用圆二色光谱研究蛋白质与小分子作用后的构象变化

用圆二色光谱研究蛋白质与小分子作用后的构象变化

一．实验目的

1.了解圆二色（CD）光谱研究蛋白质二级构象的基本原理和方法。

2.能设计实验用CD光谱检测蛋白质与小分子作用后的构象变化，能用简单方法计算二级结构

中螺旋的含量。

二．实验原理

1.CD光谱的基本知识

圆二色性是研究分子立体结构和构象的有力手段。在一些物质的分子中，没有任意次旋转反映轴，不能与镜像相互重叠，具有光学活性。电矢量相互垂直，振幅相等，位相相差四分之一波长的左和右圆偏振光重叠而成的是平面圆偏振光。平面圆偏振光通过光学活性分子时，这些物质对左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，就是该物质的圆二色性。圆二色性用摩尔系数系数差ΔεM来度量，且有关系式：ΔεM = εL –εR，其中，εL和εR分别表示左和右偏振光的摩尔吸收系数。如果εL –εR >0，则ΔεM为“+”，有正的圆二色性，相应于正Cotton效应；如果εL –εR <0，则ΔεM为“-”，有负的圆二色性，相应于负Cotton效应。

由于这种吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此从圆偏振光通过介质后变成了椭圆偏振光。圆二色性也可用椭圆度θ或摩尔椭圆度[θ]度量。[θ]和ΔεM之间的关系式：

[θ]=3300*ΔεM

圆二色光谱表示的[θ]或ΔεM与波长之间的关系，可用圆二色谱仪测定。一般仪器直接测定的是椭圆度θ，可换算成[θ]和ΔεM：

[θ] = 100θ/cl

ΔεM = θ/33cl

其中，c表示物质在溶液中的浓度，单位为mol/L；l为光程长度（液池的长），单位为cm。输入c和l的值，一般仪器能自动进行换算，给出所需要的关系。

圆二色光谱仪需要将平面偏振调制成左、右圆偏振光，并用很高的频率交替通过样品，因而设备复杂，完成这种调制的是电致或压力致晶体双折射的圆偏振光发生器（也称Pocker池或应力调制器）。圆二色谱仪一般采用氙灯作光源，其辐射通过由两个棱镜组成的双单色器后，就成为两束振动方向相互垂直的偏振光，由单色器的出射狭缝排除一束非寻常光后，寻常光由CD调制器制成交变的左圆偏振光、右圆偏振光，这两束圆偏振光通过样品产生的吸收差由光电倍增管接受检测。

测试时要通入氮气赶走管路中的水蒸气和光源产生的臭氧（臭氧会腐蚀反射镜）。

2.CD测蛋白质二级结构的基本原理

蛋白质是由氨基酸通过肽链组成的具有特定结构的生物大分子。蛋白质中氨基酸残基的排列次序是蛋白质的一级结构，而肽链中局部肽段骨架形成的构象称为二级结构，二级结构是靠台联股价中的烫机上的氧原子和亚胺基上的氢之间的氢键来维系的，根据肽链的旋转方向

与氢键之间的夹角不同，蛋白质的二级结构主要分为：α螺旋、β折叠、γ转角和任意度较大的无规卷曲几类。这些二级结构的不对称性，使蛋白质具有光学活性，也就具有特征CD谱。α螺旋在222 nm和208 nm处有负Cotton效应，表现出两个负的肩峰谱带，在靠近192 nm有一正的谱带。β折叠的CD谱在216 nm有一负谱带，而在195-200 nm有一正谱带。γ转角和无规卷曲都有特征的CD谱。根据所测得的蛋白质的CD谱，以及已知结构的标准谱图，可计算这几种二级结构的含量，从而推断出蛋白质的二级构象。

由于222和208 nm是α螺旋的特征峰，最早估计α螺旋的含量从这两点的平均椭圆度得到：

fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000

或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000

其中，fα是α螺旋所含的残基与整个蛋白质分子的残基数的百分比；[θ]222和[θ]208分别只在222和208 nm时的摩尔椭圆度。其他常数是根据实验推出的经验值。由于上式仅考虑了单波长时α螺旋的贡献，而忽略了其它组分对[θ]的贡献，具有一定的误差，但可以利用上面两式做快速简单的推算。

