细胞生物学实验报告

实验一：细胞的形态观察及其大小测量

一、实验目的：

1、通过对原核和真核各种形态细胞的光学显微镜观察，了解细胞的形态及其显微结构；

2、学习显微测量的方法，对细胞的大小有一直观认识。

二、实验材料和仪器：

小白鼠肝细胞切片；鸡血红细胞；蚕豆叶片横切片；

普通光学显微镜；目镜测微尺；镜台测微尺；载玻片；盖玻片。

三、实验步骤：

(一)细胞形态观察

l、动物细胞的观察

（1）人肝细胞切片：在显微镜下仔细观察肝细胞的形态构造。

（2）鸡血细胞涂片的观察：观察血细胞的组成；红细胞、白细胞、血小板的形态特点。

2、植物细胞的观察

（1）取蚕豆叶片横切片的观察：注意表皮细胞和叶肉细胞的基本结构。

（二）细胞的大小和测量

1、卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜

的上透镜。

2、将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。调焦至

能看清镜台测微尺的分度。

3、小心移动镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度模糊，可转动目镜上

透镜进行调焦)，使两尺左边的一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的

直线。

4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每

格等于多少μm：

镜台测微尺的格数

目镜测微尺每格的微米数=—————————× 10

目镜测微尺的格数

四、实验结果：

1、目镜校正：40倍显微镜目镜测微尺每格的微米数=17/70=0.24

五、作业与思考：

1、血细胞按含量高低，主要含有：红细胞，白细胞，血小板。

白细胞最大，红细胞次之，血小板最小。红细胞：主要的功能是运送氧。白细胞：主要扮演了免疫的角色，当病菌侵入人体时，白细胞能穿过毛细血管壁，集中到病菌入侵部位，将病菌包围，吞噬。血小板：止血过程中起着重要作用。细胞形态见下图。

2、植物细胞一般比动物细胞大一些。形态图见下。

3、在不同放大倍数下，测定的细胞大小基本一致，但有一些偏差。放大倍数越大，在视野中同等实际距离下的两点视野距离更大，而更容易测量准确。

实验二：PAS（Periodic Acid Schiff）反应显示糖原和其它多糖物质

一、实验目的

1、熟悉PAS法原理及操作步骤；

2、观察PAS反应的染色结果，并观察多糖在组织细胞中的分布。

二、实验原理

多糖是由多个单糖分子缩合脱水而生成的化合物。一些不溶性的多糖构成植物和动物的骨架，如植物的纤维素和动物的甲壳素，一般称为结构多糖。另一些多糖在生物体内作为能量贮存，如淀粉（植物）和糖元（动物），在需要时可以通过生物体内酶系统的作用分解，释放出单糖。

三、实验用品：

过碘酸酒精溶液、Schiff试剂、亚硫酸水溶液、苏木精溶液、二甲苯、100%乙醇+二甲苯（1：1）。

梯度乙醇溶液：100％，95％，90％，80％，70％，50％各两份，一份用于脱腊复水，一份用于脱水。

载玻片、盖玻片、染色缸、显微镜、小烧杯、胶头滴管、镊子、刀片、土豆；小鼠肝细胞石蜡切片。

四、实验步骤:

（一）土豆切片的观察

制作土豆徒手切片→过碘酸处理15～30min→70%乙醇1min→ schiff 试剂15min →亚硫酸水漂洗2～3次→蒸馏水漂洗→镜检

（二）小鼠肝细胞切片的观察

取鼠肝石蜡切片→二甲苯脱蜡约 10min →二甲苯+100%乙醇（3 min）→梯度乙醇脱二甲苯，在各浓度乙醇（100％，95％，90％，80％，70％，50％）中约 2～3 min →过碘

酸氧化 15～30 min →蒸馏水漂洗→ Schiff 试剂 15～30 min →亚硫酸水漂洗 2～3 次→蒸馏水漂洗→苏木精染色 10 min →流水冲洗→梯度乙醇脱水（50％，70％，80％，90％，95％，100％），在各乙醇浓度中约 2～3 min →100%乙醇+二甲苯 2～3 min→二甲苯适度透明→指甲油封片→镜检

五、实验结果：

土豆切片观察鼠肝切片观察

六、作业与思考:

