蛭弧菌的生长特性及其培养条件的优化

蛭弧菌的生长特性及其培养条件的优化

韩晓宁，许少丹，袁尔东，蔡俊鹏

（华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）

摘要：为了将从海洋环境中分离得到的4株蛭弧菌发酵制备为微生态制剂，应用于水产食品安全生产，本实验研究了不同条件对蛭弧菌生长的影响。结果表明，4株蛭弧菌的最适pH 为7.1~7.4；最适NaCl 浓度为2.5%~3%；最适温度为30 ℃；二价金属离子Ca 2+浓度的提高可有效增强蛭弧菌的生长及裂解能力；4株蛭弧菌对青霉素、土霉素、氯霉素和诺氟沙星均敏感；有机污染(苯酚和尿素)和重金属离子(Pb 2+)污染对蛭弧菌的生长繁殖能力均有显著影响。并在单因素实验的基础上，运用响应面分析法确定了BDZ-100的最佳生长条件为：宿主菌浓度1×1010 CFU/mL ，摇床速度250 r/min ，培养液pH 7，温度31 ℃，NaCl 浓度3.1%，Ca 2+浓度8.5 mmol/L 。从而为蛭弧菌微生态制剂的发酵制备和应用提供理论基础。

关键词：蛭弧菌；生长特性；优化培养；微生态制剂

中图分类号：Q938；文献标识码：A ；文章篇号

:1673-9078(2009)01-0019-05

Study on Growth Characteristics of Bdellovibrio and Optimization of its

Culturing Conditions

Han Xiao-ning, XU Xiao-dan, YUAN Er-dong, Cai Jun-peng,

（College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China ）

Abstract : To prepare microecological modulator for seafood production, the effects of different factors on the growth characteristics of four Bdellovibrio strains were explored. Results showed that the best pH value, NaCl concentration, and temperature for the four strains growth were 7.1-7.4, 2.5%-3% and 30 ℃, respectively. The increase of Ca 2+ concentration can enhance their growth and reproduction rates, while organic pollutants (phenol and urea) and heavy metal ion (Pb 2+) can inhibit their growth. Besides, they were sensitive to penicillin, oxytetracycline, chloramphenicol and norfloxacin. By CCD analysis, the optimal growth conditions for BEZ-100 were as follows: the concentration of host bacteria of 1×1010CFU/mL, shaking speed of 250 r/min, pH of 7, salinity of 3.1% and Ca 2+ concentration of 8.5mmol/mL.

Key words: Bdellovibrio sp.; growth characteristics ; optimization; microecological preparation

蛭弧菌是一类具有噬菌体功能，对能导致水产业养殖病害和人类食物中毒的致病菌具有良好裂解清除效果的微生物[1,2]。蛭弧菌作为一种微生态制剂，在控制海产品源头致病菌污染方面具有广阔的应用前景。蛭弧菌的生长繁殖和裂解细菌的能力受到各种环境因素的影响。Markelova [3]研究了酚和尿素对蛭弧菌生长活性和裂解能力的影响；Fratamico 等[4]和Jackson 等[5]分别比较系统研究了温度、酸度以及蛭弧菌:宿主比例等各种因素对蛭弧菌裂解大肠杆菌的影响；Marbach 等[6]研究了盐度和温度等条件对从海洋环境中分离的数株蛭弧菌生长繁殖能力的影响；李永文等[7]则研究了温度、酸度和氯仿对蛭弧菌的影响；Bell 等[8]研究了钙离子和镁离子对蛭弧菌生长的影响。所有的研究

收稿日期：2008-07-23，改回日期：2008-08-14 基金项目：国家自然科学基金（40776091）。

通讯作者：袁尔东(1975-)，女，讲师，主要从事海洋生物技术的研究

报告均表明，温度、酸度和二价金属离子对蛭弧菌的

生长活性和裂解宿主菌能力影响显著。

尽管这些研究对蛭弧菌的生物学特性的研究已经比较深入，但考虑到蛭弧菌株间的特异性差异，不同环境中分离出来的蛭弧菌，其生物学特性必定存在差异。为了将从海洋环境中分离得到的4株蛭弧菌发酵制备为应用于水产食品安全生产的微生态制剂，本实验研究了环境温度、酸度、NaCl 浓度、二价金属离子(Ca 2+)对蛭弧菌生长活性和裂解宿主菌能力的影响，蛭弧菌对抗生素(氯霉素、土霉素、诺氟沙星和青霉素)的敏感性，同时也研究了有机污染(苯酚和尿素)和重

