实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法
电转法
设计方案一：
感受态制备：
1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；
2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30℃、250-
300rpm培养约16-18h(OD:
1.3-
1.5)；
3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；
4.加入1ml，pH
7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；
5.再加入
0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；
6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；
7.2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；
8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。
电转化：
1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；
2．擦干电转杯，电击，电击参数：
1.5KV，25uF，200xx；
3．立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；
4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；
5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。
说明：
该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。
设计方案二：
感受态制备：
1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；
2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30℃、250-
300rpm培养约16-18h(OD:
1.3-
1.5)；
3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，
0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH
7.5），室温静置30min；
4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用
1.5mL1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；
5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。
电转化：
1.向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；
2.擦干电转杯，电击，电击参数：
2.0KV，25uF，200xx；
3.立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；
4.离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；
5.离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。
说明：
处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。制备体系可按比例放大。
设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞
具体如下：
1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中或转接于50mL YEPD中，在30℃、250-300rpm条件下培养至OD=6-10（为防止菌体老化，可将50mL培养体系提早收获细胞，取菌体时，以1mL/次，取菌两次或三次不等，使用菌浓达到预定的OD:6-10）；
2.取1mL菌液分装于EP管中，于4℃，12000rpm离心30s，弃上清；
3.收集菌体，用预冰的无菌水洗涤两次，离心条件一样；
4.所得菌体用1mL处理液（配方同上）于室温下处理30min；
5.离心，弃上清，加入1ml 1M预冷山梨醇，离心，弃上清，重复两次；
6.最终用1M预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80 ul，于-70℃冰箱保存；
7.电转方法同上。
8.每一步的离心均30s即可，在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别高。
备注：
OD检测均为600nm，空白参比为：
YEPD，高浓测定时应稀释测定。所有无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理；在制备感受态阶段，所有离心均在4℃条件下。
醋酸锂转化法
方案一：
1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、200rpm培养过夜；
2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30℃、250-
300rpm培养约5h(OD:
0.5-
0.8)；
3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体；
4.25mL冰无菌水洗涤两次，离心条件一样；
5.用1mL
0.1M LiAc悬浮，离心收集菌体；
6.再用
0.5mL
