猪血清免疫球蛋白的提取纯化
血清免疫球蛋白的提取纯化
一、试剂
饱和硫酸铵pH 7.1
纯水（电阻率>106Ω）经121℃15min灭菌
0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PB）pH 7.2
二、方法与步骤
1. 血清10ml经10000 rpm离心10min 去除沉淀，上清加10ml纯水2倍比稀释。
2. 20%饱和硫酸铵（SAS）沉淀：向20ml血清稀释液内缓慢滴加冰冷的硫酸铵5ml，
边滴加边混匀，则液体的硫酸铵终浓度为20%饱和度。室温静置2小时。
3. 4000rpm 离心10min ，去除沉淀，上清滴加SAS 3.57ml ——则SAS终浓度30%饱
和度。4℃静置过夜。
4. 5000rpm 离心10min ，分离沉淀和上清。沉淀重悬于4ml p.w 成4.5ml溶液。在磁
力搅拌的条件下滴加SAS 1.9ml 至终浓度30%饱和度。继续磁力搅拌30min（压加冰杯冷却）。4℃反应2hrs。4000rpm离心10min，沉淀重悬于4ml p.w 成4.5ml溶液，滴加SAS 3ml 至终浓度40%饱和度，4℃保存备用。
三、硫酸铵饱和度的计算
y——表示滴加饱和硫酸铵的毫升数（ml）
Ｂ——表示要求达到的硫酸铵饱和度
A ——表示原溶液的硫酸铵饱和度
V ——表示原溶液的体积（ml）
体液免疫球蛋白测定
体液免疫球蛋白测定 第一节血清IgG、IgA、IgM测定 血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM定量测定方法一般有单向环状免疫扩散法、火箭免疫电泳法、ELlSA、免疫比浊法、放射免疫分析法等。临床常用单向环状免疫扩散法和免疫比浊法来测定血清免疫球蛋白含量。 一、血清IgG、IgA、lgM测定 （一）单向环状免疫扩散法 该法的原理是将抗血清均匀地分散于琼脂或琼脂糖凝胶内，胶板上打孔，孔内注入抗原或待测血清，抗原在含有抗血清的胶内呈放射状（环状）扩散，在抗原抗体达到一定比例时形成可见的沉淀环。在一定条件下，抗原含量越高，沉淀环越大。 （二）免疫比浊法 该法具有检测范围宽、测定结果准确、精密度高、检测时间短（一般在几分钟内即可完成测试）、敏感度高、稳定性好等优点。 二、血清IgG、IgA、IgM测定的临床意义 （一）年龄 新生儿可由母体获得通过胎盘转移来的IgG，故血液中含量较高，接近成人水平。 （二）免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均升高 慢性肝脏疾病如慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、隐匿性肝硬化患者血清中可见3种Ig均升高。慢性细菌感染如慢性支气管炎、肺结核，血IgG可升高。宫内感染时脐血或出生后的新生儿血清中IgM含量可增高。SLE患者以IgG、IgA升高较多见。类风湿关节炎患者以IgM增高为主。 （三）单一免疫球蛋白升高 主要是指患者血清中某一类免疫球蛋白含量显著增多，大多在30g／L以上，这种异常增多的免疫球蛋白其理化性质十分一致，称为单克隆蛋白（MP）即M蛋白。此类异常增多的免疫球蛋白多无免疫活性，故又称副蛋白。由它所致的疾病称为免疫增殖病如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等。 （四）免疫球蛋白降低 先天性低Ig血症，主要见于体液免疫缺陷病和联合免疫缺陷病。IgA缺乏患者，易发生反复呼吸道感染。IgG缺乏患者，易发生化脓性感染。IgM缺乏患者，易发生革兰阴性细菌败血症。 第二节血清IgD和IgE测定 正常人血清中IgD含量很低，仅占血清免疫球蛋白总量的0.2%。膜结合型IgD（mIgD）构成BCR，是B 细胞分化发育成熟的标志。未成熟的B细胞仅表达mIgM，成熟B细胞可同时表达mIgM和mIgD。活化的B 细胞或记忆B细胞其表面的mIgD逐渐消失。 IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋白，要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌。其重要特征为糖含量高达12%。IgE为亲细胞抗体，可引起Ⅰ型超敏反应。IgE可能与机体抗寄生虫免疫有关。 第1页
抗体纯化
一、抗体纯化部分 1、腹水/血清的亚型测定完成后，IgG亚型的腹水/血清使用Protein G 抗体纯化柱纯化；IgM 亚型的腹水/血清则使用饱和硫酸铵沉淀法沉淀。 1.1 Protein G 抗体纯化步骤： （1）新柱子先用DDW 5ml过柱； （2）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （3）抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上； （4）继续10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （5）5倍柱体积甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入Tris-HCI(pH 9.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性； （6）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （7）5倍柱体积20%乙醇溶液过柱，于4℃条件下保存纯化小柱； （8）将洗脱的抗体用聚乙二醇浓缩并透析，以彻底去除不相干离子。 