外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤

目的基因在大肠杆菌中的诱导表达

一般程序如下：获得LI的基因一准备表达载体一将LI的基因插入表达载体中

（测序验证）一转化表达宿主菌一诱导靶蛋白的表达一表达蛋白的分析一扩增、纯化、进一步检测。

［主要试剂］

1、L B培养基。

2、lOOmM IPTG （异丙基硫代半乳糖昔）：IPTG溶于100ml ddH2O中川m 滤膜抽滤，-20°C保存。

［操作步骤］

1、通过PCR方法获得LI的基因：以含LI的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamH I和Hiindlll）, PCR循环获得所需基因片段。

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PCR反应体系为：

PCR 反应条件为：94°C变性3min；94°C变性3min> 52°C复性40sec、72°C 延伸lmin, 30个循环;最后72°C延伸8min o

2、构建重组表达载体

（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。连接反应体系为：

3、获得含重组表达质粒的表达菌种

（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5a,根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

（2）测序验证LI的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21 （DE3）的感受态细胞。

4、诱导表达

1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB （含Amp50ng/ml）中37°C过夜培养。

2、按1 : 100比例稀释过夜菌，一般将lml菌加入到含lOOmlLB培养基的300ml 培养瓶中,37°C震荡培养至OD600妥（最好，大约需3hr）o

3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度lmM

作为实验组，两组继续于37°C> 200rpm震荡培养3hr。

4、分别取菌体lml门离心12000gx30s收获沉淀，用100pl 1%SDS重悬,混匀, 70°C10mino

5、离心12000gxlmin,取上清作为样品，可做SDS-PAGE等分析。

6 5500rpm 15min 收集细胞

7溶菌酶破碎细胞制备过柱上清

8过柱纯化带组氨酸标签蛋口