0.1M LiAc悬浮，以50 ul/管分装于EP管中，置于冰上备用；
7.依次向上述50ul感受态细胞中加入50%PEG3350：240ul、1MLiCl：36ul、2mg/ml单链DNA：50ul、转化DNA（5-10ug）：50ul；
8.剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；
9.30℃水浴孵育30min；
10.42℃水浴热休克20～25min；
11.13000rpm离心30s收集酵母菌体，重悬酵母于1ml YEPD培养基，30℃摇床
孵育4h；
12.离心收集沉淀菌体，取除约800ul上清液，然后按每100 ul/板进行涨涂板。
方案二：
1、接种液体YEPD培养基，过夜培养至1-2×107
cells/ml；
2、取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约5h(OD:
0.5-
0.8)；
3、收集细胞，并用无菌水清洗，之后用1ml无菌水重悬，并转移到
1.5ml离心管；
4、1mlTE/LiAC（10×TE[
0.1 MTris-HCI,
0.01M EDTA,pH
7.5]；lO×LiAc[1 MLiAcpH
7.5）清洗细胞，然后用1×TE/LiAC重悬至2×109
cells/ml；
5、1.5ml离心管中取50u悬浮液，用1ug转化片段和50ug单链鲑鱼精DNA 混合；
6、加入300ul灭菌的40%PEG溶液，剧烈混匀；
7、30度振荡培养30min；
8、42度水浴热击15min；
9、离心5s，用1ml 1×TE重悬，适当稀释后涂布于选择培养基。
附：
电转法方案二中的处量液配制方法：
1.A液成份：100 mM LiAc，
0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH
7.5；配制量：500mL。
1.1称取
54.654g山梨醇，用适量dd无菌水溶解于500 mL容量瓶中；
1.2事先配制1 M LiAc母液，再从LiAc母液中取50mL至
1.1所述容量瓶中；
1.3事先配好1M Tris-HCl（pH
7.5），再取5mL至
1.1所述容量瓶中；
1.4用dd无菌水定量至500mL，转移至试剂瓶中，于4℃保存。
2.B液成份（母液）：1 M DTT配制量：20mL。
2.1称取
3.09g DTT，加入到50mL小烧杯内；
2.2加入20 mL的
0.01M NaOAc(pH
5.2)，溶解后使用
0.22um滤器过滤除菌；
2.3适量分成小份后，-20℃保存。
3.在使用时按每50mL菌体量用8mL处理液（A+B）。以50mL菌体为例：取A液8mL，再取80ul 1 M DTT于小三角瓶中混匀，备用。
毕赤酵母化学转化
（化学转化） 如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。 主要过程为： 取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。 LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12 000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入 50%PEG 240ml 1mmol/L LiCl 36 ml 单链鲑精DNA 25ml 线性化质粒DNA 10 ml (约10mg) 用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml YPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培养2-3天。 LiCl 转化方法 作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间 溶液： 1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。（稀释使用无菌水。） 50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存 2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。 准备感受态细胞： 1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。 2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。 3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。 4.使用最大转速离心15s，吸去LiCl上清。 5.重悬细胞于400ul体积的100mMLiCl中。 6.每个转化组取50ul细胞悬液置于1.5ml离心管中，立即使用。勿要存于冰上或冻存于 -20℃。 转化： 1.取1ml单链DNA鲑鱼精标准煮沸5min，后快速于冰上降温并存于冰上。注意：不需要 也不推荐在每次使用前煮沸载体DNA。分装冻存于-20℃，并且每使用3-4次后再次煮沸更加适宜。 2.离心上面步骤6的细胞，吸去残留的LiCl。 3.每次转化都要向细胞中顺次加入下列试剂。PEG可以保护细胞不会因高浓度的LiCl而受 到损伤。 I.240 ul50% PEG 3350 II.36 ul 1M LiCl III.25 ul 2mg/ml 单链鲑鱼精DNA IV.质粒DNA（5~10ul）溶于50ul无菌水中。
实验七 酵母菌细胞大小的测定