三．仪器与试剂

仪器：JASCO715型号的CD分光光度计；25 mL容量瓶；1 mL分度吸量管

试剂：牛血清白蛋白（BSA）（A.R.）；V B12（A.R.）；缓冲剂（A.R.）pH=4.0的HAc-NaAc和pH=8.0的磷酸盐体系；蒸馏水

四．实验步骤

1.准备样品

准确配制7.5 μg/mg的V B12溶液、5 μg/mg牛血清白蛋白溶液、pH=4的牛血清白蛋白溶液、pH=8的牛血清白蛋白溶液、pH=4的牛血清白蛋白+ V B12溶液和pH=8的牛血清白蛋白+ V B12溶液。蛋白质溶液中加入V B12后，需要放置一段时间，使蛋白质与V B12分子作用达到平衡。

2.开机

打开高纯氩气，通入光路。打开计算机，进入操作界面。开启氙灯，等约30 min，待仪器充分预热后，方可使用。

3.测试

将光路径为1 cm的样品池放入样品室中，进入测试界面，输入测试参数：灵敏度1000 mdeg；扫面范围250-200 nm；扫速50 nm/min；响应时间2 s；响应波长宽度1.0 nm；扫描次数1次。先测试蒸馏水背景，再分别测试配制的六份溶液。

4.关机

打开样品室，取出样品池；退出操作界面，关闭氙灯；关闭氮气，关闭主机电源；关闭计算机和打印机；清洗样品池。

五．数据处理

图1. BSA

使用公式：BSA平均分子量为67000，配制的BSA样品浓度为10ug/ml,换算得到BSA浓度为1.4925*10-7 mol/L [θ] = 100θ/cl，其中c =1.4925*10-7 mol/L，l = 1cm-1

根据杨氏公式fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000估算α螺旋的含量得到

fα，222 = -（-16096 + 3000）/ 33000=39.68%

fα，208 = -（-17983 + 4000）/ 29000=48.22%

图2. BSA，PH=8

根据杨氏公式fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000估算α螺旋的含量得到

fα，222 = -（-15955 + 3000）/ 33000=39.26%

fα，208 = -（-17213 + 4000）/ 29000=45.56%

图3.BSA，PH=4

根据杨氏公式fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000估算α螺旋的含量得到

fα，222 = -（-16472 + 3000）/ 33000=40.82%

fα，208 = -（-17865 + 4000）/ 29000=47.81%

图4. BSA +V B12

根据杨氏公式fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000估算α螺旋的含量得到

fα，222 = -（-16236 + 3000）/ 33000=40.10%

fα，208 = -（-21899+ 4000）/ 29000=61.72%

六．结果讨论

1. 从四张图中都能看到BSA在222nm和208nm存在两个负Cotton效应的峰，而在195nm处存在一个正Cotton效应的峰，这都是α螺旋的特征峰，证明存在α螺旋。从四组实验结果（如下表所示）可看出，用fα，222和fα，208计算得到的结果不完全一致，但在误差范围内可认为一致。PH=8时，BSA溶液α螺旋的含量变化不大，因为比较接近人体正常PH范围（7.35～7.45），当PH=4时，α螺旋的含量升高，且变化幅度大于PH=8，说明PH越大，α螺旋越不稳定，含量越低，酸性条件有利于α螺旋的稳定性。而且，PH变化越大，α螺旋的含量变化越大。比较BSA+ V B12溶液和BSA溶液α螺旋的含量可知，由于V B12中钴离子与BSA发生配位作用，从而造成α螺旋的含量升高。

