液相色谱实验报告
华南师范大学实验报告
液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯
一、实验目的
1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法；
2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术。
二、实验原理
高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液
器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，
由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、主要仪器和试剂
主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[ 配有紫外检测器，Phenomenex ODS柱]；
10μL微量注射器
试剂：苯标准溶液：10 .0 μL/mL ；
甲苯标准溶液：10 .0 μL/mL；
苯、甲苯混合标准溶液：10.0 μL/mL ；
甲醇： 80%；
苯和甲苯混合待测溶液；
四、实验步骤
1、标准溶液的配制系列
用 100 μL的微量注射器分别量取 10μL、 20 μL、 50 μL、 100 μL的苯和甲苯的混合标
准溶液（ 10.0 μL/mL），再分别加入 90μL、 80 μL、 50μL、 0 μL甲醇将其稀释，作为待测液，其浓度分别为 1μL/mL 、 2 μL/mL 、 5μL/mL 、 10 μL/mL
2、色谱条件优化
①按操作规程开机，并调好色谱条件，使仪器处于工作状态。控制流动相流速为甲醇：
0.8mL/min 、水： 0.2 mL/min ；柱温 30℃；检测波长254nm ；观察记录保留时间，通过软
件分析两峰分离效果。
②改变色谱条件，控制流动相流速为甲醇： 0.95mL/min 、水： 0.05 mL/min ；柱温 30 ℃；检测波长 254nm ；观察记录保留时间，通过软件分析两峰分离效果。
③通过观察两种色谱条件下的峰分离效果，选择最佳的色谱条件。若还不能达到最佳的
分离效果，可以再设定不同的色谱条件，然后根据峰分离效果，选择最佳的色谱条件。
3、苯、甲苯定性分析
在最佳条件下，待基线走稳后，用10 μL微量注射器分别进样5 μL苯和甲苯混合待测溶液，5μL苯标准溶液（ 10 .0 μL/mL）和 5μL甲苯标准溶液（ 10 .0 μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3 ～5 遍 )，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。
4、苯、甲苯定量分析
最佳条件下，待基线走稳后，用10μL微量注射器分别进样 1.0 μ L/mL 、2.0 μ L/mL、
4.0 μ L/mL、 10.0 μ L/mL的苯和甲苯混合标准溶液 5 μL。观察并记录各色谱图上的保留时
间和峰面积。绘制苯和甲苯混合标准溶液峰面积与相应浓度的标准曲线。
5、苯和甲苯混合待测溶液分析
最佳条件下，待基线走稳后，用察并记录各色谱图上的保留时间和峰面积浓度，并计算试样中苯和甲苯的含量。10 μL微量注射器进样苯和甲苯混合待测液5μL，观。根据峰面积在工作曲线上查出苯和甲苯待测液的
五、实验数据及分析
高效液相色谱数据报告
一、色谱条件优化
2.0μV(x100,000)
色谱
1.595%
1.0
80%
0.5
0.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0min
二、定性分析
5.0μ
色谱
V(x10,000)
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5min
苯
样品苯甲苯
保留时间 3.765 4.917
三、定量分析
苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为： 1 ul/ml, 2 ul/ml, 5 ul/ml, 10 ul/ml 。
4.0μV(x100,000)色谱
3.510 ul/ml
3.0
2.5
2.0
1.5 1 ul/ml
1.0
0.5
0.0
0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0min
苯甲苯
2.0面积 (x1,000,000)
3.0面积 (x1,000,000)
1.5
2.5
2.0
1.0 1.5
0.5
1.0
0.5
0.0
2.5 5.07.50.0
0.0 2.5 5.07.5
0.0浓度浓度浓度峰面积浓度峰面积
1 ul/ml212685 1 ul/ml387710
2 ul/ml429291 2 ul/ml747983
5 ul/ml954537 5 ul/ml1533892
10 ul/ml190534310 ul/ml2928373
Y = aX + b Y = aX + b
a = 186510.8 a = 278490.9
b = 36165.15 b = 146280.5
R^2 = 0.9995768R^2 = 0.9991048
R = 0.9997884R = 0.9995523
四、未知样品浓度
未知样品苯甲苯
浓度 2 2.7ul/ml 3.6ul/ml
浓度 1 2.9 ul/ml 3.6ul/ml
六、实验讨论
①由于实验中待测溶液的组分只有苯和甲苯两种物质，组分比较简单，只要在实验过程