实验七酵母菌细胞大小的测定 一、实验目的 1.了解测量微生物大小的原理； 2.学习并掌握接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定方法，增强微生物细胞大小的感 性认识。 二、实验材料 1.菌种：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬液，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 染色标本片。 2.仪器或其他用具：显微镜，接目测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片 三、实验原理 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具—测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和接目测微尺。 镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm，被等分为100格，每格0.01mm（即10μm）。镜台测微尺不直接用来测量细胞的大小。 接目测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将接目测微尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专用的目镜，里面已经安放好了接目测微尺。 由于接目测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用接目测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定接目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的接目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。 图7-1测微尺的安装 图7-2目镜测微尺图7-3用镜台测微尺校正接目测微尺
!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
酵母转化问题参考
5 Ways to Destroy Your Yeast Transformation by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E. coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip. Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid… 1. Forgetting to add single stranded DNA While E. coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment. If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation. 2. Using old PEG PEG (polyethylene glycol) is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer. Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly. The percentage of PEG will make or break the success of your transformation; an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off. If you can stand it, make new PEG for every transformation. Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation. 3. Using cells in stationary phase Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency. This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed –only that your successful transformation rate will be much lower. Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation. 4. Using the wrong selective marker A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit. Double check to save yourself some tears! 5. Cutting corners when heat-shocking This is a major difference between E. coli and yeast transformations: while E. coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock. Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes. I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced. If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minut es, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母转化
