酵母扩培工艺

酵母扩大培养工艺

1、目的

规范酵母扩培作业程序，有效控制扩培工艺参数，保证培养酵母质量均一、稳定。

2.适用范围

适用于实验室、酿造车间现场扩培和锥罐扩培工序。

3.职责

由公司技术处负责编制、修改，实验室和酿造车间负责实施。

4.规定内容

4.1实验室培养

4.1.1培养基制备流程

4.1.1.1取12度生产定型(热或冷)麦汁,调整pH至

5.3-5.5,进行稀释，稀释比

例以最终煮沸浓度控制在12度为准。

4.1.1.2稀释后麦汁冷却(或加热)至40℃按每升2个蛋清搅至起泡后打入。升温

至60℃保温30分钟，保温结束后升温至100℃煮沸30分钟。

4.1.1.3检测调整浓度后过滤、分装入试管、小三角瓶、大三角瓶， 0.07Mpa

灭菌30分

钟。

4.1.1.4灭菌后培养基要贴有制备日期标签，空培(室温放置)3天以上确认无菌

后方可使用。

4.1.1.5卡氏罐培养基制备采用过滤后热麦汁装入清洗并经0．10Mpa蒸汽杀菌1

小时后的卡氏罐中0．10Mpa灭菌30分钟，提前1-2天完成，确保接种温度稳定。当天能够迅速冷却的，则取当天麦汁处理，冷却后接种。

4.1.2无菌室卫生操作流程

4.1.2.1每天对室内进行30分钟紫外杀菌。超净台用前提前打开风机及自带的

紫外灯灭菌30分钟。

4.1.2.2无菌操作前对无菌室进行全面彻底清洁。地面、墙壁、天棚及空间采用

甲醛熏蒸或75%酒精擦试。同时用紫外杀菌30分钟。

4.1.2.3卡氏罐接种，超净台无法操作时，室内空间当天再次进行上述空间杀菌。

4.1.2.4无菌室内应避免其他物品的摆放，尤其操净台面。以免破坏空气层流。

4.1.2.5每次扩培时应对无菌室内空间及超净台进行两次空气捕捉检测。斜面接

出及卡氏罐接种时各进行一次。

4.1.3实验室阶段扩培工艺流程

1.安培管(或斜面菌种)在无菌条件下,接入装10ml麦汁培养液的18×180mm

试管中，在25℃培养箱中活化培养24小时(如从安培管转接,需再活化一次).

2.将活化后的试管培养液摇均,在无菌条件下,分别接1ml入装10ml麦汁培养液的

18×180mm试管中，在25℃培养箱中培养活化24小时.

3.将试管中的10ml酵母培养液转接到装50ml麦汁培养液的150ml三角瓶

中, 在22℃培养箱中培养24小时.

4.将三角瓶中的50ml酵母培养液转接到装500ml麦汁培养液的1000ml三

角瓶中, 在19℃培养箱中培养24小时.

5.将三角瓶中的500ml酵母培养液转接到装3000ml麦汁培养液的5000ml

三角瓶中, 在19℃培养箱中培养24小时.

6.将三角瓶中的3000ml酵母培养液转接到装25L麦汁培养液的卡氏罐, 在

13℃培养箱中培养24小时～48小时.

7.将卡氏罐中的酵母培养液转接到装300L麦汁培养液的汉生罐(种子罐),

在13℃条件下培养24小时～48小时.

4.1.3.1斜面菌种挑取应在距离斜面顶部1/3处边缘部位轻挑一菌耳。液体管之

间的活化过程采取用无菌吸管吸取0.5ml注入10ml液体管内，其他接种方式为全部到入(对瓶口粘培养液的用火烤干再塞盖)。

4.1.3.2对采用软管连接进行接种时，乳胶管能够进行拉刷刷洗时进行拉刷清

洗，用前连同罐一同蒸汽杀菌或采取105℃干热灭菌30分钟后放无菌室

备用，为防止胶管老化，定期更换。不能采取拉刷刷洗时，水冲洗后用

75%酒精进行浸泡备用。连接管路进行蒸汽杀菌。

4.2现场培养

4.2.1 CIP刷洗程序

4.2.1.1罐体碱刷洗：清水冲洗(其中包括能走碱水部分)无沫后,采用片碱熔化

后配成2~3%、不低于70℃碱液循环清洗罐体30分钟.