中，严格控制且定量进样，就能采用操作、计算简便的标准曲线法得出准确的实验结果，因而
采用标准曲线法。若采用归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于
实验操作及计算均较为复杂，实验及数据处理的时间长，效率相对不高，故实验中采用标准曲线法作为定量的方法。
②最佳色谱条件的选择是本实验准确度的关键。若苯与甲苯的峰分离效果过小，苯与
甲苯的峰未能完全分离，必定影响其保留时间和峰面积的计算，是实验准确度减小，数据误差加大；若苯与甲苯的峰分离效果过好，虽然能将苯与甲苯的峰完全分离，实验准确度好，
但是耗费的实验时间较长，效率不好。因而，应选择合适的色谱条件。
③为了提高标准曲线的拟合度，可以重复进样多次，并且由同一人进样，以免因个体
习惯不同引起实验误差。进样针进样时确保进样针中没有残留气泡，另外，在进不同浓度或不同的物质前因先用乙醇溶液润洗干净，以免相互影响。
高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯
实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果
气相色谱法实验报告记录
气相色谱法实验报告记录
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实验五—气相色谱法实验 姓名：张瑞芳 学号：2013E8003561147 班级：化院413班 培养单位：上海高等研究院 指导教师：李向军 组别：2013年12月30日第二组
气相色谱法实验 一、实验目的 1.了解气相色谱仪的各部件的功能。 2.加深理解气相色谱的原理和应用。 3.掌握气相色谱分析的一般实验方法。 4.学会使用FID气相色谱对未知物进行分析。 二、实验原理 1.气相色谱法基本原理 气相色谱的流动向为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。气相色谱仪器框图如图1所示： 图1.气相色谱仪器框图 仪器均由以下五个系统组成：气路、进样、分离、温度控制、检测和记录系统。 2.气相色谱法定性和定量分析原理 在这种吸附色谱中常用流出曲线来描述样品中各组分的浓度。也就是说，让
分离后的各组分谱带的浓度变化输入换能装置中，转变成电信号的变化。然后将电信号的变化输入记录器记录下来，便得到如图2的曲线。它表示组分进入检测器后，检测器所给出的信号随时间变化的规律。它是柱内组分分离结果的反映，是研究色谱分离过程机理的依据，也是定性和定量的依据。 图2.典型的色谱流动曲线 3.FID的原理 本次试验所用的为氢火焰离子化检测器(FID)，它是以氢气和空气燃烧的火焰作为能源，利用含碳有机物在火焰中燃烧产生离子，在外加的电场作用下，使离子形成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检测被色谱柱分离出的组分。 三．实验试剂和仪器 (1)试剂：甲醇、异丙醇、异丁醇 (2)仪器：气相色谱仪带氢火焰离子化检测器(GC-2014气相色谱仪)； 氢-空发生器(SPH-300氢气发生器)、氮气钢瓶； 色谱柱； 微量注射器。 四．实验步骤 1.打开稳定电源。 2.打开N2钢瓶（减压阀），以N2为载气，开始通气，检漏；调整柱前压约为 0.12MPa。
液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯
华南师范大学实验报告 课程名称仪器分析实验实验项目液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯 实验类型□验证□设计□综合实验时间2010 年 3 月31 日 实验指导老师实验评分 一、实验目的 1.掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法； 2.了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术。 二、实验原理 高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内。由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动是，经过反复多次的吸附－解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，记录成数据。 液相色谱的定性依据是保留时间的相对性，通常相对误差不能大于5%。定量参数常常采用峰高、峰面积、相对峰高、相对峰面积等。定量方法通常采用外标法、内标法和面积归一化法。外标法为标准物质标准溶液制定标准曲线法；内标法为在标准溶液、样品溶液中加入内标物质，以相对峰高、相对面积对标准物质的浓度制定标准曲线；面积归一化法假定所有出峰物质的吸光系数相同，计算某物质的峰面积占所有峰面积的百分比。 三、仪器与试剂： 1.仪器：SCL-10A vp紫外可见双波长检测器；SPD-M10A vp柱温箱；LC-10AT高效液相
