菌种鉴定方法
抗酸染色法
抗酸染色法ａciｄ－fａst stainiｎg ｍethoｄ１882年由埃利希(F、Ehｒｌich)首创并经F、齐尔(Ziehｌ）改进而创造出得细菌染色法。
简介
其中最具代表性得为对结核菌得齐尔-尼尔森(Ｚiehl－Neeｌsen)染色法与齐尔－加贝
特(Ｚiｅｈl－Gａbbeｔ)染色法。用石炭酸复红染色后,用盐酸乙醇分色,再用美蓝进行对
比染色,即不再脱色而呈现石炭酸复红得红色。
抗酸染色得原理
分枝杆菌得细胞壁内含有大量得脂质,包围在肽聚糖得外面,所以分枝杆菌一般不易着色,
要经过加热与延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中得分枝菌酸与染料结合后,就
很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。
齐-尼氏抗酸染色法就是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用
盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后,分枝杆菌仍然为红色,而其她细菌及背
景中得物质为蓝色。
抗酸染色一般步骤
用玻片夹夹持涂片标本,滴加石炭酸复红2-3滴,在火焰高处徐徐加热,切勿沸腾,出现蒸汽即暂时离开,若染液蒸发减少,应再加染液,以免干涸,加热3-5分钟,待标本冷却后用水冲洗。
3%盐酸酒精脱色30秒～1分钟；用水冲洗。
用碱性美兰溶液复染1分钟,水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。
抗酸染色得染液配制
1、石炭酸复红
碱性复红酒精饱与溶液10mＬ5%石炭酸90ｍL
2、３%盐酸酒精
浓盐酸３mL
95％酒精9７mL
3、吕氏美兰液
美兰酒精饱与液3０mL
氢氧化钾(１:10００
0) 100mL
细菌鞭毛染色得方法
目前,细菌鞭毛染色方法根据染色剂得不同,可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法与荧光蛋白染色法６类,前5类方法得媒染剂成分中均含有单宁酸,染色原理通常就是采用不稳定得胶体溶液做媒染剂,并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛肿胀(ｔaranｄfeaｔher)”,鞭毛直径加粗,进一
步染色后即可在油镜下观察。??
1、碱性复红法与副品红法
1９26年由Graｙ首创，其媒染液成分包括2０%丹宁酸水溶液2、0mｌ,硫酸钾铝饱与水溶液5ｍl,饱与氯化汞水溶液2ml,３%碱性复红乙醇(９５%)溶液0、4ｍｌ,临用前混合,且需过滤后方可使用。染片时,媒染剂染色约６ｍiｎ,具体时间尚需在试验中摸索确定,染色液就是抗酸染色Ziehl-Nｅeｌsen石碳酸复红染液,染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上,染色３min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Ｌeifsｏｎ于１９30年建立了副品红法，并于1938年与1951年两次对该方法进行了改良,称为Leifson方法。染色试剂由３种溶液组成:A为１、5%NaCl水溶液，Ｂ为3％单宁酸水溶液，Ｃ为乙酸副品红０、9g,碱性副品红0、3ｇ溶解于１０0mｌ95%乙醇溶液中。使用时把等体积A与B混合,然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1～２个月。
２、结晶紫法,又称Ryu法
１937年由Ryu建立,198２年由Kｏdaka等进行了改良。媒染剂:５%石碳酸10m ｌ,2g单宁酸与10 ml饱与硫酸钾铝。染色剂:饱与结晶紫乙醇溶液,即12ｇ结晶紫溶于100mｌ无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合,染色5mi ｎ。19８9年,Heｉmｂroｏｋ等使用改良得Ryu染色试剂,采用湿片技术进行鞭毛染色,虽然可以观察到细菌鞭毛,但效果不好。Ryｕ染色方法优点就是试剂比较稳定，目前Diｆｃo公司已经研制出该方法得商品试剂盒,但染色效果亦不甚理想、
1990年由Ｉnｏue等报道日本制药株式会社ShioｎogiSe ３、维多利亚蓝B法?
ｉyａku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸与硫酸钾铝,染色约需7min。该试剂保存期约为6个月,关于其染色效果虽然有过一篇文献评述，但却没有采用评分法进行评价,很难判断其染色效果。?