酵母转化（By HMM） 1.取50mL YPD液体培养基于100mL已灭菌的三角锥形瓶中，从中吸取1mL培养基于已灭菌的管，挑单克隆接种于1mL YPD培养基中，吹吸混匀（可再vortex继续混匀）后转移至50mL 的YPD液体培养基中，过夜培养约11h45min； PS: 晚上21:15开始准备，21:30接种完毕开始摇菌。（30℃ 250rpm）。 2.第二天早上9:15开始准备，取出1mL菌液用于测OD600，用1mL YPD培养基作为Blank. 9:30测完。 PS: a.要求OD600在至之间。 b.测完OD后打冰盒，将ssDNA置于冰上融化。 3.将菌液分装在2支50mL离心管（蓝色，无菌）中（锥形瓶留用），2500Xg常温离心5min.弃上清于之前的锥形瓶中，各用1mL灭菌ddH2O重悬转移至管中，共水洗两次，再各用1mL 灭菌ddH2O重悬后转移至同一个5mL无菌EP管中，吹吸混匀置于冰上。 PS：a.离心期间将灭菌水置于65℃烘箱中预热，将所需平板置于30℃培养箱中预热。 b.为避免菌液浓度差异，故将重悬后的菌液混匀，因重悬后体积大于2mL，因此转移至5mLEP管中，也可在2mL EP管中混匀后分装出一部分在一个管中。 4.待ssDNA溶化后根据所需量在无菌管中分装几管，各100uL（有助于煮沸后迅速冷却）。 PS: a. ssDNA要尽量多出一些，煮沸和转移过程中均有损失。 b.看ssDNA快融化时即可打开水浴锅，中频煮沸（800即可），煮沸ssDNA时用最低频120. 5.将ssDNA沸水浴5min, 然后迅速冰浴5min; PS：a.重复沸水浴5min与冰浴5min可提高转化效率。 b.冰浴ssDNA时将50％PEG与1M LiOAc也置于冰上。 6.在超净台中配制mix，vortex混匀。
酵母感受态的制备(化学法)
1、毕氏酵母氯化锂转化法 （1）试剂 1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释） 50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装） 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用； （2）感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）； 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min； 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管； 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中； 按50ul/管分装，立即进行转化； 注：不要将感受态酵母菌冰浴； （3）毕氏酵母的转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA； 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）； 30℃水浴孵育30min； 42℃水浴热休克20～25min; 6000～8000rpm离心收集酵母菌体； 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育； 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定； 2、毕氏酵母PEG1000转化法 （1）试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存 注： 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存; 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）; （2）待转化毕氏酵母的制备
酵母菌实验报告
山东大学实验报告2009年11月日 姓名郑冲冲系年级08级生科一班组别同组者张健康于政达 学号200800140207题目酵母菌的培养、形态观察、死活鉴定和子囊孢子的观察 一、目的要求 1、掌握酵母培养基的配置和酵母菌的接种方法 2、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。 3、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的实验方法。 4、学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。 二、基本原理 1、培养基：酵母菌的能源主要是糖，一般用麦芽汁琼脂培养基培养。但实验要求不是很严格时，可以用由酵母膏、蛋白胨、葡萄糖配置的培养基来培养；但酵母菌子囊孢子的观察要用麦氏培养基，其有利于子囊孢子的形成。 2、酵母菌的形态：酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色浸片和水-碘液来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。 3、美蓝染色液：美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。 4、水-碘液染色液：该染液将革兰氏染液用碘液用水稀释4倍后得到的，亦可用于酵母形态和出芽生殖的观察。 4、子囊孢子的观察：酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，麦氏培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。 三、实验器材 1.菌种：酿酒酵母培养数天的酵母-麦氏培养基斜面 2.溶液与试剂：0.1% 吕氏碱性美蓝染液，5%孔雀绿，0.5%沙黄、95%乙醇，水-碘染液 3.培养基：酵母液体培养基，麦氏培养基。 4.仪器或其他用具：显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯、接种环等。 四、实验步骤 1、酵母培养基的配置：蛋白质2%，酵母膏1%葡萄糖2%，加冷水100Ml，自然PH，在115℃下高压蒸汽灭菌30min。 2、接种和培养：无菌操作下，在灭菌的培养基中倒入少许酵母菌液即可。在28℃下培养48h 左右。 3、美蓝染色操作： 1>在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌液，混合均匀； 2>用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，避免产生气泡； 3>将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。 4>染色开始到过30min期间，观察死活细胞数量的变化； 4、水-碘液浸片法：滴加一滴水-碘液在载玻片的中央，无菌操作挑取少许酵母菌液至于染