色谱仪；10μL微量注射器 2.试剂：2μL/mL苯标液；2μL/mL甲苯标液；0.2μL/mL、2μL/mL、4μL/mL、10μL/mL 的苯与甲苯的混合标准溶液；甲醇溶液；待测试样溶液 四、实验内容与步骤： 1.选择合适的流动相配比，优化色谱条件 设置有关参数：控制流速为1mL/min。柱温30℃，检测波长354nm。 设置流动相配比（甲醇：水=1：1），用10μL微量注射器注射5μL的10μL/mL苯与甲苯的混合标准溶液进行测定，观察其分离度和出峰时间。然后改变流动相配比，改进分离，调整出峰时间。从而得到最佳测定条件。 2.苯、甲苯定性分析： 在最佳的测定条件下，用10μL微量注射器，分别注射5μL2μL/mL苯的标准溶液和2μL/mL甲苯的标准溶液。观察记录保留时间，确定苯和甲苯的峰。 3.苯、甲苯定量分析： 在最佳的测定条件下，用10μL微量注射器，分别注射5μL 0.2μL/mL、2μL/mL、4μL/mL、10μL/mL苯与甲苯的混合标准溶液，再分别测定苯和甲苯的峰面积，以峰面积对浓度作图，做出工作曲线。 在最佳的测定条件下，用10μL微量注射器，注射5μL的试样，观察记录保留时间和峰面积。根据峰面积在工作曲线上查处苯和甲苯待侧溶液的浓度，并计算试样中苯和甲苯的含量。 五、数据记录及结果分析： 1. 优化色谱条件
高效液相色谱技术在药物分析中的应用
高效液相色谱技术在药物分析中的应用 毕业论文诚信声明书 本人声明：本人孙琮莘所提交的毕业论文《高效液相色谱技术在药物分析中的应用》是本人在指导教师李* 老师指导下独立研究、写作的成果，论文中所引用他人的无论以何种方式发布的文字、研究成果，均在论文中加以说明；有关教师、同学和其他人员对本文的写作、修订提出过并为我在论文中加以采纳的意见、建议，均已在我的致谢辞中加以说明并深致谢意。 论文作者：时间：2018年6 月日 指导教师已阅：时间：2018年6 月日 毕业论文版权使用授权书 本毕业论文《高效液相色谱技术在药物分析中的应用》是本人孙琮莘在校期间所完成学业的组成部分，是在指导教师李* 老师的指导下独立完成的。因此，本人特授权山东中医药大学药学院可将本毕业论文的全部或部分内容编入《山东中医药大学药学院本科生优秀毕业论文集》。 论文作者：时间：2018年6 月日 指导教师已阅：时间：2018年6 月日 本文着重阐述了高效液相色谱技术在药物分析中的应用，
主要包括对于天然药物、抗生素、手性药物、毒性药物、违禁药物、体内药物的分析及杂质检查，并对高效液相色谱技术的应用进行了展望。 高效液相色谱技术；药物分析；应用 天然药物结构复杂，种类众多，其分析研究往往极具挑战性，HPLC不仅能快速鉴定天然药物成分，还能快速筛选出多种未知成分，为分析复杂的天然药物提供了强有力的工具。狄志彪等利用HPLC测定了不同发酵培养基中虫草素的含量，采用了Welch Ultimate XB-C18反相色谱柱，流动相为水-甲醇，流速1 mL·min-1，检测波长为260 nm，为进一步研究液体发酵蛹虫草中虫草素含量的分析提供了依据。张晓霞等应用HPLC同时测定中药梅花中的绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷的含量，以岛津Inertsil ODS-4作为色谱柱，流动相为0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液，流速 1 mL·min-1，检测波长为355 nm，为制定梅花药材质量标准提供了新的方法和参考。六味地黄丸为熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮和茯苓六中药材组成的补肾名方，王灵霞等建立了HPLC测定3种不同剂型六味地黄丸中没食子酸、马钱苷、芍药苷和丹皮酚含量的方法，采用Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，流速为1 mL·min-1，检测波长为240 nm，为提高六味地黄丸质量控制标准提供参考，适用于不同剂型六味地黄丸的质量控制。
高效液相色谱仪操作步骤
高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。
高效液相色谱法测定甲硝唑的含量
实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 （一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 （二）实验内容 1、色谱操作条件的制定： 色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）； 流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立 （1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告 一、实验目的 1了解液相色谱的发展历史及最新进展 2 学习液相色谱的基本构造及原理 3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过HPLC分离测定来对目标化合物的分析鉴定。 二、实验原理 液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。液相色谱与气相色谱相比，最大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。 高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。 三、高效液相色谱的分类 吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法 四、高效液相色谱仪的基本构造 高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。 1 输液系统： 包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。贮液装置用于存贮足够量、符合HPLC要求的流动相。