其中所用试剂配方： DDW：超纯水 Binding Buffer（100ml）：A液，0.2M磷酸氢二钠61ml B液，0.2M磷酸二氢钠39ml 磷酸氢二钠4.37g 磷酸二氢钠1.22g 甘氨酸-盐酸缓冲液：0.1M甘氨酸溶液加浓盐酸调pH 2.7 Tris-HCL缓冲液：1M Tris溶液加浓盐酸调pH 9.0 1.2 饱和硫酸铵沉淀法步骤： （1）配制饱和硫酸铵溶液，再用氨水调节pH至8.5 （2）沉淀：a、腹水/血清离心去除细胞碎片，保留上清液并测定体积； b、边搅拌边逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀； c、上述蛋白质溶液经过离心弃上清取沉淀，并用PBS溶液（pH 7.0）溶解； d、继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋 白充分沉淀； e、继续离心沉淀弃上清去沉淀，用PBS溶液（pH 7.0）溶解； （3）透析：每隔3-6小时换一次透析液，以彻底去除硫酸铵。 其中所用试剂配方： PBS缓冲液（1L pH 7.0）：氯化钾0.2g 磷酸二氢钾0.2g 磷酸氢二钠3.35g 氯化钠8g
抗原或抗体的检测
抗原或抗体的检测
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抗原或抗体的检测 一、检测的原理 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。 1．抗原与抗体的亲和力（afｆiｎitｙ)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应,而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型,造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同,抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。此外，反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响,抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。 2．抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点,对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简单,即用已知的抗体和待检样品混合,经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生,就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生,则说明样品中无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。 对抗原或抗体进行定量检测时,以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。 （1）根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原（或抗体）的含量:在一定的反应条件下,加入的已知抗体(或抗原)的浓度一定,反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原(或抗体)量成正比。也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原(或抗体）的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。 (2)抗原或抗体效价滴定的原理:当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作中,把浓度低的反应成分（抗原或抗体)的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔,比较3只家兔产生抗体的多少,即滴定3只兔血清抗体效价,可用双向琼脂扩散法来滴定,例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度,分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度(如甲兔的抗体效价为1/２０00，而丙免的是1/８00０则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高）。也就是表示效价的稀释度越高,样品中所含待检成分越多。因人血清(抗原)和抗体（免疫兔血清）相比，浓度高，故应稀释抗原。 二、抗原或抗体检测的实用意义 １．抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功能的指标。抗体用于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的抗病原生物的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLＡ抗原的抗体、血型抗体及各种自身抗体,对有关疾病的诊断有重要意义。 ２．抗原检测的意义可做为抗原进行检测的物质可分为以下四类: （1)各种微生物及其大分子产物:用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定以及对菌苗、疫苗的研究。 （２）生物体内各种大分子物质：包括各种血清蛋白(如各类免疫球蛋白、补体的各种成分)、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为抗原进行检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要意义。 （3）人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原(如CD抗原)、同种异型
