多糖的分离提取

一多糖的分离提取

传统的多糖提取方法是水提醇沉原料在90-95℃的水浴条件下溶解多糖等水溶性成分，过滤，滤液浓缩至一定体积后，利用多糖溶于水而不溶于醇的特点，将多糖沉淀出来。有文献报道，对于多糖，酸提取可将多糖含量提高。但有人经过比较，用酸提取方法得到的多糖含量与水提醇沉方法无明显差别，且操作烦琐，因此，目前较多采用水提醇沉提取多糖。

水提醇沉所获得的多糖常含有较多的游离蛋白及植物色素，为了使多糖精品具有较好的色泽和较高的给药安全性，应经过脱色和去蛋白的步骤对多糖进行精制。曾有人使用活性炭、大孔树脂及双氧水等方法进行脱色处理，但都未达到理想结果。说明多糖具有高度不均一性和复杂的物理性质，很难用传统化学方法将其纯化、脱色，应考虑采用与以往不同的更有效的方法。

多糖除蛋白多采用Sevege法。以正丁醇：氯仿（1：4）作为萃取液，加入到样品水溶液中振摇。离子法除去形成凝胶状的蛋白质，反复多次直至正丁醇氯仿层不浑浊为止。由于多糖中蛋白质有游离态和结合态两种形式，在进行脱蛋白同时还要考虑与蛋白结合的多糖的情况，因此在考察萃取效率时，还要同时检测多糖含量。

多糖的传统精制方法是使用凝胶色谱和离子交换色谱，利用分子筛效应，所用最小孔径的凝胶柱一般得到多糖纯度可达96%以上，可以大幅度提高精度。但此法对于工业化的大量粗品的精制不太适用。

有报道采用超滤膜技术可以使多糖含量提高，并达到80%以上，还可以通过条件优化和实用性设计，使之适用于工业化生产。该方法的原理是利用膜的选择性，在膜的两侧存在一定的能量差作为推动力，而溶液中各组分凭透过膜迁移速度不同而实现分离。所以，膜分离操作属于速率控制传质过程，具有设备简单、无相变、处理效率高、节能等优点。

多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作。多糖的性质往往与它的分子量大小有关，例如，多糖溶液的粘度不但随浓度的增大而升高，而且与多糖分子量大小有关。一般说来，分子量增大粘度增高。在生物学研究中，发现有些多糖由于分子量大小方面差别，所产生的某些效应有一定差异。

多糖的纯化和分子量测定常用方法有超离心法，高压电泳法，渗透压法，粘度法和光散射法等。目前较好的方法是高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）。该方法具有快速、高分辨和重现性好的优点。

凝胶色谱是一种表征高聚物分子量和分子量分布等特征的物理化学方法，一般称作凝胶渗透色谱（GPC）或体积排阻色谱（SEC）,还有称作凝胶过滤色谱(GFC)和立体排阻色谱（SEC）。其分离原理为分子筛，即按照溶质分子在流动相溶剂中的实际体积大小而分离，较大的分子先流出，较小的分子由于可以渗入填料孔隙中从而较后流出。

由于GPC有着众多优点：操作简单，所需设备简单，分离柱简单处理后即可重复使用，分离效果好，重复性高，样品回收率近100％。特别是迅速发展起来的高效凝胶渗透色谱（HPGPC），有快速、高分辨率、重复性好的显著特点，在多糖和蛋白质等大分子的研究中的运用日益增加。

