重组质粒的构建 转化 筛选和鉴定
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科目分子生物学实验题目重组质粒的构建转化筛选和鉴定组别周一
一、实验目的
1．学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA
分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。
5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大
小。
二、实验原理
外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子的鉴定。
1.重组子的构建
酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。）
连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。
2.感受态细胞的制备及质粒转化
构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有
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摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以
E.coli DH 5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质
粒在42℃下热击90s，实现转化。
3.重组子的筛选鉴定
重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。
抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒PUC19进入 E.coli DH 5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coli DH 5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。
挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。
三、实验仪器和材料试剂
菌株：E.coli DH 5α
培养基： LB培养基、麦康凯培养基（加入AP）
仪器：高速离心机，恒温震荡培养箱，恒温水浴锅，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，计时器试剂：TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，λDNA／HindⅢ Marker，DL 2000plus DNA PUC19 质粒，酶切10×buffer，Hind Ⅲ,重蒸水
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四、实验步骤
混合均匀，上下摇晃 4000转1min
均分为两管，37℃水浴2hrs
1h后，取一管，1%琼脂糖凝胶电泳，100v电压40min
混合均匀，上下摇晃 4000转 1min
16℃保存
3.感受态细胞的制备与转化
E.coli DH5α感受态细胞的制备
甘油管→LB平板（活化）→单菌落→LB平板（37℃ o/n）→20mlLB(37℃o/n) →1%转接至新鲜LB液→37℃2-2.5hrs→冰浴10min→1.5mlx2，4000rpm/6000rpm 5min→Votex+800ml CaCl
2
，轻悬，冰浴20min→感受态细胞吹吸悬浮细胞→4000rpm 5min吸弃上清→100μl 0.1M CaCl
2
4.质粒的转化及重组质粒的筛选
静置10min，于37℃倒置培养16-20hrs
5.重组质粒的提取及电泳检测鉴定
I中的平板→白色单菌落（无菌牙签）→接入预留麦+AP平板→4-6个菌落/组→37℃倒置o/n
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五、实验结果
pUC19和λDNA经Hin d III单酶切作用结果的电泳检测
电泳结果表明：
λDNA 分子量2万3bp
pUC19商业和测试酶切完全，分子量在2300+，经查的2686bp
1~9组提质粒结果均出现两条亮带，上面的是酶切切开的质粒，下面的为超螺旋结构，最下方模糊条带为RNA少量残留，表明RNA酶效果显著，但仍没完全除掉RNA，（通过对照组未加RNA酶很明显能看出）
两条亮带上方混杂带可能是DNA染色体的残留
在质粒转化与重组质粒筛选的过程中，第一次加于麦康凯培养基的AP（氨苄青霉素）效果失活，导致II号平板即生长白菌又生长红菌，筛选失败。后老师又重新做了一批加入新AP的实验证明ap抗生素失活。
E.Z.N.A.TM Plasmid Miniprep Kit试剂盒提取重组质粒的电泳检测
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电泳结果表明：
所有组质粒中均连接上了或大或小的片段（125bp，700左右bp，6000+bp）而且并没有出现一个泳道有多个条带的混杂情况，证明单菌落挑的成功，且提质粒时没有混杂。
我组连接片段为125bp和6000+bp
六、注意事项
1.实验之前枪尖，PE管，移液器，牙签都应包好灭菌
2.无论手提还是试剂盒提取质粒，应按顺序加入试剂，solution II和III时不要间断，溶液
在pe管中混合式应轻摇
3.加样的顺序应该是，先加双蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。且要把样品加到液面下，
酶从-20℃冰箱中拿出后放在冰中待用，加酶时枪尖不要伸进酶液过深，加样时在溶液中缓
慢吹吸几次，保证足够的酶量
4.无菌操作时不能带一次性手套，避免烫伤，涂棒或接种环应蘸乙醇烧2-3次，接种时确保
涂棒或接种环冷却在点样
5.电泳缓冲液最好是现配现用，从50x稀释
6.配胶时，琼脂糖在微波加热下要完全溶解（溶液中没有不溶物），加热时锥形瓶上封上称量
纸尽量避免加热时水分的蒸发。盛放胶的梳子和槽应洗净擦干，加热琼脂糖应冷却片刻在
倒入槽中，避免将梳子烫变形。
7.上样时垂直点入孔中，缓慢推入点样液，避免气泡产生
8.EB染色时戴两层手套，避免将EB溶液滴在身上和周围，看胶过后，凝胶应用手套包好扔入
指定的垃圾桶，尽量不污染环境
重组质粒的构建与转化
实验目的 1. 学习在实现DNA 体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对 载体和目的DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。 2. 学习设计构建重组DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA 酶切的操作。 3. 学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外DNA 分子的 技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl 2制备感受态细胞的方法。 5. 学习掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法。 6. 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7. 学习并掌握使用Omaga 试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段。 实验原理： （一）限制性核酸内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA 时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切 方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。 在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分 子中，或目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶
切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的 因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进 行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。 酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA 数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA 的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0 μg的DNA 分子时，反应体积约为15~20 μg，DNA 的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h 完全酶解1μg 的pBR322 DNA 分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应 总体积的10% 。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50% 甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5% ，就会抑制酶的活性。 （二）载体与外源DNA 的连接反应 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA 片段与载体分子连接的方法即DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA 连接酶催化完成的。DNA 连接酶催化两双链DNA 片段相邻的5’-磷酸和3’-OH 间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA 连接酶是来自T4 噬菌体的T4 DNA 连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA 和外源DNA 的摩尔数之比控制在1:（1~3 ）之间，可以有效地解决DNA 多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h 。 （三）感受态细胞的制备及质粒转化
重组质粒的构建经验 [技巧]
重组质粒的构建经验 [技巧] 重组质粒的构建经验~~~ 昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。 一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。 2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。 NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4