高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，因此需要高压泵输送流动相。 2 进样系统： 将待测的样品引入到色谱柱的装置。液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。进样系统包括取样、进样两项功能。 3 分离柱： 色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。商品化的HPLC微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。采用的固定相粒度甚至可以达到1μm，而制备色谱所采用的固定相粒度通常大于10μm。HPLC填充柱效的理论值可以达到50000/m～160000/m理论板，一般采用100-300mm的柱长可满足大多数样品的分析的需要。由于柱效内、外多种因素的影响，因此为使色谱柱达到其应有的效率。应尽量的减小系统的死体积。 4 检测系统： HPLC检测器分为通用型检测器和专用型检测器两类。通用型检测器可连续测量色谱柱流出物（包括流动相和样品组分）的全部特性变化。这类检测仪器包括示差折光检测器、介
高效液相色谱使用方法
面。 8、设Flow：5ml/min，单击OK。 9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pumpcontrol选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。 10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击PumpControl选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭 Purgevalve。 11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：1.0ml/min。 12、单击泵下面的瓶图标，如图所示（以二元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。 （二）数据采集方法编辑： 1、开始编辑完整方法： 从“Method”菜单中选择“Editentiremethod”项，如上图所示选中 除“Dataanalysis”外的三项，单击Ok，进入下一画面。 2、方法信息： 在“MethodComments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。 单击Ok进入下一画面。
3、泵参数设定：（以二元泵为例） 在“Flow”处输入流量，如1ml/min，在“SolventB”处输入70.0，(A=100-B)，也可Insert一行”Timetable”，编辑梯度。在“PressureLimitsMax”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 单击Ok进入下一画面。 4、自动进样器参数设定： 选择合适的进样方式，如图所示，进样体积1.0ul，洗瓶位置为6 号。“StandardInjection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功 能。“InjectionwithNeedleWash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Useinjectorprogram”---可以点击Edit键进行进样程序编辑。 点击Ok进入下一画面。 5、柱温箱参数设定： ●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度，并选中它，点击”more>>”键，如图所示，选中”Sameasleft”---使柱温箱的温度左右一致。 ●点击ok进入下一画面。 6、VWD检测器参数设定： ●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长，如254nm， 在”Peakwidth(Responsetime)”下方点击下拉式三角框，选择合适的响应时间，如 >0.1min(2s)。
HPLC实验高效液相色谱分析实验
仪器分析实验报告实验名称：高效液相色谱分析实验
一、实验目的 1. 了解HPLC的结构，了解仪器的开、关程序。 2. 了解流动相的制备和样品溶液的制备。 3. 知道仪器的运行程序和进行样品分析。 二、仪器和试剂 仪器：美国安捷伦1200型HPLC、10μL的微量注射器 试剂：磷酸乙腈溶液(PH=3)、重蒸水、邻氯苯甲酸 三、实验步骤 1.流动相的准备 流动相只有一组：PH=3的磷酸乙腈溶液，进过脱气，用蠕动泵输送。2.开机，色谱柱平衡 当1完成后，开机，待色谱柱平衡。 3.样品溶液的准备 配置好邻氯苯甲酸溶液，按要求选好滤纸的孔径大小。用低压过滤装置过滤，由于美国安捷伦1200型HPLC配有脱气装置，因此滤液无需事先脱气就可以进行分析。 4.基线的查看 由于仪器内部压力的变化可以引起基线的不断波动，因此，需等待压力稳定后，基线平稳才能进行进样。 5.样品进样分析
用10μL的微量注射器取5μL的邻氯苯甲酸，微量注射器中不能有气泡，将微量注射器的针头插入到注射的孔时，打开微量注射阀，将邻氯苯甲酸注射进去后，迅速关闭阀门，抽出针头，等待仪器的分析结果。 6.色谱柱的清洗 分析工作结束后，要清洗进样阀中的残留样品，也要用适当的液体来清洗色谱柱。 7.关机 实验完毕后，关闭仪器和电脑。 四、实验数据及处理 1.LC参数 2.色谱柱参数 3.四元泵状态 A：0.0％流速：1.000ml/min B：0.0％压力：91bar C：0.0％ D：0.0％