金属离子(Pb 2+)污染对蛭弧菌生长活性的影响。

并在单因素实验结果的基础上，采用响应面分析法(Response Surface Analysis, RSA)对各因素进一步分析，以求找到海洋性蛭弧菌的最佳生长条件，从而为蛭弧菌发酵培养，制备出高浓度蛭弧菌微生态制剂奠定理论基础。

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1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 蛭弧菌

本实验室分离纯化的四株海洋性蛭弧菌BDZ- 100、BDZ-103、BDZ-104和BDZ-105。

1.1.2 宿主菌

本实验室保存的九孔鲍幼鲍致病菌Shewanella algae strain 27。

1.1.3 培养基

2216E、DNB等培养基均按照参考文献[9]制备。

1.1.4 溶液

4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液(1 mol/L)：缓冲剂2.383 g，蒸馏水 10 mL，pH值7.2。经双层0.22 μm纤维素滤膜过滤处理后4 ℃冰箱中保存备用。

HEPES金属离子缓冲溶液：HEPES溶液100 mL，CaCl2溶液(1 mol/L) 30 μL，MgCl2溶液(1 mol/L)50 μL。于4 ℃冰箱中保存备用。

苯酚溶液(5%)，尿素溶液(20%)，铅离子溶液(100 mg/L)（采用醋酸铅），溶液经双层0.22 μm纤维素滤膜过滤处理后分装保存于无菌三角锥形瓶中备用。

氯霉素溶液(10 mg/mL)：氯霉素 10 mg，无水乙醇 1 mL。诺氟沙星溶液(10 mg/mL)：诺氟沙星 10 mg，无水乙醇1 mL。土霉素溶液(10 mg/mL)：土霉素10 mg，双蒸水 1 mL，并经0.22 μm纤维素滤膜过滤。青霉素溶液(16000 IU/mL)：青霉素(1600 IU/mg) 10 mg，双蒸水 1 mL，0.22 μm纤维素滤膜过滤。以上溶液于4 ℃冰箱避光保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 宿主菌悬浮液的制备

将宿主菌Shewanella algae strain 27接种于2216E液体培养基中，200 r/min，28 ℃的恒温摇床中培养14~15 h，使其处于对数生长期。培养液在4 ℃下，6000 r/min 离心20 min，沉淀的菌体用1 mL DNB液体培养基重新悬浮，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 蛭弧菌悬浮液的制备

在DNB双层平板中挑取单噬菌斑到50 mL DNB 液体培养基中，添加100 μL新制备的宿主菌Shewanella algae strain 27悬浮液，在28 ℃恒温摇床中以250 r/min的速度培养24 h。培养液先在4 ℃，6000 r/min条件下离心20 min，弃去沉淀，上清液再在16000 r/min条件下离心20 min，弃去上清液，沉淀用500 μL DNB液体培养基重新悬浮后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 蛭弧菌和宿主菌数量的测定方法

蛭弧菌数量的采用文献[9]中所述双层平板法测定，培养48~60 h后记录各平板中噬菌斑的数量(Plaque-Forming Unit，PFU)。

1.2.4 基础培养方式及蛭弧菌浓度检测方式

每瓶DNB液体培养基10 mL中均添加0.3 g NaCl，30 μL HEPES缓冲溶液，30 μL CaCl2溶液和50 μL MgCl2溶液，调节DNB液体培养基的pH值至7.1，再分别加入100 μL宿主菌悬浮液和100 μL蛭弧菌悬浮液。立刻取样测定蛭弧菌的初始浓度。将三角瓶置于250 r/min，28 ℃的恒温摇床中培养，分别在第1 d、2 d和3 d取样检测蛭弧菌的浓度。

1.2.5 pH值对蛭弧菌生长繁殖能力的影响

调节1.2.4中培养基的pH值分别至5.0、5.6、6.2、6.8、7.1、7.4、7.7、8.0和8.6，检测蛭弧菌浓度。1.2.6 NaCl浓度对蛭弧菌生长繁殖能力的影响

调节1.2.4中培养基NaCl含量分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%和4%，检测蛭弧菌浓度。

1.2.7 温度对对蛭弧菌生长繁殖能力的影响

将1.2.4中培养基分别置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃的恒温摇床中培养，检测蛭弧菌浓度。

1.2.8 Ca2+对蛭弧菌生长繁殖能力的影响

调节1.2.4中培养基Ca2+浓度分别为0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L、9 mmol/L和11 mmol/L，检测蛭弧菌浓度。