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重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定 实验目的： 1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4.掌握利用Cacl 感受态细胞的方法。2 5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。 7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。 实验原理： 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切连接导入感受态细胞中，将DNA分子限制性内切酶起来。将重组质粒的载体分子和外源选择性培养基互补筛选法酶切筛选出重组子，并可通过中培养，可以通过转化后的细胞在α电泳PCR检验的方法进行重组子的鉴定。及1.重组子的构建 酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最“先限制性内切酶在使用时应遵循在双酶切体系中，主要的因素是反应温度和缓冲液的组成， 低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。 （要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。） 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5'-磷酸和3'-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA 连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。 2.感受态细胞的制备及质粒转化 构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法 1.cDNA编码区片段的PCR扩增 50ul ×2 模版 1 5‘引物 1 3‘引物 1 dNTP 1 10×buffer 5 Taq 1 Milliq H2O 40 2．PCR产物纯化 1、加5倍体积的PB 2、将Spin柱放于2ml收集管上 3、加样液，14Krpm，离心1min 4、弃去排出液 5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 6、弃去排出液,14Krpm,离心1min 7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm， 离心1min 3．双酶切 载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n 小时）： 4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收 1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）
2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解 3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中 4.加样液，14Krpm，离心1min 5.弃去排出液 6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 7.弃去排出液,14Krpm,离心1min 8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm， 离心1min 5．连接 上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下： 载体 2ul PCR 片段 6ul 10xT4 buffer 1ul T4 DNA ligase 1ul 6．转化 取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。 7．菌落原位PCR 挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将 细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2% 凝胶上进行电泳分析。 8. QIAGEN试剂盒抽提质粒
重组质粒的构建
重组质粒构建 生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切 为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。Image J软件可以做灰度分析。） 双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。回收完之后用同样的方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。） 二、连接反应 载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。 载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。如果时间比较紧张，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。 三、质粒转化到感受态大肠杆菌中 从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。然后立即插入冰上，静置2min。（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。）在超净台中向EP管中加入700ul 无抗性LB培养
目的基因的克隆转化及重组子筛选
实验报告 题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选 指导老师:丛佩清 日期:2013/10/24-2013/10/26 一．实验目的： (1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。 (2)学习DNA连接的有关技术。 (3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。 (4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 (5)掌握质粒提取的基本方法。
(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。 二．实验原理： (1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。 (2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。 (3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。 三．实验材料： 大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW 溶液、1μl pMD19-T Vector、5μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅰ、250μlSolution Ⅱ、350μlSolution Ⅲ、HiBind ? Mini Columns (I)、500 μlBuffer HB、1400 μlDNA Wash Buffer等 四．实验步骤、现象、结果及分析： Ⅰ10月24号 (1)cDNA电泳及胶回收 1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2μl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。 2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。 表一：cDNA琼脂糖凝胶重量 空管2管3管 重量（g）0.9045 1.2280 1.2961 净重（g）0.3235 0.3916 3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）； 4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液； 5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液； 6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液； 7.10000g 离心1min（去乙醇）； 8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置1min，10000g 离心1min。 9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。 表二：cDNA吸光度测定 2组3组
质粒的酶切、连接、与转化
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 (2011-04-29 10:42:22) 转载▼ 质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 实验目的 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法 4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法 5、掌握α互补筛选法的原理 6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法 7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法 实验原理 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。 DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种： （一）、具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。 （二）、平末端的连接 载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常
重组质粒的构建与转化
实验目的 1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对 载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的 技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。 5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。 实验原理： （一）限制性核酸内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。 在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶
切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。 酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μg，DNA的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1μg的pBR322 DNA分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。 （二）载体与外源DNA的连接反应 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h。 （三）感受态细胞的制备及质粒转化
重组质粒的构建.