那个免疫球蛋白是从人的血液的提取出来的
那个免疫球蛋白是从人的血液的提取出来的 如果那个人的血是有病毒的话不一定可以百分百的杀死 那个人的病毒就会跑到BB那里去 比如艾滋，梅毒，常见是丙肝 真的要验血检查过是缺乏免疫球蛋白的才打 国内是很流行打这些的，我们这边从来不打，除非真的是缺乏免疫球蛋白的BB才会建议打BB又是母乳喂养的，应该不会缺乏的啦 过了4岁就不会经常病的了 以前我们小时候也是经常病啊，所以不用太担心 以上是妹妹咨询她们医院的医生说的，以下是百度了一下的 球蛋白的种类球蛋白有两种：丙种球蛋白和胎盘球蛋白。丙种球蛋白是从健康人的血液中提取的。丙种球蛋白又称抗体，是健康人在和疾病作斗争的过程中产生的。胎盘球蛋白是从健康产妇的胎盘中提取制成的，其主要成分是丙种球蛋白。球蛋白可以增强人体抵抗疾病的能力，属于人工被动免疫制剂。球蛋白不能代替预防接种有些家长迷信球蛋白，把它看成是万能预防针，常常要求医生给孩子打球蛋白针。这种做法是不对的，球蛋白虽然有一定的抗病能力，但绝不是万能药。通常人体在注射球蛋白后3-4周，体内保持一定浓度的抗体，可以预防有关的疾病，以后抗体含量逐渐减少以致消失，就没有防病作用了。而且它只能对麻疹、脊髓灰质炎、肝炎等有一定效果。由此可见，球蛋白的抗病时间是比较短的，适用的疾病范围也是有限的，它不能长时间对各种传染病都有效，不能代替预防接种。为了预防传染病还是应该按免疫程序接种各种疫苗。使用球蛋白的时间要恰当使用球蛋白制剂，应选择恰当的时间，过早过晚都不起作用。如孩子接触了麻疹病人，应在一周内注射球蛋白制剂才有保护作用，注射晚了仍然可能发病；如在接触病人前2个月注射的球蛋白，因为抗体已经消失，则不可能起到防病的作用。/
NDV抗血清制备及抗体效价测定
NDV抗血清制备及抗体效价测定 【实验目的】 1. 学习抗血清制备的基本原理，掌握兔和小鼠免疫注射方法、兔颈动脉放血、小鼠眼球采 血技术。 2. 学习双向琼脂扩散实验的基本原理，掌握的基本程序和结果判读方法。 3. 学习酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理，掌握间接ELISA的基本程序和结果判读 方法。 4. 学习免疫印迹实验的基本原理，掌握免疫印迹记实验的的基本程序和结果判读方法。 PartⅠ. NDV抗血清制备 一、实验原理 将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。 本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。 二、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器
免疫球蛋白的结构
第一节免疫球蛋白的结构（The Structure of Immunoglobulin) B淋巴细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞，产生能与相应抗原发生特异性结合的免疫蛋白，这类免疫球蛋白被称为抗体（antibody, Ab）。 1937年，Tiselius用电泳方法将血清蛋白分为白蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白等组分，其后又证明抗体的活性部分是在γ球蛋白部分。因此，相当长一段时间内，抗体又被称为γ球蛋白（丙种球蛋白）。 实际上，抗体的活性除γ球蛋白外，还存在于α和β球蛋白处。1968年和1972年的两次国际会议上，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。 Ig是化学结构的概念，它包括正常的抗体球蛋白和一些未证实抗体活性的免疫球蛋白，如骨髓瘤病人血清中的M蛋白及尿中的本周氏（Bence Jones, BJ）蛋白等。 免疫球蛋白可分为分泌型（secreted Ig,SIg）和膜型（membrane Ig, mIg）。前者主要存在于血清及其他体液或外分泌液中，具有抗体的各种功能；后者是B细胞表面的抗原识别受体。 ☆☆相关素材☆☆ 图片正常人血清电泳分离图 一免疫球蛋白的基本结构 The basical structure of immunoglobulin 免疫球蛋白分子是由两条相同的重链（heavy chain，H链）和两条相同的轻链（light chain，L链）通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。 X射线晶体结构分析发现，IgG分子由3个相同大小的节段组成，位于上端的两个臂由易弯曲的铰链区（hinge region）连接到主干上形成一个"Y"形分子，称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本单位。
血清学检测意义 1