酵母重新转化及对照制备
酵母重新转化及对照制备(20181213) 背景： 前面酵母转化非常不顺，对照制备失败。这次置换Y2HGold菌株（from陆勇军老师实验室），重新转化相关质粒以及制备酵母筛库的对照。 实验设计： 实验流程： 1.复苏及培养酵母 1)提前三天划板(YPDA无筛选板)复苏酵母细胞Y2HGold、Y187，至30℃恒温培养箱生长3 天 2)将复苏的菌落挑单克隆至3ml YPDA液体培养基(15ml摇菌管) ，至30℃恒温摇床200rpm 摇8h 3)将5ul/10l培养物分别转入2个50mlYPDA液体培养基（250ml锥形瓶） 至30℃恒温摇床200rpm摇16-20h，至OD600=0.15-0.3 4)将培养物转至50ml离心管，室温离心700g 5min 5)弃上清，将沉淀的酵母细胞重悬，转至100mlYPDA液体培养基（250/500锥形瓶） 至30℃恒温摇床200rpm摇3-5h，至OD600=0.4 -0.5 2.制备酵母感受态 6)将上述培养物转至2个50ml离心管，室温离心700g 5min 7)弃上清，悬浮于30ml去离子水中（50ml离心管），室温离心700g 5min 8)弃上清，悬浮于3ml 1.1XTE/LIAC中，分装于两个1.5mlEP管中，每管高速离心15s 9)吸弃上清，把沉淀悬浮于600ul 1.1XTE/LIAC中 3.转化 10)在1.5mlEP管中加入相应质粒1000ng 10)加入5ul Carrier DNA（提前变性处理：95~100℃ 5min，冰上冷却） 11)加入50ul 酵母感受态细胞，温和混匀 12)加入500ul PEG/LIAC，温和混匀 13)放入30℃水浴锅30min 每15min摇一次 14)加入20ul DMSO，温和混匀 15)放入42℃水浴锅30min 每10min摇一次
酵母菌感受态制作及转化
Y187 酵母感受态制作及转化 1）挑新鲜单菌落Y187 于8 ml YPDA 培养液，30℃，250 rpm 培养16-18h；2）至OD600＞1.5，1：10 转接，此时OD600≈0.3； 3）30℃，250 rpm，4-7 h，每2 h 检测一次，直到OD600=0.4-0.6； 4）转入2 个50 ml 离心管，5100 rpm,5 min,弃上清； 5）加入1/2 V ddH2O,洗涤细胞，5100 rpm,5min,弃上清； 6）每管中分别加1 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清； 7）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；8）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；9）每管中分别加0.4 ml 1×TE/LiAc，每管100 ul 分装； 10）分别加入100 ng 左右DNA（plasmid）和0.1 mg 鲑鱼DNA（10 mg/ml,10 ul）,移液器抽吸混匀溶液； 11）分别加入600 ul LiAc/PEG，高速混匀（10 s-1 min 内）； 12）30℃摇床恢复30 min； 13）超净台（无菌条件下）加入70 ul DMSO,轻轻颠倒混匀； 14）42℃热激15 min； 15）冰上放置1-2 min； 16）14 000 rpm,15 s,去上清； 17）300 ul TE 重悬细胞； 18）100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板； 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板； 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上，30℃倒置培养48-72 h 可见转化菌落。
(完整版)酵母菌实验
7.2 用酵母菌研究一个种群 实验原理 酵母菌繁殖快，是单细胞个体，常被用来研究种群。我们将观察在试管内肉汤培养基中的酵母菌种群的生长情况。 酵母菌的种群属于封闭种群类型。在自然条件下，开放种群的大小会随着生物个体的迁入或迁出而变大变小。在开放种群中，各种物质可通过种群进行循环。但在封闭种群中，情况有些不同，测定封闭种群的增长率比开放种群的增长率要容易得多。用浊度计测定培养液的浑浊度，就能知道酵母菌种群是如何随时间而发生变化的。通过细胞计数就可以知道酵母菌细胞的数量变化与浑浊度之间的关系。 目的要求 通过实验观察，说明种群是如何随时间而发生变化的。 学习酵母菌计数的方法以及取样法。 材料用具（2人一组） 2副护目镜；2支16mm×150mm有螺旋盖的试管，每支盛有10ml无菌肉汤培养液；2支18mm×150mm试管；盖玻片；有标尺的载玻片（2mm×2mm方格）；有刻度的吸量管（1ml）;滴管；比浊计或比色计；显微镜；试管架；玻璃标记笔；米尺；4张半对数坐标纸。 实验方法 请仔细阅读实验并提出3种假设，说明种群如何随时间而发生变化。把这些假设记在你的记录本上，并用你在实验中收集的数据对它们做出评价。 本实验采用的方法叫取样法—通过对样品中的酵母菌计数以估计试管中的种群大小。还可根据试管中培养液的浑浊度获得这一估算值。 实验步骤 实验从第0天—第7天。 （一）第0天： 1、在你的记录本上画好与表2.1类似的数据表。 2、用标记笔把两支螺旋盖的试管标上A和B，并在每支试管上标上你的组别。 表2.1酵母菌细胞的数目