二多糖的组成与结构分析

多糖的组成与结构分析主要包括以下几个方面：

1 多糖的单糖组成及其摩尔比；

2 多糖中糖苷键所取的异头碳的连接类型；

3 多糖中的结合蛋白的量及氨基酸种类；

4 多糖中糖基与氨基酸残基的连接方式。

目前应用于多糖的单糖组成研究分析方法主要有薄层色谱法，高效液相色谱法及衍生化气相色谱法等方法，其中衍生化气相色谱法是目前多糖分析中最常用的手段。

无论采用哪一种分析方法，首先都需将多糖完全水解。常用的水解方法有稀硫酸水解和三氟乙酸水解，两种方法水解方法都可以使多糖水解完全。

应用于多糖的单糖组成研究的方法中，薄层色谱法比较简单，但是灵敏度较低，有些含量低的单糖不易检测出来，利用此方法可以初步检测多糖的单糖组成。

由于糖的紫外吸收较弱，因此在用到高效液相色谱法测定多糖的单糖组成时，紫外检测器检测效果不好。可以将样品进行衍生化处理或使用如蒸发光散色检测器等通用型检测器。用高效液相色谱测定单糖的组成，由于各单糖结构相似，峰不易分开，不能达到理想的分离度，这给分析多糖的单糖组成带来一定困难。

目前，多糖的组成分析多采用气相色谱法。由于单糖的挥发性很低，所以在应用气相色谱法对多糖的单糖组成进行分析时，必须首先要进行衍生化处理以增加其挥发性。常用的衍生化处理方法有硅烷化法和乙酰化法。但如果水解后的产物直接进行衍生化处理后即进行气相色谱分析，会存在一种单糖出多重峰的现象。产生这种情况的原因应是单糖的结构存在异构体互变的现象。为了避免多重峰的现象，通常将水解后样品处理成为具有挥发性的糖腈乙酸酯衍生物或是糖醇乙酸酯衍生物。

文献报道多糖主要由葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖组成。其摩尔比根据药材来源不同有所差别，其中葡萄糖的含量基本都在50%以上。目前常用的糖苷键分析方法主要有高碘酸氧化和Smith降解，红外光谱，核磁共振等分析方法。通过高碘酸氧化和Smith降解产物，可以了解多糖中的糖苷键的连接方式。通过红外光谱，核磁共振谱可以了解糖苷键的构型（α型或β型）。通过酶解，以特定酶与多糖反应，确定糖苷键的连接。

常用的测定蛋白质的方法有Lowry法、紫外吸收法(A280,A205)和考马斯亮蓝法等。但对于多糖的蛋白含量的测定，考马斯亮蓝法是其中较好的一种。最大优点在于一些干扰Lowry 法的还原性物质对该法无干扰。且对紫外吸收法有影响的多糖溶液的浊度,也对其测定没有太大影响。同时，该方法具有灵敏度高，显色稳定，消耗样品少，重复性好且操作简便等优点。

琼脂糖凝胶电泳可用于多糖中蛋白质的检测。琼脂糖凝胶电泳广泛用于DNA的研究中,而在多糖研究中，作为纯度检测的一种方法，正以其操作简便，便于处理等优点，得到越来越广泛的应用。同时，我们还将琼脂糖凝胶电泳应用在对多糖中的蛋白结合形式的研究中，为说明多糖是一种含有结合蛋白的多糖提供了有力的证据。

通常糖肽中蛋白质与糖基之间只有N-和O-两种连接方式，N-糖肽键主要通过天冬酰胺的侧链酰胺基与糖基结合形成；O-糖肽键通过丝氨酸、苏氨酸的侧链羟基与糖基结合形成。

多糖中的N-或O-糖肽键相当于缩醛结构,因此具有缩醛的化学敏感性,遇到酸会被切断或端基异构化。同时，O-糖肽键对碱也敏感,中等强度的碱就可以通过糖的β-消除反应使多糖分解。β-消除反应后，丝氨酸和苏氨酸残基数减少的数量可反映多糖中糖肽链的可能连接点。关于多糖所含氨基酸种类及氨基酸与糖基的连接方式等方面，目前国内尚未见有研究结果报道，本论文对此进行了系统研究，并得到了初步结论。

以上是个人做过的一些工作，另外对于多糖的指纹图谱，最近也有较多的研究，可以和大家交流。