猪血清学检测的意义及注意事项（一）抗体的检测 姜杰 QQ:3157394188 血清学检测分析作为从猪体和猪场取得信息的一个有效途径正变得越来越重要并日趋广泛，临床兽医或养殖场主在养猪生产中，对于血清学检测结果进行正确地分析和判断，非常有助于我们获取有效的信息并依此做出正确的决策以及改进。 血清学检测，通常是指在体外进行的抗原抗体反应，其基本原理就是利用抗原可与相应的抗体特异性结合的特性，利用已知的抗原来检查血清中是否含有相应的抗体，或者利用已知的抗体来捕捉相应抗原的血清学方法。 血清学检测作为解决猪病所必需的工具已经得到了广泛认可，但大多数的养殖场对血清学的检测目的、检测结果分析和判断存在一定的认识误区。现将检测意义和注意事项及其实际应用介绍如下： 1.免疫评估 监测疫苗接种方案的效果：应用血清学检测方法来评估畜群免疫后的抗体水平，从而判定选用的疫苗是否质量可靠、免疫方式是否确凿有效、免疫程序是否合理。 预测接种时间：在临床上，恰当的免疫接种时间往往是有效免疫的关键，目前，大家都能够认识到，在使用疫苗尤其是活苗的时候，一定要考虑在母源抗体(MDA)的影响，最可靠和可行的方法就是通过血清
学检测方法来测定母源抗体的消长，确定首免最佳时机并为以后的免疫打好坚实的基础。 例如：A场猪瘟抗体结果如下： 结果OD值 日龄10日龄 15头 15日龄 15头 20日龄 15头 25日龄 15头 2.599 1.87 1.350.971 2.5560.7380.4060.39 1.0670.8050.529 1.082 1.1360.7380.5010.294 2.061 2.1070.7470.453 2.0110.9830.4180.421 1.261 1.2360.3040.356 2.6370.8380.3850.438 2.7580.9930.4220.408 1.991 2.7640.5510.317 1.414 1.8360.4260.305 1.946 1.4150.3760.710 1.712 1.5380.2790.392 1.59 1.1850.4910.557 1.587 1.3080.7310.386 平均值 1.89 1.357 0.528 0.499 （表一） 分析：由上表可以看出10-25日龄平均值分别为1.89,1.357,0.528,0.499抗体水平依次下降 由表一可以看出适合防疫日龄20天 下面就需要检测的内容简要说明如下： 1.仔猪：15,20,30日龄检测猪瘟抗体 30,45,50日龄检测伪狂犬抗体 ,口蹄疫抗体， 60.90 日龄检测口蹄疫抗体
辛酸—硫酸铵沉淀法提取免疫球蛋白G
辛酸—硫酸铵沉淀法提取免疫球蛋白G 一、实验目的： 1、了解蛋白质纯化的基本技术； 2、学习辛酸—硫酸铵法纯化抗体的方法。 二、实验原理： 根据免疫球蛋白的性质利用生物化学各种纯化方法进行抗体的纯化，主要有常规生物化学和特异性亲和层析两类方法。本实验采用辛酸—硫酸铵沉淀法从动物血清中纯化抗体，纯度和回收率较高，且抗体活性不被破坏；同时此方法操作简便、周期短、成本低、不需要复杂的仪器设备，不仅使用于小量抗体的纯化，也适合大批量抗体的制备。 三、实验材料试剂和器材： 1、实验材料：兔血清。 2、试剂：乙酸-乙酸钠缓冲液、10×磷酸盐-NaCl缓冲液、透析液、5 mol/LNaOH、0.1mol/L NaOH。 3、器材：电磁搅拌器、离心机、透析袋。 四、操作方法： 1、动物血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，0.1mol/L NaOH调整血清稀释液pH至4.5。 2、室温下用电磁搅拌器边搅拌边缓慢滴加辛酸（加入量为1L血清稀释液加25ml），滴加完 后继续搅拌30min。 3、离心（10000转/分，20分钟）,收集上清液，弃去沉淀，上清液用滤纸过滤除去悬浮物， 量体积。 4、按照10%体积加入10×磷酸盐-NaCl缓冲液，用5 mol/LNaOH调pH至7.4。 5、上清液4℃预冷10min，测量溶液总体积，在4℃按277g/L缓慢加入硫酸铵粉末（终浓 度达到45%饱和度），边加边搅拌，加完后继续搅拌30min。 6、离心（5000转/分，15分钟）,弃去上清液，收集沉淀。 7、沉淀用少量透析液溶解（一般为原血清体积的1/10），透析并更换两次透析液。 8、透析后的抗体溶液在50～55℃水浴中加热20min，离心（5000转/分，20分钟）,上清液于-20℃保存。
实验室血清学常用检测方法
常用血清学检测方法介绍 一、酶联免疫吸附试验诊断技术 目前，该项技术已在兽医学上得到广泛的应用，大多数动物传染病都已经研制成ELISA检测方法。 1、酶联免疫吸附试验的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 2、ELISA的类型 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于动物疫病检测的ELISA主要有以下几种类型： ①.双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质、微生物病原体第二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如猪瘟病毒检测ELISA、禽流感病毒抗原捕获ELISA，就是根据这种原理设计的。 ②.双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。乙肝HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于于间接法。此外，该方法不受被检动物种属差异的限制。
免疫球蛋白的提取方法