1、描述土豆切片和鼠肝切片中糖原分布特点。

土豆切片中，多糖多在细胞质液泡中。

鼠肝切片中，多糖多在靠近核的区域。

2、影响 PAS 反应染色效果的关键步骤是什么？

Camey固定液固定；Schiff 染色液染色；对分色的控制。

3、如何制作徒手切片？应注意什么才能得到薄而均匀的切片？

应注意需要连续快速地切下多片薄片，并从中选出较好的切片。

实验三：叶绿体的分离与荧光观察

一、实验目的：

1、通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。

2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。

二、实验原理：

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。

某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光，这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光）。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光）。

三、实验材料和仪器：

普通离心机,粗天平,荧光显微镜，剪刀，研钵，移液管，漏斗，滴管, 10ml刻度离心管,纱布若干, 无荧光载玻片和盖玻片，新鲜菠菜，0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙(acridine orange)、

四、实验步骤：

1、叶绿体的分离

（1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵；

（2）加10ml的0.35mol?L-1 NaCl溶液研磨匀浆；

（3）用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中；

（4）取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀；

（5）将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；

（6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。

2、叶绿体的观察

（1）滴叶绿体悬浮液一滴于载片上，加盖片；在普通光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。

（2）滴叶绿体悬浮液一滴于无荧光载片上，加无荧光盖片；在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。

（3）滴叶绿体悬浮液一滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。

3、完整细胞中的叶绿体观察

（1）用镊子撕取一片菠菜叶子表皮，平铺于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。

（2）用镊子撕去菠菜叶子的表皮，用刀片刮下一些叶肉细胞，放于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。

（3）将以上两种制片进行一下三种方式的观察：

a、通光镜下观察。

b、光显微镜下观察。

c、加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后，在荧光显微镜下观察。

五、实验结果:

叶绿体自发荧光叶绿体次生荧光

表皮细胞（荧光）

表皮细胞（光镜）

木质素（荧光）

六、作业与思考：

1、描述你所观察到的实验现象，自发荧光和次生荧光的区别？

自发荧光：有些生物体内的物质受激发光照射后，直接发出的荧光称为自发荧光，如叶绿素的火红色荧光。

间接荧光：有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，则称为间接荧光，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。

2、叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？

通过研磨绿色植物叶片使叶肉细胞破损，叶绿体被释放到提取液中，再通过等渗介质中差速离心去除杂质，再次离心，则可分离出叶绿体沉淀。

应注意须在低温下迅速提取，且须注意等渗液溶度，离心速度和时间的把握，避免叶绿体破裂。

实验四：吖啶橙(acridine orange)染色

观察口腔上皮荧光

一、实验目的

1、熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。

2、观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。

二、实验原理

吖啶橙荧光染料可与细胞内DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530～640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。

三、实验用品

荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签；口腔黏膜上皮细胞临时制片；

0.1mol/L pH7、0 PBS液。0.1％吖啶橙原液、95％乙醇

四、实验步骤

1、用牙签刮取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上；

2、95％乙醇溶液固定5min；

3、滴加0.01％吖啶橙染液染色5min；

4、用PBS缓冲液缓慢冲洗；

5、加盖玻片镜检。

五、实验结果

实验五：植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的

掌握植物细胞骨架的制备方法，并用光镜观察洋葱内皮细胞的骨架网络结构。

二、实验原理

细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。本实验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。

三、实验用品

1、器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、擦镜纸、50ml烧杯；

2、实验材料：洋葱鳞茎；

3、试剂： pH6.8的磷酸缓冲液、M-缓冲液、1%TritonX-100、3%戊二醛、0.2%考马斯亮蓝R250 染液、50％，70％，95％乙醇、）叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶。

四、实验步骤

1、取材：撕取洋葱鳞茎内表皮0.5～1cm2，浸入装有磷酸缓冲液（PH6.8）的小烧杯中，处理5～10分钟。

2、去垢处理：弃去PBS缓冲液，用吸水纸吸净剩余的PBS，加适量1%Triton X-100，使液体充分浸泡材料，并立即放入37℃恒温箱或水浴锅中处理30分钟。

3、冲洗：吸去1%Triton X-100，立即加入M缓冲液轻轻冲洗3次，每次3～5分钟。

4、固定：用吸管将M缓冲液吸尽，加入3%戊二醛，固定10～20分钟。

5、冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用磷酸缓冲液（pH6.8）冲洗3次，每次3～5分钟。