4.2.1.2清水冲洗：清水冲洗20分钟(走碱部分),最后以PH试纸中性为准。

4.2.1.3酸洗：清水冲洗后,用1.0-1.5%的磷酸循环刷洗一次，方法同碱液刷洗。

4.2.1.4清水冲洗：清水冲洗20分钟(走酸部分),最后以PH试纸中性为准。

注：以上清洗以无酸、碱残留为准(最终以PH试纸中性为准)。

4.2.1.4 扩培锥罐执行车间锥罐CIP刷洗工艺。

4.2.2蒸汽杀菌

4.2.2.1罐体及管路、风过滤器包蒸汽杀菌

罐体及管路采用105~110℃杀菌30分钟，其中包括冲氧管、备压管杀菌、风过滤器包杀菌，杀菌结束后保压备用并用无菌风将风过滤器包吹干。罐体杀菌时排气阀、取样阀及管盘接口排放蒸汽保证杀菌20分钟。麦汁、

倒酒管路采用105~110℃杀菌20分钟。

4.2.2.2麦汁杀菌

汉生罐、扩大罐麦汁采用热麦汁，升温至100℃保温30分钟，保温结束

后保压降温至接种温度，接种前通风搅拌2分钟,锥罐采用大生产冷麦汁。

4.2.3扩培工艺流程（暂行）

卡氏罐（25L）→汉生罐（0.3KL15.0℃）———→扩大罐（3KL13.0℃）

↓

汉生罐（0.3KL15.0℃）

↓

100吨罐50KL10℃←锥罐35KL11℃←锥罐12KL11℃←扩大罐（3KL13.0℃）

锥罐追加12KL后，当酵母数达到3000-4000万个/ml后追加35KL麦汁；

当酵母数达到3000-4000万个/ml后4小时之内追加麦汁，满罐温度10℃。

注：1.麦汁浓度采用12度麦汁。

4.3保种

汉生罐迅速冷却至2-4℃保种,一次保种≤10天。

4.4其他要求

4.4.1 各级扩培罐倒空后立即清洗,清洗结束背压，超过48小时重新进行清洗，

接麦汁前进行蒸汽杀菌。

4.4.2灭菌麦汁冷却后存放时间不超过6小时，冷麦汁不超过2小时。

4.4.3各级扩培酵母数应提前预测,达到工艺标准后追加麦汁时间不超过2小时。

4.4.4风（蒸汽）滤芯清洗、更换。绝对精度0.01-0.02 um滤芯一年内更换一

次无菌风滤芯（以实际微检情况为准并参照使用说明）,粗滤、精滤及蒸汽过滤滤芯每月拆卸刷洗一次。

4.4.5扩培过程每罐酵母液进行微生物检验：细菌总数。过滤后风系统每3天检

测一次细菌总数。每一批菌种接种前的冷麦汁检一批次。

4.5培养过程酵母检测方法（包括锥罐酵母）个/ml

4.5.1 酵母数和出芽率测定方法

取洁净的血球计数板,在计算室上面加一个盖玻片,将被测的酵母菌悬浮液摇匀,用洁净的玻璃棒取少许,从盖玻片的边缘滴一滴, 使菌液自行渗入,计算室内不得有气泡,静置放一会,在600倍显微镜下观察,计算:即5个中格的细胞总数(?包括出芽细胞)和出芽的细胞数,计算方法以“计上不计下，计左不计右”为原则。

注:计算酵母数时,当细胞(芽)大于或等于母细胞1/2时,该细胞不算出芽,?而算两个

细胞,当子细胞(芽)小于母细胞的1/2时, 该细胞算作出芽的一个细胞.

4.5.2 酵母死亡率测定方法

4.5.2.1 0.01%美兰试剂配置：取0.010g美兰溶于10ml蒸馏水中,加2.0克二水

柠檬酸

搅拌溶解,再用蒸馏水定容至100ml.每3个月更换一次。

4.5.2.2死亡率测定：在洁净的血球计数板计算室上加盖盖玻片，取摇匀后待检

样品于盖玻片边缘滴入，菌液自行渗入后同法滴入0.01%美兰一滴,与之

混合后在600倍显微镜下观察细胞着色情况,已柒成兰色的为死细胞,计

算死细胞占总细胞百分率.

培养液、酵母泥检测细胞总数不少于500个。