免疫球蛋白的提取方法 根据猪血中含有的各种蛋白质的分子大小、电荷多少、溶解度以及免疫学特征等,从血液中提取免疫球蛋白,常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。 免疫球蛋白的提取盐析法盐析法是分离蛋白质的重要方法之一,是利用抗体与杂质之间对盐浓度敏感程度的差异性进行的。选择一定浓度范围的盐溶液使部分杂质呈“盐析”状态,抗体成分呈“盐溶”溶解状态。离心去除盐析沉淀状态的杂蛋白,得到的上清液再选择一定浓度范围的盐溶液使抗体成分呈盐析状态,离心得到的沉淀物即为纯化的目标抗体。目前常用的盐析法有饱和硫酸铵分步盐析法、辛酸沉淀法、氯化铁沉淀法、多聚磷酸盐盐析法等。饱和硫酸铵分步盐析硫酸铵是盐析法最常用的无机盐,主要原因是它溶解度大,随温度变化小,对蛋白质有保护作用,高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性,价格也不贵。 免疫球蛋白的饱和硫酸铵分步盐析法操作简单,对设备和操作条件要求不高,便于工业化生产。其具体步骤为:取一定量血浆,加生理盐水稀释,边搅拌边缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度20%,4℃静置1h,4000r/min离心10min,弃沉淀,上清液中继续加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度50%,浓氨水调pH值至7.0,4℃静置2h,4000r/min离心20m弃上清,将沉淀溶于生理盐水,超滤除盐浓缩,滤液中无S2- 4为止,即得IgG粗提物。 免疫球蛋白的辛酸沉淀法辛酸沉淀法提取IgG时,对设备和操作条件要求较高,在离心时,转速为10000 r/min,普通离心机达不到要求。在调节溶液pH值时,要控制得当,pH值稍低或稍高对IgG的得率和纯度都有很大影响,这些都限制了它的广泛应用。其具体步骤为:取一定量0.1mol调pH值至4.5;室温下边搅拌边缓慢加入辛酸(按辛酸25 μl/mL血清混合液添加),继续搅拌30min 后,10000r/min离心30min,弃沉淀,留上清液,上清液用多层纱布过滤,留滤液,然后将滤液装入透析袋中析48h,每8～10h换一次透析液,最后超滤浓缩即得1gG粗提液。 免疫球蛋白的氯化铁沉淀法氯化铁沉淀法的原理是据蛋白质分子与金属离子反应形成盐复合物的形式和种类的不同,达到分离不同蛋白质的目的。其具体步为:取一定量的血浆(加抗凝剂),用生理盐水稀释后,边搅拌边缓加入三氯化铁溶液,调pH值至4.5,搅拌混,40℃水浴保温60min后,4000r/min离心15min,弃去沉淀,上清液调pH值至9.0,常温静置2h,离心去沉淀过滤,上清液经超滤浓缩即得IgG粗提。 免疫球蛋白多聚磷酸盐盐析法多聚磷酸盐作为一种食品添加剂,常被添加在肉制品中以提高产品的保水性或者作为絮凝剂在食品加工中使用。多聚磷酸盐作为沉淀剂具有安全和高效的特点,是解决猪血清IgG大规模分离制备有效途径之一,但目前尚未有深入系统的研究。其具体步骤为:取一定量的血清加入相应量的多聚磷酸盐溶液,以0.1mol/L盐酸调至所需pH值,在一定温度水浴中保温反应一段时间后,取出8000r/min离心10min,弃沉淀,收集上清液,即为IgG粗提液。 免疫球蛋白的有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法广泛用于生产蛋白质制剂,常用的试剂是丙酮和乙醇等,其中以乙醇最为常用。目前,国际上常用冷乙醇法有两种,一种是美国等国主要使用的Cohn-Oncley法,另一种是西欧等国主要使用的Kistler和Nitschmann法。冷乙醇分离法是WHO规程和中国生物制品规程推荐用的方法,不仅分离物质多,可同时分离多种血浆成分,分辨率高,提纯效果好,而
血清免疫球蛋白测定(一)
血清免疫球蛋白测定(一) B-淋巴细胞受抗原刺激后，引起一系列细胞形态与生化特性变化，转化为淋巴母细胞并增生繁殖，最后演化为浆细胞，合成免疫球蛋白。免疫球蛋白普遍存在于生物体的血液、体液、外分泌液及某些细胞（如淋巴细胞）的细胞膜上。免疫球蛋白是一组具有抗体特性的球蛋白，其分子量很大，含有1000个以上的氨基酸分子，均由其共同抗原的两个相同的轻链（L链）和具有特异性抗原的两个不同的重链（H链）组成。 1分类 根据重链的氨基酸组成不同，免疫球蛋白可分为分五类：免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。 1.1IgG IgG是人体的主要免疫球蛋白，也是唯一能通达胎盘的免疫球蛋白。根据IgG的重链氨基酸顺序的差别，可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4各亚类。IgG是主要抗感染抗体，对各种细菌、病毒有抗体活性，并有激活补体的作用。 1.2IgA IgA是分泌液中主要抗体，可分为IgA1和IgA2两个亚类。存在于血清中的称血清型IgA，存在于泪液、乳汁、胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道分泌液中的称分泌型IgA，对局部粘膜有抗菌和抗病毒作用。 1.3IgM IgM可分为IgM1和IgM2两个亚类。是抗原刺激最先产生的免疫球蛋白，有较强的固定补体、溶解细菌及细胞的能力。IgM是抗革兰氏阴性菌和异体红细胞的主要抗体，也是存在于B淋巴细胞表面的主要免疫球蛋白。 1.4IgD 其作用与过敏反应有关。据报道，IgD可对某些抗原起反应，如青霉素、胰岛素、核抗原、甲状腺抗原等。它存在于B淋巴细胞表面，构成早期的膜受体，具有识别抗原，制动B淋巴细胞的分化作用。 1.5IgE 与I型变态反应有关，具有亲细胞特性。IgE通过Fc段与肥大细胞、嗜碱粒细胞上的Fc受体结合，故属亲同种细胞性抗体。当机体再次接触同种抗原后，过敏原即与结合在细胞表面的IgE作用，使细胞释放介质，引起平滑肌痉挛，血管通透性增加等过敏反应，还具有抗寄生虫感染作用。 2正常参考值 IgG：8～16g/L，IgA：1～4g/L，IgM：0.5～1.9g/L，IgD：0.01～0.4g/L，IgE：0.001～0.009g/L。