5.色谱分析谱图见附页，经过注射5μL的邻氯苯甲酸，得到三组实验色谱图， 根据谱图列表数据如下： 色谱柱长(L)、理论塔板高度(H)与理论塔板数(n)三者的关系为： n = L / H 理论塔板数和色谱参数之间的关系为： n = 16 ( t R / W b ) 2 = 5.54 ( t R / Y1/2 ) 2 则取第五组数据计算得： t R=2.437 min = 146.22s Y1/2 = 2.354(0.1375min / 4 ) = 4.855125 s n = 5.54 ( t R / Y1/2 ) 2 =5025 (块)
高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项
高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项 一、操作步骤： 1.开机前先将流动相过滤和超声：水流动相用混合滤膜（0.2μm）过滤,有机流动相用有机滤膜过滤，之后超声脱气15-20分钟。（过滤的目的是除去流动相里的杂质，以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱；超声的目的是排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响柱效能） 注：试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜，第一次使用时感觉效果不好，于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。 2.超声结束后，将流动相放置到规定位置（1号泵接水流动相，2号泵接有机流动相），开机逐个排气（先启动泵，排气结束后再打开检测器）。 3.排气结束后，关闭所有排气阀。先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，基线走稳之后，再打开水流动相（注意：水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min），继续走基线，直到基线平稳。 注意：实验结束后，再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，冲出色谱柱内残留的样品物质，预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内，导致下次使用难以冲出，色谱柱柱压偏高，基线不稳，出现大量鬼峰。（不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同） 4.走基线时，应将进样阀处于Load状态，用注射器进样时应快速进样，进样后将进样阀立即扳回到Inject状态，此时液相系统开始进入采样状态。采样结束后，可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑，也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。 二、使用中常见的问题及注意事项 1.过滤时有时会出现流动相漏液。可能的原因是滤膜放置不正确（有点偏）和接头有点错位，导致流动相从缝隙中漏出。 注意：操作时，应先向滤瓶内倒入少量流动相，观察是否漏液并开始过滤，若未漏液，再向滤瓶中添加流动相。 2.超声时，瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面，否则流动相内的气体可能无法排出液体，气体仍然残留在流动相内，以致开机排气时无气泡排出。
高效液相色谱法测定有机化合物的含量
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
液相色谱实验报告
华南师范大学实验报告 液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯 一、实验目的 1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法； 2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术。 二、实验原理 高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。 三、主要仪器和试剂 主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测器，Phenomenex ODS 柱]； 10μL微量注射器 试剂：苯标准溶液：10.0μL/mL； 甲苯标准溶液：10.0μL/mL； 苯、甲苯混合标准溶液：10.0μL/mL； 甲醇：80% ； 苯和甲苯混合待测溶液； 四、实验步骤 1、标准溶液的配制系列 用100μL的微量注射器分别量取10μL、20μL、50μL、100μL的苯和甲苯的混合标准溶液（10.0μL/mL），再分别加入90μL、80μL、50μL、0μL甲醇将其稀释，作为待测液，其浓度分别为1μL/mL、2μL/mL、5μL/mL、10μL/mL 2、色谱条件优化 ①按操作规程开机，并调好色谱条件，使仪器处于工作状态。控制流动相流速为甲醇： 0.8mL/min、水：0.2 mL/min；柱温30℃；检测波长254nm；观察记录保留时间，通过软件分析两峰分离效果。 ②改变色谱条件，控制流动相流速为甲醇：0.95mL/min、水：0.05 mL/min；柱温30℃；检测波长254nm；观察记录保留时间，通过软件分析两峰分离效果。