2.杨氏算法只是一个经验公式该公式只考虑了单波长时α螺旋的贡献，忽略了其他组分对[θ]的贡献，具有一定的误差，只适合于α螺旋含量高的蛋白质的快速简单估算。

3.扫描多次可以进行数据累积，提高信噪比。

4.高纯N2的作用是保护仪器。因为作为紫外光源的氙灯燃烧会产生臭氧，对仪器有腐蚀性，而且在紫外区有一定吸收，影响结果的准确性。

5.实验过程中要严格按照BSA，BSA+PH=8，BSA+PH=4，BSA +V B12的顺序依次测量，防止上一个样品的残留部分对后一个样品的污染造成的影响，按影响从小到大可减小这种影响。

6.CD光谱的测量一般在蛋白质含量相对低(0. 01～0. 2 g/ L) 的稀溶液中进行,溶液最大的吸收不超过2。稀溶液可减少蛋白质分子间的聚集。但如果太稀,则导致蛋白质过多地吸附在容器壁上,影响实验的准确性。确定蛋白质的精确浓度是计算样品的二级结构的关键,一般蛋白质在280nm 附近的消光系数可用来计算浓度,但此处吸收信号与蛋白质的构象有关,该方法的误差一般可达到5 %。更精确的方法有:定量氨基酸分析;用缩二脲方法测量多肽骨架浓度或测氮元素的浓度;也可以在完全变性条件下测芳香氨基酸残基的吸收,来确定蛋白质的准确浓度。

七．注意事项

1.本实验比色皿需使用石英比色皿，因为玻璃在紫外区对光源有吸收，而且比色皿的纯度也对吸收有影响。

2.比色管定量取溶液时，要把样品溶液集中在容量瓶上部，用比色管针尖部分量取，不能有气泡。

3.蛋白质溶液黏性较强，易吸附在壁上，所以样品溶液定容后要摇匀，静置，而且每次使用前和使用后都要洗净容器。

4.放比色皿时QS标志要一致，以减少误差

5.样品测量前要用二次去离子水进行机械校准，以扣除水和比色皿的背景吸收，校正基线，而且必须先进行自检再放入样品，否则结果不准确。

八．思考题

1. 查阅相关资料，了解CD研究蛋白质的原理和各种计算拟合方法的特点。

答：蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子,同时也是具有多个手性中心的分子。在蛋白质或多肽中，主要的光活性是肽链骨架中的肽键，芳香氨酸残基及二硫键。当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面偏振光中的左、右圆偏振的吸收不同，产生吸收差，由于这种吸收的存在，造成了偏振光矢量差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000，fα是α螺旋所含的残基与整个蛋白质分子的残基数的百分比。多级线性回归是一种更完全、较简便的分析二级结构的方法。令f i是每种二级结构的分量。则有：

∑f i = 1 [θ]λ = ∑f i[θ]λ,i + Niose

其中，[θ]λ是实测的CD曲线在波长λ处的摩尔椭圆度；[θ]λ,i为每种构象在波长λ处的摩尔椭圆度。

2．根据所做的实验，查阅相关蛋白质的数据库，对比CD计算结果和X射线衍射或NMR方法得出的结果的不同。

答：X射线衍射是公认最准确的方法，但能得到单晶的蛋白质很少，且晶体状态与接近生理的溶液还是有些区别的。NMR虽然可以得到溶液中蛋白质结构的信息，但对于分子量相对较大、结构复杂的一些蛋白质计算就很复杂，难得到满意的结果。CD可快速地测得稀溶液中蛋白质的二级结构变化。

参考文献：

1.南开大学综合化学实验二分析化学实验讲义

2.酚酸类及生物碱类药物小分子和牛血清蛋白相互作用研究，谢余寰，广西大学硕士论文，

2008

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4.紫外圆二色光谱预测蛋白质结构的研究方法，黄汉昌等，化学通报，2007,7

5.荧光光谱在蛋白质分子构象研究中的应用，王守业等，化学进展，2001,13,4

6.金属离子与血清白蛋白结合反应研究进展，秦身钧等，河北师范大学学报，2003,27,1

金属一血清白蛋白的结构研究(V)—钴离子与HSA和BSA的相互作用，车云霞等，高等学校化学学报，1991，12(4)：441—443