3临床意义 3.1血清免疫球蛋白降低 血清免疫球蛋白水平取决于免疫球蛋白合成和分解代谢的速率以及由体内丢失的程度。血清免疫球蛋白降低可由于合成不足，丢失增多和分解加快引起。合成不足：血清免疫球蛋白降低可由于原发性或继发性合成缺陷所致。原发性免疫缺陷病有性联先天性丙种球蛋白缺乏症、婴儿暂时性丙种球蛋白低下症、伴IgM升高的性联低丙种球蛋白血症、选择性IgA缺乏症、选择性IgM缺乏症、选择性IgG亚类缺乏症等。继发性免疫缺陷病有慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症和恶性肿瘤等。丢失增多：从胃肠道丢失的见于溃疡性结肠炎、消化道癌肿、吸收不良综合征、淋巴瘤、肠淋巴管扩张症。从皮肤丢失的有急性灼伤、特异反应性皮炎。从浆膜腔丢失的有胸膜炎、腹膜炎、反复抽胸腹水。从肾脏丢失的有肾小球肾炎（微小病变型、膜性、增殖性）、肾静脉血栓形成、SLE和淋巴瘤。主要是由于蛋白从尿中丢失或毒素抑制免疫球蛋白合成，后者首先影响IgM，其次影响IgA，然后再影响IgG。分
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定
I 血液及组织样品的制备 分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。 一、血液样品 (一）采血 测定用的血液，多由静脉采集。一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。 (二）血清、全血及血浆的制备 1.血清的制备 血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。 2.全血及血浆的制备 取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。将已抗凝的全二于2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。 3.抗凝剂 凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。 （1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。每毫升血液用1-2mg 即可。 配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃烘箱烤干（若超过150 ℃则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。可抗凝血液5ml 。 此抗凝血，常用于非蛋白氮等多种测定项目，但不适用于钾、钙的测定。对乳酸脱氯酸性磷酸酶和淀粉酶具有抑制作用，使用时应注意。 ( 2）草酸钾-氟化钠氟化钠是一种弱抗凝剂。但浓度2mg / ml 时能抑制血液内葡萄糖的分解，因此在测定血糖时常与草酸钾混合使用。 配制方法：草酸钾6g、氟化钠3g，溶于100ml 蒸馏水中。每个试管加入0.25ml，于80℃烘干备用。每管含混合剂22. 5mg，可抗凝5ml 血液。 此抗凝血，因氟化钠抑制睬酶，所以不能用于脉酶法的尿素氮测定；也不能用于淀粉酶及磷酸酶的测定。 (3）乙二胺四乙酸二钠盐（简称EDTANa2 ) EDTANa2 易与钙离子络合而使血液不凝。 有效浓度为0.5mg 可抗凝lml 血液。 配制方法：配成4 % EDTANa ：水溶液。每管装0.lml , 80 ℃烘干，可抗凝5ml 血液。此抗凝血液适用于多种生化分析。但不能用于血浆中含氮物质、钙及钠的测定。
血清胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体检测的临床意义
血清胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体检测的临床意义摘要：目的分析血清胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体检测的临床意义。方法选取2013年7月～2015年7月本院收治的2型糖尿病患者68例为观察组对象，另取同期在本院接受体检的非糖尿病患者群92 例为正常对照组。测定两组对象的血清胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体存在情况，进一步检测观察组患者的糖化血红蛋白（HbA1c）、胆固醇（TC）、空腹C肽、餐后2hC肽水平，计算体质指数（BMI）。结果观察组患者的胰岛细胞抗体阳性率及胰岛自身抗体阳性率均明显高于正常对照组（P<0.05）；自身抗体阳性组患者的HbA1c水平高于抗体阴性组，TC、BMI、空腹C 肽、餐后2hC肽水平低于抗体阴性组（P<0.05）。结论胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体检测对筛查隐匿性自身免疫糖尿病（LADA）具有重要指导价值，多项指标联合检测有助于早期诊断和治疗LADA。 关键词：胰岛细胞抗体；胰岛素自身抗体；血糖水平 成人隐匿性自身免疫糖尿病（latent autoimmune diabetes of adult，LADA）早期临床表现和2型糖尿病类似，故临床中漏诊及误诊率均较高。LADA的胰岛功能衰退速度大幅高于2型糖尿病患者，若不能准确