6、染色：吸去PBS缓冲液，加入适量0.2%考马斯亮蓝R250染料，染色10～20分钟。

7、制片：吸去染料，用水冲洗（注意不要将材料丢失）。将洋葱表皮伸展铺平于载玻片上，加盖盖玻片。

8、镜检

五、实验结果

洋葱内皮细胞（40倍物镜）洋葱内皮细胞（20倍物镜）

六、作业与思考

1、绘出洋葱细胞的骨架网络分布。

2、根据 M-缓冲液的成分，分析其作用。

咪唑：稳定 PH 值，缓冲作用；

KCL：提供离子，对骨架起聚合作用；

MgCl2：提供离子，对骨架起聚合作用；

EGTA：螯合Ca离子，Ca离子对聚合不利；

EDTA：螯合Ca离子，Ca离子对聚合不利；

巯基乙醇：起还原作用，稳定骨架结构。

3、通过实验过程，推测你所观察到的细胞骨架属于胞质骨架中的哪种类型，为什么？

推测为所观察到的蓝色纤维属于细胞骨架中的微丝结构。因为微管的结构较不稳定，部分纤维太细，光镜下难以分辨；而中间丝不是植物细胞的必须结构，在植物细胞中并不普遍存在，且中间丝更为纤细，光镜下更难以观察。因此，推测为微丝。

实验六：PEG法诱导细胞融合

一、实验目的

1、了解细胞融合的原理和过程；

2、初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术。

二、实验原理

细胞融合，即在自然条件下或利用人工法，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。

化学融合方法一般使用聚乙二醇(PEG)诱导细胞在体外进行融合。普遍认为PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度(有效工作浓度50%)的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的PEG分子量，浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。

细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。

三、实验用品

1、器材: 离心机、显微镜、天平、水浴锅、滴管、离心管、烧杯、盖玻片、载玻片。

2、材料：鸡血悬液；

3、试剂：0.85%的生理盐水、GKN液、1%詹那斯绿B、Hanks溶液。

四、实验步骤

1、鸡血红细胞悬液的制备：将抗凝剂与鸡血按1:3~1:4的比例稀释，制成鸡血红细胞细

胞悬液；

2、取鸡血1ml，加入4ml 0.85%的生理盐水，1000rpm离心3min, 弃上清液，重复上述操

作一次；

3、沉淀用适量Hanks溶液重悬浮，1000rpm离心3min, 弃上清液；

4、迅速加0.5ml 50% PEG溶液，滴管轻柔吹打悬浮细胞，37℃水浴中进行细胞融合（30min

左右）；

5、缓慢加入Hanks溶液，轻轻混匀，终止PEG的作用，使细胞三三两两地分散开来（镜

检），室温静置约20min；

6、取1小滴悬液于载玻片上，加少量的詹那斯绿B染液，染色5min左右；

7、镜检，观察细胞融合现象。

五、实验结果

鸡血细胞融合

六、作业与思考

1、请分析 Hanks 溶液的作用是什么（可以从其成分的角度来回答）？

1.作为平衡盐溶液无机盐和葡萄糖浓度接近大部分动植物细胞的水平；

2.终止细胞融合；

3.制备细胞悬液，使细胞分散。

2、PEG 诱导细胞融合率受哪些因素影响？

受PEG的相对分子质量、PEG 的体积分数、融合时的时间长短及温度高低等因素影响。

3、你认为在进行细胞融合时，需要注意哪些问题？

在加入PEG溶液后，应立即用滴管轻轻吹打悬浮细胞，可能出现多数细胞聚集的现象，在融合过程过后无法对细胞进行融合观察。

实验七：动物骨髓细胞染色体标本的制备与

观察

一、实验目的

1、掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术

2、观察染色体的数目以及形态特征

二、实验原理

骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度的分裂能力，可以直接观察到分裂细胞。经过秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本。骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室都可进行。

三、实验用品

1、仪器：天平、低速离心机、恒温水浴锅、显微镜、1ml注射器、解剖盘、解剖剪、刀片、

试管架、10ml离心管、吸管烧杯、量筒。酒精灯、冰冻载玻片、玻璃板、吸水纸、擦镜纸

2、材料：小白鼠

3、试剂：Carnoy固定液、0.1％秋水仙素、0.85%生理盐水、柠檬酸钠溶液、0.4%KCl溶液、

40.0667mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）、1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液。

四、实验步骤

1、骨髓细胞制备如下表：

2、 1000rpm离心8min。

3、弃上清，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰醋酸（3:1）固定液5ml，注意不要冲动

细胞团块。加完后立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20min。如此反复固定2

～3次，

每次20min。

4 固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，细胞团块轻轻吸打成悬液（注意：吹打不要过于用力）。

5、在干净并预冷的载玻片上滴2～3滴细胞悬液，干燥。（注意：滴片时滴管离载玻片有一定高度有助于染色体分散）

6、将玻片细胞面朝上水平放置，滴加1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液3～4ml，染色10min。