重组质粒的构建实验流程—质粒构建 基因提取—1、2、3 基因提取—1、2、3 PCR反应扩增目的基因—4、3 PCR反应扩增目的基因—4、3 DNA片段回收—5、3 DNA片段回收—5、3 重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5 重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5 测序 测序 重组质粒提取—2、 3 重组质粒提取—2、 3 菌种保藏—7 菌种保藏—7 目的片段与载体连接及转化—6 目的片段与载体连接及转化—6
实验操作 1、 LB培养基配置 LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。 【试剂】 胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar） 【实验步骤】 1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）
胰蛋白胨（Tryptone） 1g 酵母提取物（Yeast Extract） 0.5g NaCl 1g 琼脂（Agar） 1.5g 单蒸水 100ml 蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外， 称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或 在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药 品，瓶盖也不要盖错。 2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。 3、包扎 用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 4、灭菌 将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。 5、 LB固体培养基倒板 配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。 抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。 保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。 二、质粒的提取（protocol）
载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定
实验一载体与目的基因的连接与转化以及 重组DNA的提取与酶切鉴定 一、实验目的 1.CaCl2法制备感受态细胞 2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接） 3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Amp r） 4.质粒DNA的小量快速制备 5.质粒DNA的限制性内切酶酶切 6.DNA的琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理 通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重组的DNA分子。 受体细胞经处理后（电击或CaCl2等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过程称为转化。由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。 分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分离和纯化质粒DNA。SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH＞12.6时，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。当采用pH 4.8的NaAc高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形成网状结构。通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。 三、实验器材和试剂 １.器材 恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡旋振荡器、移液枪及枪头、1.5 ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培
重组质粒构建(protocol)
重组质粒的构建（beta版） 一、引物设计: 1.选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒;注意ATG和stop codon）。 2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。 1，使用word 2，设计引物：primer-up Primer-down 3，另设计一对引物扩增CDS区，引物位于CDS区之外，扩增产物包含完整的CDS区。引物长度约20个碱基。 4，核对----送公司合成。 5，对公司合成的引物快速离心，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（dd2H2O），配成100umol/ul(100uM),-20℃保存。使用时按1：3比例稀释成25uM工作浓度。 二、PCR（P出目的片段）： （一）、PCR P出目的片段： 2,pcr: cDNA 1ul 10x PFU buffer 2.5ul ℃ 5min dNTP 1ul ℃ 30sec F’-Primer 1ul ℃ 30sec R’-Primer 1ul ℃ X min PFU 0.5ul ℃ 5min dd2H2O 18ul （X是根据片段的长度设定，1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值5℃） 3，跑胶、回收: （1），配胶： 0.6g 琼脂糖 60ml 1X TAE 0.6ul (待温度降到50-60℃左右时)
25分钟后，即可点样跑胶。 （2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。 （3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩） 4，胶回收（胶回收试剂盒）: 按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，放在37℃温箱中2min。 对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物5ul、6xloading buffer 2ul、dd2H2O 5ul。 三、酶切、链接： 1，目的片段酶切：（酶切时间根据酶的活性,70℃15-20min灭活） insert (胶回收产物) 10ul 10 x buffer 2ul 20ul的体系dd2H2O 6ul EcoRI 1ul HindⅢ1ul 2，载体酶切：（1~2小时） Vector （1ug/ul）：5 ul（总量5ug） 10 x buffer 2ul 20ul的体系dd2H2O 11ul EcoRI 1ul HindⅢ1ul 为方便以后使用，载体可以一次性多切点。 3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。 4，连接： 10x T4 Ligation Buffer 1ul Vector 1ul 10ul体系insert 3ul（2～3ul） T4 DNA Lignase 1ul dd2H2O 4ul 附：Ligation system DNA片段克隆到质粒载体上 载体与插入DNA的摩尔数比例为1:3-10。最佳的摩尔数比例因载体类型的不同而不同，例如cDNA 和基因组DNA克隆载体。可根据以下公式计算插入DNA用量： [实例]: 载体与插入片段的摩尔数比例为1:3，如连接反应中加入100ng 6kb载体，插入片段大小为0.5kb，这时应加入插入片段的量为：
实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化
实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化 【实验目的】 1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 【实验原理】 质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。 微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1．LB液体培养基: 参见附录 每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）: 配1L LB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。 每组制备LB平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。 3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。 4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。 5．1 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。 7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。 〈二〉器材 1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等 2. 高速冷冻离心机 3. 微量移液器等