4、镀银染色法
195８年Rhｏdｅｓ根据Foｎｔana得螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂与银染剂。媒染液:１0%单宁酸１0ml加5 ml 饱与硫酸钾铝水溶液,再加1 ml苯胺饱与水溶液形成沉淀，通过摇动又能重新溶解,加入5％FｅCl3水溶液1ml形成黑色溶液,稳定10 mｉn后使用。银染液:配制５％AgNｏ3水溶液１００ mｌ取出10ml备用,再缓慢加入浓氨水(比重0、880)使形成得沉淀刚好重新溶解,最后把备用得10ｍlＡgNo3溶液向其中逐滴加入,直到摇动后呈现轻微而稳定得薄雾状溶液为止，避光保存，可稳定数周。用媒染液染片3~５ｍin,蒸馏水充分洗涤后，再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾，染色3~５mｉn。
由于Ｒhｏdes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁,所以1965年Ｂｌeｎｄen 等改良了细菌鞭毛镀银染色法得配方。试剂Ａ:10０mｌ蒸馏水中加入5 ｇ单宁酸，1、5 gFeCl3,15％福尔马林2 ｍl,1%ＮaＯH溶液１ml。试剂B：使用2％AgNo3,其她同于Ｒhodes,但试剂不稳定,要求在４h内使用，并用要用氨水调pH 至10。试剂Ａ染片2~4miｎ，试剂B染色30s,不需加热。
由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物，并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片,未采用评分法评价镀银染色方法。因此19７7年,Ｗｅst等对镀银染色法进一步改良,制备涂片时直接使用血平板,评价染色效果首次使用5分制,通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。试剂配方:媒染液为饱与硫酸钾铝水溶液25ml,10%单宁酸50 ml,5%FeＣｌ3水溶液5ml,5℃保存,染色液配制同Rhodes，但需避光５℃保存。媒染液染片4mｉn,银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽，染色4ｍiｎ。同时Ｗeｓt等还对使用不同培养基进行染色效果评价,包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA(ｔrypｔｉcaｓesoｙagar)斜面,其中半固体动力培养基与TSA斜面25℃，培养1８～24h；血琼脂平板35～３7℃,培养18~2４h。评价结果血琼脂平板35~37℃,培养18~24h不适于细菌鞭毛染色,而半固体动力培养基与TＳA斜面２５℃,培养18～24ｈ适合于细菌鞭毛染色,同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。?由于镀银染色法媒染液不稳定,需避光5℃保存，１９92年Pｏrter等继续改良该方法,其试剂配方同West等得方法,只就是媒染剂避光室温可保存数月，延长媒染剂染色时间为8min，染色液不需加热,只染３0ｓ,制备涂片程序略有不同。使用TSA平板,３6℃培养24h,但遗憾得就是Ｐoｒter等只使用了1种细菌（奇异变形杆菌)进行研究。
于就是199４年Ｆinegan等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果,并使用4种细菌(绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌）,用trypitｃasｅsoy肉汤及其琼脂平板，26℃培养24h。试剂配方仍不变,媒染液放置1、2、４、８、16周后进行染色,媒染液染色8min,银染液染色30～60 s,不需加热。这4种细菌均染色成功,从而证明媒染液可至少放置16周。
?5、鞭毛得负染
具体操作:菌悬液,直接滴在铜网上，1-2分钟后,吸去多余得菌液(似干非干得程度)，再滴上0、１%得磷钨酸溶液,1分钟后,吸去多余得染液，然后就可以在电镜下观察了。一般染色后十五天之内瞧电镜。时间太长效果不好。这就是我试验用得方法。
?曾做过一段时间得细菌鉴定,以下就是一些染色心得:?首先染色用玻片一定
要干净,洗液泡过之后蒸馏水冲洗干净。涂片得时候菌千万别涂得太多。第一部染色时,可将玻片置于水浴锅内,温度保持在35度,盖上盖(主要就是保持一定得湿度，防止染色液变干不利于冲洗,这步非常有用）。一定要将第一步使用得媒染液冲洗干净,否则影响染色效果,背景可能非常脏。其她得步骤参考书上得资料进行,一般没什么问题。我用这种方法染单鞭毛得弧菌,效果非常好。