RT-PCR实时聚合酶链式反应

RT-PCR

操作流程及步骤：

1、计算：根据设计分组及检测指标计算要配制PCR体系，每孔PCR体系

19ul，其中SYBR green：10ul、F：1ul、R：1ul、water：7ul[1-2]。

2、配制：将计算好的不同引物的PCR体系按照计算量配制好。

3、加样：96孔板按照样品顺序，每孔加19ulPCR体系，再加入1ulCDNA[3-6]。

4、离心1000转/分钟时间2min.。

5、上RT-PCR扩增仪。

心得体会及注意事项：

1、根据实验组数如实验组1、

2、

3、对照组，不同引物如：CDNA203、CDNA429等，

计算所需量。

2、SYBR green：荧光加dntp ，F：上游引物，R：下游引物，water：试剂盒中带。

3、加PCR体系时枪头不要碰壁及底部，相同PCR体系的孔可以不换枪头。

4、CDNA为之前提取RNA逆转录得。

5、加CDNA时枪头必须到液面以下，加入量少确保都加入到PCR体系中。

6、加样前CDNA要混匀。

7、RT-PCR原理通过荧光标识探针检测的方法可以实时检测CDNA扩增的情况