7、冲洗掉染液，干燥后镜检。

五、实验结果

老鼠大腿骨髓细胞染色体

六、作业与思考

1、在制备小鼠骨髓细胞染色体时为什么要进行预固定？

由于分离得到的染色体处于不同的分裂期，进行预固定是为了将这些细胞及其染色体固定在当前所处的时期，便于观察。实质就是将细胞杀死，使其无法继续进行有丝分裂。

实验八：酵母活性的检测及线粒体活性观察一、实验目的

掌握检测细胞活性的原理和方法，线粒体原位染色原理及线粒体观察。

二、实验原理

美兰（次甲基蓝）染色法对啤酒酵母活性检测简单易行，该染色法主要是利用细胞膜的完整性与新陈代谢的能力说明细胞活性。活酵母细胞内具有还原次甲基蓝呈无色的一种还原酶，当酵母细胞浸于美兰溶液时，色素渗入细胞内，活细胞内的还原酶能使其脱色，但死细胞内的还原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色。

台盼兰是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。

TTC即2,3,5-氯化三苯基四氮唑，可以用来测定脱氢酶的活性。在细胞的线粒体中四氮唑从电子传递链上接受电子形成三苯基甲腙，其为脂溶性物质，形成后随即插入线粒体等膜中或脂滴中，变成红色。细胞活力强，有氧呼吸旺盛，这种转化能力就强，红色深；而死细胞新陈代谢停止不能使四氮唑转变成三苯基甲腙衍生物，细胞不着色。此法常用于悬浮培养细胞等材料整体活力检测（分光光度法），在单个细胞活力检测中较少用。

詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。

三、实验用品

1、材料：液体振荡培养的酵母。

2、仪器：倒置显微镜（生物显微镜），低速离心机，血球计数板，15mL离心管，试管，移液管，盖玻片，滴管，香柏油等。

3、试剂：2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液（含有0.01%的次甲基蓝）、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.2%的TTC溶液、0.1%台盼兰溶液、詹纳斯绿B溶液、Ringer溶液。

四、实验步骤

1、美兰染色法步骤

（1）配制不同生长状态的酵母样品，用蒸馏水调整细胞总数在(30-60)×106个/ml。

（2）染色液与酵母样品液等量混合，染色5min。

（3）用血球计数板做水封片，显微镜下计数染色细胞与总细胞数。重复3次。

（4）细胞活性=活细胞数/总细胞数×100%

2、台盼兰染色步骤：

晃动悬浮培养物，稍静置，吸取上层悬浮液，在倒置显微镜下观察细胞，用缓冲液调到合适观察的细胞密度，加入几滴0.1％台盼兰溶液，用滴管混合均匀，5分钟后显微镜下观察，计数100个细胞的染色情况，重复3次，计算存活率。

3、TTC染色步骤：

（1）吸取振荡或静置培养的培养物8mL，以1000转/分离心10分钟。

（2）小心吸去上清液，加入0.4%的TTC溶液5mL混匀，30℃下染色1小时。

（3）在显微镜下观察细胞染色情况，比较两种培养物染色差异。

4、詹纳斯绿B染色步骤：

（1）吸取振荡或静置培养的培养物8mL，以1000转/分离心10分钟。

（2）小心吸去上清液，加入少量詹纳斯绿B 溶液混匀，30℃下染色30分钟。

（3）在显微镜下观察细胞染色情况，油镜下观察线粒体。比较两种培养物染色差异。

五、实验结果

1、美兰和台盼兰染色方法细胞存活观察

2、振荡培养酵母TTC 和詹纳斯绿B 的细胞染色观察

六、作业与思考

1、美兰和台盼兰染色方法所得存活率差异原因探讨。

TTC 染色法

詹纳斯绿B 染色法

对于美兰染色，死细胞内的还原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色；对于台盼兰染色，死细胞的细胞膜丧失活性或结构被破坏，胞膜的通透性增加，可被台盼兰染成蓝色。然而，在美兰染色中，可能存在部分活细胞由于还原酶活性相对较低，而不能完全脱色，因此会造成判定细胞死亡的假象，故美兰染色的细胞存活率较台盼兰染色的偏低。

2、酵母TTC和詹纳斯绿B染色差异的原因是什么？

对于TTC染色，在细胞的线粒体中四氮唑从电子传递链上接受电子形成三苯基甲腙，其为脂溶性物质，形成后随即插入线粒体等膜中或脂滴中，变成红色。

对于詹纳斯绿B染色，由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色。