最新高效液相色谱使用方法
最新高效液相色谱使用方法 一、流动相准备 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 二、开机 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 三、抽气 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 四、调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 五、2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 六、2487紫外检测器的使用 1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 2、设置检测波长 3、预热30分钟左右，即可注样测定。
试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。
高效液相色谱法测定邻苯二甲酸酯实验报告记录
高效液相色谱法测定邻苯二甲酸酯实验报告记录
作者: 日期: 2
高效液相色谱法测定邻苯二甲酸酯 1553607胡艺蕾 实验时间：2017年4月1日实验温度：19.0 C 、实验目的 1、了解高效液相色谱仪的组成及其工作原理和基本操作。 2、对邻苯二甲酸酯进行分离和测定。 3、探究不同流动相及不同流动相比例对流速、柱压、保留时间及分离度的影响。 4、了解液相色谱法定量测定的原理。 二、实验原理 1、实验采用的反相液固吸附色谱法，其分离机理是：当流动相通过吸附剂时，在吸附剂（固体相）表面发生了溶质分子取代吸附剂上的溶剂分子的吸附作用。固体相为非极性分子，如十八烷基键合相，流动相为极性分子。 2、组分分子与吸附剂之间作用力的强弱决定它的保留时间。溶质分子官能团的性质和分子结构的空间效应都会影响其出峰的顺序。本次实验为邻苯二甲酸酯，其分子官能团都相同， 但由于DMP其官能团相邻的烷基较小，导致其保留值最小，因此出峰顺序为：DMP（邻苯二甲酸二甲酯）＞DEP邻苯二甲酸二乙酯）＞DBP（邻苯二甲酸二丁酯）。 3、在吸附色谱中，流动相的洗脱能力与溶剂的极性有关，极性越大，洗脱强度也越大。本次实验使用的三个流动相的极性大小为：水＞乙腈＞甲醇。通常选择二元混合溶剂作为流动相。 4、定量分析中，定量峰与其他峰之间的分离程度称为分离度 R: 通常用塔板数n来描述色谱的柱效: 三、实验仪器与试剂 1、仪器 Agilent1260高效液相色谱仪:
脱气机：真空室内半透膜管路，对流动相进行脱气四元泵：二元泵各控制一种溶剂可设置的流速范围：0.001 - 10 mL/min 0.001 mL/min 步进UV检测器：用于检测通过样品后的紫外光 类型：双光束光路设计 光源：氘灯波长范围：190 - 600 nm 手动进样器：进样20L 色谱柱：填料汁八烷（适合中性、弱酸碱） 4.6x 100mm, 3.5 1 m 2、试剂 流动相：纯水、甲醇、乙腈 样品：DMP、DEP DBP 四、实验步骤 1、开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动软件。 2、预先脱气（直到导管中无气泡），设定波长：220nm。 3、设定流速、流动相比例等参数，选择合适的流动相。 4、进样阀柄置于“ LOAD',进样针用乙醇洗涤2-3次，取样，进样，将进样阀扳至 5、保存并处理数据。 五、实验结果 1、样品：DMP1:20水溶液201 L流动相的比例为：高纯水：30%乙腈：70%流速: “INJECT。 1.00ml/min 4
高效液相色谱操作手册
转 HP1100高效液相色谱使用说明书注意事项: 1使用前，应申明样品名称和特性以及使用的流动相。 2更换色谱柱应由中级仪器实验室完成。 3溶剂必须经微孔滤膜过滤，所有废弃物(溶液等)请带走自行处理。 4不得在计算机上进行与实验无关的操作。 5注意适时更换废液收集瓶，防止废液溢出。 6认真登记实验记录。 7相关论文发表后，应送一份复印件给中级仪器实验室。 北京大学化学学院中级仪器实验室 一、概述 HPLC1100系统构成如下： 1 流动相A B C D 2 真空脱气装置3、6、9、11 电缆 4 输液泵 5 自动进样器（无）7 柱温箱8 检测器（DAD） 10 数据接收处理控制系统（计算机）12 打印机13 手动进样器 1．指示灯状态 每个部件接通电源后，LED灯显示绿色； 黄色Not Ready 绿色Run 红色Error 2．四元泵系统的工作原理图
3．柱温箱的特征 ●可以在低于室温10℃至80℃间恒温 ●空间大，可以容纳三根30cm长的柱子 ●安装柱识别可以记录进样次数 ●两个单独的加热区 ●可以程序升温 4．检测器 HP1100高效液相色谱仪配置的单光路二极管阵列检测器的光路如下所示： 光源发出的复合光经消除色差透镜系统聚焦后，照射到流通池上，透射光经全息凹面衍射光栅色散后，投射到一个由1024个二极管组成的二极管阵列上而被检测。此光路系统中光闸是唯一的运动部件，它有三个动作位置：（1）光闸将入射光束全部遮挡，以进行暗电流补偿；（2）将氧化钬滤光片插入光路，对衍射后的波长进行精确校正；（3）打开光闸使入 射光通过样品流通池照在光栅上。