诊断而按照常规2型糖尿病治疗方法进行诊治，将无法有效逆转病情进展[1]。LADA患者体内存在特异性胰岛相关抗体，是其筛查的金标准，本次研究主要分析血清胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体检测的临床意义。 1 资料和方法 1.1一般资料选取2013年7月～2015年7月本院收治的2型糖尿病患者68例为观察组对象，其中男38例，女30例；年龄46～72岁，平均（6 2.17±7.11）岁；病程3～12年，平均（7.81±0.96）年。另取同期在本院接受体检的非糖尿病患者群92例为正常对照组，其中男50例，女42例；年龄48～70岁，平均（60.27±8.92）岁。两组患者在性别、年龄等资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 1.2方法采集所有入组患者的空腹肘静脉血3ml，37℃下静置30min，3000r/min离心10min，分离血清后置于-20℃冰箱内备用。采用化学发光免疫分析法（CLIA）测定入组对象的胰岛细胞抗体（ICA），采用放射免疫分析法（RIA）测定胰岛素自身抗体（IAA）及C肽水平。所有操作步骤都严格按照说明书进行。以上抗体检测完成后，进一步采用全自动生化分析仪测定观察组患者的总胆固醇（TC）、糖化血红蛋白
早期肺癌的血清七种自身抗体检测.docx
早期肺癌的血清七种自身抗体检测 肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，因早期没 有明显的临床特征，肺癌早期发现、早期诊断非常困难， 85% 的肺癌患者确诊时已是晚期，失去手术治愈的机会，大大影 响了肺癌患者的生存， 5 年生存率只有 16% 。血清肿瘤自身抗体谱检测具有无创、无辐射暴露风险，敏感度高、阳性准 确率高达 90% ，能同时检测早期小细胞肺癌与非小细胞肺癌，在肺癌早期发现方面具有重要临床意义。基于循环肿瘤抗体 （Circulating Antibody ）分子生物学方法的“七种自身抗体检测”临，床研究表明，其对于 8mm 以下的结节、 8mm 到 20mm 之间肺部结节都有 90% 的阳性准确率。以下就对这 7 种抗体进行简要的介绍： GAGE 7 ：属于肿瘤 /睾丸抗原，只表达于恶性肿瘤以及睾丸组织。该蛋白具有抗细胞凋亡的活性，其 自身抗体在鳞状细胞肺癌的早期可检出。 PGP9.5 ：神经元胞 质白基因产物 9.5 。其表达不依赖于神经的分化而独立存在，与肿瘤的病理分期密切相关，在原发性肺癌中有大量表达。 CAGE ：只表达于恶性肿瘤和睾丸组织，因此被称为肿 瘤/睾丸抗原。它的表达量与细胞周期有关，在癌细胞中激活ERK和p38蛋白并增加肿瘤细胞的扩散。MAGE A1 ：只表达于恶性肿瘤和睾丸组织，因此被称为肿瘤/睾丸抗原。MAGE A1在非小细胞肺癌中表达与较差的预后相关。
SOX2 ：能够诱导肿瘤癌信号EGFR及BCL2L1，促进肺 癌细胞的增殖、存活；同时SOX2 还是 I 期肺腺癌预后不佳 的独立预测因子，且与复发风险相关。p53 ：是最早发现的 抑癌基因之一， p53蛋白能调节细胞周期以及避免细胞癌变 的发生。在许多癌症病例中，p53基因突变导致的p53蛋 白失活是癌症产生的一个重要步骤。GBU4-5 ：属于ATP结合 RNA 解旋酶，在癌变过程中发挥重要作用，同时具有肿 瘤特异性和免疫原性。早期肺癌的七种自身抗体检测，其技 术核心是肿瘤免疫应答机理，与传统的抗原类标志物相比， 自身抗体肿瘤标志物有天然的高特异性与免疫生物放大信号 系统等独特优势，已经成为国际上肿瘤早期诊断临床应用的 技术发展趋势。
抗体的提取与纯化
(关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B 亲合层析纯化IgG；离子交换层析) 精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使 用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。 一、盐析法 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。 ↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。 ↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。 ↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。 取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。 影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法 分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA 和IgM，IgG留在上清液内。调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。 表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件 物种 pH 沉淀条件 IgG产量 酒精浓度（%）离子强度 人 5.1 15. 0.01 65 山羊 5.2 0 0.01 65 家兔 5.2 10 0.01 70 大鼠 5.0 15 0.01 50 豚鼠 5.1 15 0.01 70
实验方案_低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白