重组质粒的构建与转化
姓名系年级10级生命基地组别JD-4 同组者 科目分子生物学实验题目重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定学号 实验目的 1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载 体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技 术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。 5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。 实验原理： （一）限制性核酸内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。 在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。 酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μg，DNA的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1μg的pBR322 DNA分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。
实验二 重组质粒的构建
实验二重组质粒的构建 一、实验步骤 1.提取质粒DNA 2.酶切（EcoRI+SpeI） 注意事项： ①酶量，反应时间及体积： One unit of enzyme is defined as the quantity needed to cut 1μg of DNA in 50ul in one hour。反 应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，可延 长反应时间（16h)；反应体系不应太小,常规的酶切一般要维持在 10-50ul。酶的体积不要超过总体积的10%（甘油应在5%以下）。 ②酶的使用：酶应永远放冰上，应是最后一个被加入到反应体系中， 用完后及时放回冰箱 ③DNA的制备：待切割的DNA应当已去除酚，氯仿，乙醇，EDTA, 去 污剂或过多盐离子等 ④缓冲液：不同酶需不同离子强度缓冲液，使用前应将缓冲液完全 溶解并充分混匀。 ⑤混匀：很重要，注意不可振荡 ⑥反应温度：通常37 ℃ ⑦终止反应：终止液，热失活，酚/ 氯仿抽提 ⑧星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全 相同的序列。 3.: 酶切产物纯化 4.连接
二、实验结果与分析 1.酶切结果检测 图1 EcoRI和SpeI双酶切GST-T及proB载体结果1%琼脂糖凝胶电泳检测图 注：M：DL5000DNAmarker；1号泳道;未酶切proB 质粒DNA；10、11号泳道：EcoRI和SpeI双酶切proB载体结果；16、17泳道：EcoRI和SpeI双酶切GST-T载体结果 分析：①由图1可知，1号泳道的未酶切proB质粒DNA未显示有条带，其原因可能是所点的未酶切proB标准品浓度过低，条带亮度过低难以识别。②10和11泳道中大小约为5000bp的较亮条带是proB载体，但有轻微拖尾现象，条带呈圆弧型，应该是因为点样量较大。经EcoRI和SpeI双酶切后，环状的质粒DNA被分成两个部分，分别为约5000bp和40bp的片段，其中40bp的小片段因分子量小，迁移速度快而跑出了琼脂糖凝胶，在图中无法看到。本次实验回收的是约5000bp的条带。③泳道16和17中约3000bp的较亮较粗条带是T载体，而约650bp的较细条带是被切下的GST，即本次实验回收的片段。 2..质粒DNA的浓度 经测定，本组的质粒DNA浓度如下表： 表1 提取的GST-T及proB质粒DNA浓度 质粒名称浓度(ng/μl) GST-T 0.611
基因的转移与重组体的筛选和鉴定_百替生物
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定 第一节转化 基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。 一、重组DNA分子转入原核生物细胞 1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。 （1）CaCl2处理后的细菌转化或转染 A、制备感受态细胞 受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。 所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。 转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程； 转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程； 好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。 B、细胞转化（或转染）的具体操作过程： ①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞； ②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。 ③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收； ④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因； ⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。 ⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。 （2）电穿孔转化法 基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。 受体细胞的准备：当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上。 （3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌 原理：是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方式。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。 尤其适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法等进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。
重组质粒的构建转化筛选和鉴定 (2)分解
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定 摘要 本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hin d Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hin d Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。 关键字酶切连接转化重组子琼脂糖凝胶电泳 引言 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coli DH5α,载体是PUC19。 DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类，分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类：Ⅰ类酶的识别部位和切点不同，切断部位不定；Ⅲ类酶的识别部位和切点不同，但切断特定部位；Ⅱ类酶切断识别部位或其附近的特定部位，酶切后的双链DNA的末端是粘性末端，某些限制酶产生平末端。因此，应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是Ⅱ类酶。酶切又分为单酶切和双酶切，单酶切就是只用一个限制性内切酶去切质粒,使环状的质粒被切割为一条或多条线状DNA,单酶切操作简单，但是后期筛选工作复杂；双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒变成两段线状DNA了片段，双酶切前期酶切操作复杂，但是重组效率高。本实验所选用的限制酶是Hin d Ⅲ，选用方法是单酶切法。 DNA连接反应是利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子的反应。当载体DNA和外源DNA末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源DNA两端的限制性内切酶切点，从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的DNA段。本实验所选用的连接酶是T4连接酶。 转化是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA 而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。为了检验连接产勿，需要对转化子进行筛选，本实验将重组质粒导入大肠杆菌，用氨苄抗性的选择培养基对转化子进行筛选；通过红白斑反应对重组子进行筛选。 电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大