3、教师将把0.1ml酵母菌贮存用培养物注入试管A中，轻轻倒转试管几次使酵母细胞分布均匀。试管B不加任何东西。将试管盖稍微拧松并将两支试管放在教师指定的地方。设置试管B的目的是什么？ 4、试管A中为刚开始增长的酵母菌新种群。就下周期间你认为可能会发生的变化评论你的假设。 5、为了确定酵母菌种群的增长速率，必须在实验过程中对酵母菌进行计数。拧紧试管盖将试管A轻轻倒转几次使酵母菌细胞分布均匀，然后用滴管从试管A中取出一滴培养液移到载玻片方格上，小心盖上盖玻片，不要有气泡。在显微镜高倍镜下进行镜检。 注意：观察酵母菌细胞时光线不要太强。 6、为了计算中央方格内酵母菌细胞的数目，先将方格左上部置于高倍镜下并记下酵母菌细胞数目，接着按顺时针方向分别统计方格右上部、右下部和左下部的酵母菌数，直到把整个方格内全部酵母菌数量统计完为止。要确保你所观察到的是酵母菌细胞而不是其他的什么东西。酵母菌细胞常常粘附在一起，但可以数出任何一个分离团块中的每一个细胞，酵母菌出芽时的芽体也应算为独立的个体。 7、至少要数300个细胞，如果少于300就应在原方格周围的另一方格内进行计数，直到达到300为止。用细胞数除以方格数即可得到每方格内的平均数。 8、为了知道每立方厘米（cm3）体积(1ml)内的细胞数，可用计得的细胞数乘以2500。这是因为每方格的面积是2mm×2mm,盖玻片下的培养液厚度是0.1mm,所以每方格的体积就是 2mm×2mm×0.1mm=0.4mm3,而1cm3=1000mm3,因此：细胞数 1000mm32500×细胞数 为了知道试管A中的细胞总数，可将最终获得的细胞总数乘以10，因为试管A中含有10ml 培养液。 9、让同组的另一人对一个新样品做同样的工作，将结果写在记录本上并计算两次计数的平均值。把第0天观察到的种群大小填写在你的数据表中。 10、对试管B重复步骤5—9。 11、使用比浊计测定两试管的浑浊度。算出读数的平均值，并将第0天的平均值写入你的资料表和班长的表格中。当酵母菌种群增长时你预测会出现什么情况？把你的预测写入记录本。 （二）第1—7天 13、多次倒转试管A使酵母菌细胞分布均匀，测定浑浊度，将第1天的平均值记在你的资料表和班长的表格中，对试管B重复同样的工作。 14、分别使用试管A和试管B中的一滴培养液重复步骤5—9的计数工作，并将第1天的结果写入你的资料表和班长的表格中。
酵母转化
酵母转化方法步骤 1.YPD固体培养基 Yeast Extract：10 g；Peptone：20 g；葡萄糖：20 g；Agar：20 g 2.1M LiAc LiAc：10.2 g；加水到100 ml 高压蒸汽灭菌，4℃保存。100 mM的LiAc只需将1M LiAc稀释10倍即可。 3.50% PEG3350（50% W/V） 4.鲑鱼精DNA（2 mg/ml） i.鲑鱼精DNA：2 mg；加TE缓冲液至10 ml ii.振荡溶解后用注射器剧烈抽吸30-40次，沸水浴20分钟后马上置于冰上降温，分装100 μl到1.5ml离心管中-80℃保存。 5.SD-Trp培养基（1L, pH 6.8） 无氨基氮源（含硫胺酸）：6.7g；葡萄糖：20g；-Trp DO supplement：0.74g。调节pH，121℃高压灭菌20分钟。 酵母热激转化 1.将酵母XK1-35在YPD固体培养基划线活化，3-4天菌落长到直径大约2-3 mm 待用（菌落平板可放在4℃冰箱保存2至3周）。 2.将单菌落挑到含有50 ml YPD的100 ml三角瓶中，30℃, 220 rpm摇12 h。 3.用分光光度计测量OD值到1.0（即5×107个/ml）,吸取5ml培养液加入到含有 45 ml YPD的100 ml三角瓶中，终浓度约为5×106个/ml。 4.置于30℃摇床中，200rpm摇至OD值为0.4-0.6（即2-3×107个/ml），约用时3小 时（2.5小时测一次OD值防止浓度摇过）。 5.将OD值为0.4-0.6的培养物转移到预冷的50ml的离心管中，置于冰上冷却15 分钟，3000g离心5分钟。后面用到的试剂和仪器都要预冷，所有操作都要在冰上或者4℃。 6.倒掉上清液，加入30 ml预冷的无菌水并将酵母悬浮，同上步离心。
酵母菌发酵实验
酵母菌发酵实验 一、实验在教材中所处的地位与作用 本实验位于生物学八年级上册第五单元第五章第二节人类对细菌和真菌的利用。酵母菌在日常生活中很常用，可以用来发包子、馒头和酿酒，很具有代表性。该实验属演示实验，可直观地向学生展示酵母菌发酵现象，在实验过程中观察到液体中冒气泡，同时气球胀大，说明酵母菌发酵过程中产生了气体，与生活联系紧密，还可鼓励学生自己动手实践。 二、实验原型及不足之处 实验原型：生物学八年级上册教材P71 演示实验发酵现象在一杯温开水中加入一大勺糖和一小包酵母，进行搅拌。将这个杯子中的液体倒入透明的矿泉水瓶或玻璃瓶内，再往瓶内加一些温开水。将一个小气球挤瘪套在瓶口。将瓶子放在教室内的窗台上，每天观察瓶中的情况，看看瓶中的液体会不会冒出气泡，气球会不会胀大。 不足之处：该实验观察到液体中冒气泡，同时气球胀大，说明酵母菌发酵并产生了气体，但无法测知发酵过程中产生的是何种气体，也无法深入理解酵母菌在日常生活中的应用。 三、实验创新与改进之处 1、改用一个带橡胶塞的锥形瓶。 2、瓶口插一根“Y”形玻璃导管，排气端分别连挤瘪的小气球和橡胶管，橡胶管再连一根直的玻璃导管，橡胶管用夹子夹住。（见后图）
3、另用一个玻璃杯盛半杯澄清的石灰水，用来检测气体。 4、经过改进之后，就可以检测发酵过程中产生的是何种气体了。 四、实验器材 1、锥形瓶一个，“Y”形玻璃导管一根，直玻璃管一根，橡胶管一根，夹子一个，小气球一个，捆扎带一根，玻璃杯两个。 2、一杯温开水，一大勺糖，一小包酵母，半杯澄清的石灰水。 五、实验原理及装置说明 1、实验原理：酵母菌是兼性厌氧型真菌，喜欢含糖的环境，有氧时将葡萄糖分解成 co和水，无氧时将葡萄糖分解成酒精和二氧 2 化碳，同时都释放出能量。 2、装置如下图： 六、实验过程 1、在一杯温开水中加入一大勺的糖和一小包酵母，进行搅拌。将混合液倒入锥形瓶时，再将瓶内加一些温开水。
酵母转化PEG LiAC法