低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白 一、实验目的 利用低温乙醇法从人血清中分离出免疫球蛋白（Ig），并获得副产物血清白蛋白。 二、实验原理 （1）低温乙醇法Cohn6法：美国哈佛大学Ｅ·Ｊ·COHN教授研究组，在短短两年建立了低温乙醇分段提取法。 方法原理：往蛋白水溶液中加入中溶性有机溶剂，如乙醇、丙酮等，主要是降低水分子的活度，降低溶液的介电常数，从蛋白分子周围排斥水分子，使蛋白分子之间通过极性基团的相互作用，在范德华力作用下，发生凝聚。不过由于有机溶剂存在，降低了蛋白分子表面憎水基团的作用，因而引起蛋白分子聚集的主要极性基团的相互电荷之间的引力。（文献20） 分离过程中，二法通过五个因素的变动(五变系统)，使很多血浆蛋白质得以分离。这五个因素及其各自的作用是；①乙醇：使蛋白质分子“脱水”；⑦pH值；蛋白质在等电点时易于沉淀；②电解质浓度：在低离子浓度下，对蛋白质溶解度有较大影响；④蛋白质浓度：浓度越低，其沉淀作用越小；⑥温度：在低温下，可避免乙醇对蛋白质的变性作用。同时，蛋白质溶解为吸热反应，溶解度随温度上升而增高。 经实验得知，利用低温乙醇法能将血清蛋白分成六个组分（Ⅰ~Ⅵ），其中免疫球蛋白IgG主要存在于Ⅱ+Ⅲ中，白蛋白Alb主要存在于Ⅴ中。 (2) Cohn氏9法；该法对Cohn氏6法的组分Ⅱ+Ⅲ作进一步分离和提纯，可获得组分Ⅱ—l，2，3(Y—G)，组分Ⅲ一1(同种凝集素)，组分Ⅲ—2(凝血酶原)，组分Ⅲ—3(血浆酶原)等产品。其工艺流程见图:
乙醇法生产中所用的乙醇是通过予冷、慢速搅拌滴入的。其体积可按下式计算： 式中V＝所需乙醇体积；V 0＝原来溶液体积；C 1 ＝原来溶液乙醇浓度；C 2 ＝ 所需达到乙醇浓度；C 3 ＝加入乙醇的浓度。 三、材料和试剂 3.1 血清：100 mL 3.2 相关试剂：95%乙醇，pH 4. 0醋酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液Ⅰ，磷酸盐缓 冲液Ⅱ，3 mol/L NaCl溶液，1 mol/L NaHCO 3 ，生理氯化钠溶液，麦芽糖， 3.3 实验仪器： 四、方法与步骤 基本思路：
实验室血清学常用检测方法
实验室血清学常用 检测方法
常见血清学检测方法介绍 一、酶联免疫吸附试验诊断技术 当前，该项技术已在兽医学上得到广泛的应用，大多数动物传染病都已经研制成ELISA检测方法。 1、酶联免疫吸附试验的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其它物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也经过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 2、ELISA的类型 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于动物疫病检测的ELISA主要有以下几种类型： ①.双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常见的方法。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质、微生物病原体第二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如猪瘟病毒检测ELISA、禽流感病毒抗原捕获ELISA，就是根据这种原理设计的。 ②.双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。乙肝HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于于间接法。另外，该方法不受被检动物种属差异的限制。 ③.间接法测抗体 间接法是检测抗体常见的方法。其原理为利用酶标记的抗体（抗免疫球蛋白抗体），检测与固相抗原结合的受检抗体（见图1）。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上
抗体的纯化：盐析法
抗体的纯化：盐析法 发布时间：2009-02-18 新闻来源： 精制抗体的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。 一、原理 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 1、试剂 （1）正常人混合血清；灭菌生理盐水。 （2）饱和硫酸铵溶液的配制 称（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（15N NH4OH）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。 （3）萘氏试剂配制 称HgI 11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。 （4）0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制： 贮存液 A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml； B液：0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H2O 3.12克，加蒸馏水至1000ml； 应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。 （5）0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer P配制 将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。 （6）20%磺基水杨酸。