比较，预测序列中的基因及其结构，推测其功能和可能参与的生理生化反应，从而为后续研究提供宝贵信息。

扩展阅读：

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《同源序列法克隆植物抗病基因研究进展及其在野生稻中的应用》作者：李美玲1,2，严成其2，王栩鸣2，杨勇2，余初浪2，周洁2，程晔2，陈剑平2 单位：1．浙江师范大学化学与生命科

学学院，浙江金华321004； 2.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州310021