酵母转化 (一)原理： 我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。 PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。本文使用的PEG分子量为3350,实验结果表明促转化效果可以达 到103～105cfu/μg。PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜, 减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG的 浓度是务必适宜,这一点很重要。 LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA。 鲑鱼精担体DNA为短的线形单链DNA,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。 在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA打开,保证鲑鱼精担体DNA 在转化实验体系中以单链形式存在 (二)材料、仪器设备及试剂： 1.SD培养基： z YNB： 1.6g/L z硫酸铵：5g/L z氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加 z调节pH=5.8，121°灭菌15min 2.YPDA培养基 z胰蛋白胨20g/L z酵母浸膏10g/L z琼脂20g/L(固体) z腺嘌呤15ml0.2%腺嘌呤/L z调节pH=7.5，121°灭菌15min 3.0.9%NaCl（w/v） z NaCl:0.9g z milipore水定容到100ml z灭菌121°，20min 4.100%DMSO 从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存 5.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA） z Tris-HCl 1.211g/100ml z EDTA0.37g/100ml z调节pH=7.5,121°，20min 6.10×LiAc（pH= 7.5）
酵母菌的形态观察
【实验题目】 酵母菌的形态观察 【实验目的】 1.掌握酵母菌一般形态与细菌的区别 2.观察酵母菌的出芽生殖，区分酵母菌的死细胞和活细胞 3.学习酵母菌子囊孢子的观察方法 【实验器材】 1.菌种： 酿酒酵母2d麦芽汁斜面培养物 2.溶液和试剂： A) 0.1%吕氏碱性美蓝溶液、质量分数为95%的乙醇溶液、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水 溶液、蒸馏水 B）香柏油、二甲苯 3.仪器及其它用品： 普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）等 【实验原理】 ?1、单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大部分采取出芽方式进行无性繁殖，也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。 2、由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般采用美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母菌形态及出芽生殖方式。 3、采用美蓝染液水浸法可以对酵母菌的活细胞和死细胞进行鉴别。美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色，由于新陈代谢，活细胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型转变为无色的还原型，而死细胞或衰老细胞胞内还原性弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色，因此，用美兰染色后，活细胞呈无色，死细胞呈蓝色。 【实验内容及步骤】 1、酵母菌制片与简单染色--美蓝染液水浸片法 1)滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，无菌操作用接种环由酿酒酵母麦芽汁斜面培养物挑取少许菌体置于染液中，混合均匀。 2)用镊子取一盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。 3)将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据细胞颜色区分死细胞和活细胞。 4)染色30min后，再次观察，注意死活细胞的比例是否发生变化。 2、酵母菌子囊孢子的观察 1)涂片。先在洁净载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作挑取适量酵母菌菌体于蒸馏水中，混合均匀。 2)干燥固定。将载玻片在酒精灯上方来回移动，注意不要让载玻片距离火焰过近，以免烫死酵母菌细胞，可用手背反复试温度。 3)染色。孔雀绿染色 1-2min；水洗后用95%的乙醇溶液脱色30s；水洗后用番红染液复染1min；水洗后干燥。 4)镜检。将制好的装片放在显微镜下镜检，由低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。【实验结果】 1、酵母菌死活细胞鉴定
酵母电转化参数