HP1100系统所有控制和操作基本在计算机上完成，熟悉软件十分重要。本系统操作是基于Windows NT的多窗口多任务操作系统，要注意窗口之间可能覆盖。 根据所选色谱柱的性能，本系统可用于分子量小于2000的各种化合物的分离分析。目前中级仪器实验室仅备有ODS反相柱（可用于弱极性化合物及弱离子型化合物的分析）。一般要求自备色谱柱。自备色谱柱应使用HP系列接口，大连化物所及天津Autoscience公司可提供，一般分析柱的价格在1600－2000元之间，HP进口柱价格在4000元人民币左右。 本系统可提供多达四元体系的各种梯度淋洗，但在选择溶剂时须十分小心。流动相选择对分离分析有着重要的影响。 二、开机 打开各部分电源，脱气装置、输液泵、柱温控制、检测器的指示灯变黄。 开启计算机，若有选项，选择开启Windows NT4.0。点START－PROGRAM－HPChemStation－Instl online，计算机开始与仪器联接，并打开各控制界面，此时，各单元指示灯变绿，在工具条的View中选择界面为Runcontrol。 在第一个小窗口中利用下拉菜单，选择显示界面为Method and Run Control； 在第二个小窗口中选择已设定的使用方法（若是旧用户则有记录），新用户先编辑实验方法，然后选工具栏中Method－Save Method As（具体见后）。 第三个小窗口中显示LC操作条件。 三、样品分析 1．溶剂的处理和设置 不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器，降低泵的性能。遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器的寿命： ●使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌 ●用滤膜过滤溶剂去除微生物 ●每二天更换或过滤溶剂 ●避免溶剂瓶直接日照 各洗脱液应分别过滤，注意有机相和水相应使用不同的滤膜。 避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂： ●卤化物碱金属溶液和相应的酸溶剂 ●高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸 ●能够形成卤素自由基或酸的卤化物试剂及其混合物 ●含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂过滤吸收氧化物 ●在有机溶剂中的有机酸溶剂 ●含有强络合剂的溶液 ●四氯化碳和异丙醇或THF混合物 溶剂的设置： 在输液泵图标上按鼠标左键，在出现的小菜单中选Setup Pump，在Solvents栏中输入A、B、C、D溶剂名称；点溶剂瓶图标，在Solvent Bottles Filling中输入A、B、 C、D各溶剂的实际体积数。点OK确定并退出。 2．设置泵的参数 点输液泵图标，选Setup Pump，出现流速控制界面。设定流速flow rate（一般ODS
最新高效液相色谱法测定维生素C
高效液相色谱法测定维生素C的含量 【摘要】高效液相色谱法已经成为解决生命科学、医药学发展中各种难题的重要手段，在实验室中也广泛应用于物质的定性定量分析。本实验中利用高效液相色谱法对维生素C进行定量分析，所采用的定量分析方法为外标法，通过做出标准溶液浓度与峰面积的标准曲线进而对样品中的维生素C进行定量检测。 【关键词】高效液相色谱法、维生素C、含量 1、引言 维生素 C（Vitamin C, Vc）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素。Vc 在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。人体内缺乏 Vc 时容易导致坏血病。同时，由于 Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。Vc 在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。 溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。 2、HPLC测定维生素C的含量 2.1、仪器试剂 2.1.1、仪器 高效液相色谱仪（Agilent1260），色谱柱：C18 柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5 μm)；平头进样器。 2.1.2、试剂 乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素 C，磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水为超纯水。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法 一、流动相准备 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 二、开机 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 三、抽气 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 四、调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 五、2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 六、2487紫外检测器的使用 1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 2、设置检测波长 3、预热30分钟左右，即可注样测定。
试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。