Protocol 0342 ElectroSquarePorator PROTOCOL T820 ELECTROPORATION Cells: E. coli XL1-Blue or DH5a Plasmid: pBluescriptKS (Stratagene) Cell Preparation: Growth medium: Grow cells in SOC to OD600=0.6 Washing procedure: Wash the cells with 200ml SOC in a 2L flask. Spin the cells @ 3000 rpm for 5-10 min. each time. Resuspend in 10 ml of ice cold ddH2O (must use ice cold ddH2O, or 1 mM HEPES @ pH 7.0. The efficiencies are comparable.). Aliquot into 50-200 μl samples. Note: It’s very important to prepare competent cells carefully to not lose their competency. Both aeration and temperature control are critical. The higher quality water you use for preparing the SOC and for rinsing, the better the efficiency will be. Try to use ddH2O for everything if possible. The author suggests that the cells be thawed out immediately prior to electroporation. He also recommends that the DNA be diluted in H2O just before use. He uses 0.1ng of DNA in 0.1 μl of H2O to keep the DNA concentration @ 1 μg/ml. This is a critical point. (If SOC is not available, it can be substituted with LB plus Mg++.) Electroporation Settings: Mode: LV Choose V 500 Set Voltage: Set Pulse Length: 8 msec Set Number of Pulses: 1 pulse Chamber: BTX Disposable Cuvette 1 mm gap, P/N 610 Desired Field Strength: 5 kV/cm Electroporation Procedure: Sample Volume: 50 μl ng 1 DNA Amount: Temperature: Prechill the cuvette on ice for 1 min. Pulse: Press the Start button to activate the Automatic Charge & Pulse sequence Plate: After electroporation, immediately (< 5 sec) add 1 ml of warm SOC (37o C) to the cuvette. Transfer the sample into tubes and incubate for 45 min. @ 37o C on a shaker. Results: 2.5 x 109 cfu/μg DNA Reference: Personal communication, Dr. Masaya Yamamoto and Ha Do, University of Texas SW Medical Center, Dallas, TX ?2000, BTX Division of Genetronics, PR0342
毕赤酵母LiCl 转化方法
实验概要 本文介绍了毕赤酵母LiCl 转化方法。该程序是电转化的替代方法。转化效率为102-103cfu/ug线性化DNA。 实验原理 主要试剂 溶液准备：不能用醋酸锂，一定要用氯化锂 1. 用无菌去离子蒸馏水配制1M LiCl，过滤除菌，用无菌水稀释 2. 用无菌去离子蒸馏水配制50%PEG(3350)，过滤除菌，存于盖紧的瓶中 3. 用TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA)溶解2mg/ml 变性断裂鲑鱼精DNA，存于-20度 主要设备 实验材料 实验步骤 1. 细胞准备： 1) 在50mlYPD 中培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0(约108个/ml)。 2) 收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温1500g离心10min。 3) 去除水，用1ml 100mM LiCl 重悬细胞。 4) 将细胞悬液转至1.5ml 离心管中。 5) 最大转速沉淀细胞15s，用吸头吸去LiCl。 6) 在400ul 100mM LiCl中悬浮细胞。 7) 将50ul细胞悬浮液移到1.5ml离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或-20度保存。 2. 转化： 1) 煮沸单链DNA 5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。 注意：载体DNA不需要在每次用之前都煮，在-20 度保存等份少量样品，每次解冻一管，用3-4 次后再煮。 2) 取上面第7步中细胞，离心去除LiCl。 3) 每个转化样品，按顺序加入下列试剂，PEG 可保护细胞免受高浓度LiCl的有害作用240ul 50%PEG，36ul 1M LiCl，25ul 2mg/ml 单链DNA，溶解于50ul灭菌水中的质粒DNA(5-10ug)。 4) 剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀(1min)。 5) 在30 度孵育30min(不要摇动)。 6) 在42 度水浴热击20-25min。 7) 6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走。 8) 用1ml 灭菌水重悬细胞沉淀。