1.2.9 有机污染(苯酚和尿素)和重金属离子污染(Pb2+)对蛭弧菌的影响

向1.2.4所示培养基中加入不同量的苯酚溶液，使其含量分别为0%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%和0.5%，检测蛭弧菌浓度。加入不同量的尿素溶液，使其含量分别为0%、0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%和2.0%，检测蛭弧菌的浓度。加入不同量的Pb2+溶液，使其含量为0 mg/L、0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、2 mg/L和4 mg/L，检测蛭弧菌的浓度。

1.2.10 蛭弧菌的抗生素敏感性研究

1.2.10.1 定性实验

采用双层平板法将稀释过的蛭弧菌悬浮液接种于双层平板中，然后用灭菌镊子夹取待测抗生素(氯霉素、诺氟沙星、土霉素和青霉素)药敏纸片放置在平板中央，再置于28 ℃恒温培养箱中培养，在第2 d和3 d时分别观察抑菌圈直径。

1.2.10.2 最小抑菌质量浓度(MIC)测定

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向1.2.2所示培养基中加入不同量新配置的待测抗生素溶液，使其浓度分别为1 μg/mL 、2 μg/mL 、4 μg/mL 、8 μg/mL 、16 μg/mL 、32 μg/mL 、64 μg/mL 和128 μg/mL(青霉素浓度单位为Internation Unit/mL ，简称IU/mL)，避光培养检测蛭弧菌浓度。我们定义可以抑制蛭弧菌生长繁殖的最低浓度为待测抗生素的最小抑菌质量浓度(MIC)。

1.2.11 蛭弧菌培养条件的优化

根据中心组合实验设计(Central Composite Design ，CCD)原理，选取对蛭弧菌的生长繁殖能力具有明显影响的4个因素，包括pH 值(X 1)、温度(X 2)、

NaCl 浓度(X 3)和二价离子(Ca 2+)浓度(X 4)，

设计并进行相应的培养实验，研究蛭弧菌的最佳培养条件。

2 结果与分析

2.1 pH 值对蛭弧菌生长繁殖能力的影响

实验结果如图1所示，pH 值对4株蛭弧菌的生长繁殖能力有较大的影响。BDZ-100和BDZ-105在pH7.1时具有最佳的生长繁殖能力，它们的浓度对数增幅分别为3.33和3.08，而BDZ-103和BDZ-104则在pH7.4时具有最佳的生长繁殖能力，它们的浓度对数值增幅分别为3.21和2.69。

图1 蛭弧菌在不同pH 值条件下浓度的变化 Fig.1 Effect of pH on the growth of Bdellovibrio

2.2 NaCl 浓度对蛭弧菌生长繁殖能力的影响

图2 蛭弧菌在不同NaCl 浓度条件下浓度的变化 Fig.2 The largest increases in the level of Bdellovibrio at

different salinity conditions

实验结果如图2所示，BDZ-100和BDZ-103在浓度为3%时有最佳的生长繁殖能力，它们的浓度对数值增幅分别为3.22和3.02；而BDZ-104和BDZ-105则在2.5%的浓度条件下生长繁殖能力最好，它们的浓

度对数值增幅分别为3.57和3.30。 2.3 温度对蛭弧菌生长繁殖能力的影响

实验结果如图3所示，温度对BDZ-100的影响较大，而对其它三株蛭弧菌的影响相对较小。4株蛭弧菌在30 ℃时生长繁殖能力最强，在此温度条件下，它们的浓度对数值增幅分别达3.13、3.10、3.03和3.11。

图3 蛭弧菌在不同温度条件下浓度的变化 Fig. 3 Effect of temperature on the growth of Bdellovibrio

2.4 Ca 2+对蛭弧菌生长繁殖能力的影响

实验结果如图4所示，Ca 2+对蛭弧菌的生长繁殖能力有非常大的影响。蛭弧菌在没有Ca 2+存在时生长活性极弱，而当环境中有微量Ca 2+存在(浓度为0.5 mmol/L)时，蛭弧菌就表现出较好的生长活性；在浓度为5 mmol/L 时，蛭弧菌BDZ-100和BDZ-104的浓度有最大增幅；而BDZ-103和BDZ-105则在浓度为7 mmol/L 时，有最大增幅。

图4 蛭弧菌在不同Ca2+浓度条件下浓度的变化

Fig. 4 Effect of Ca 2+ concentration on the growth of Bdellovibrio

2.5 有机污染(苯酚和尿素)和重金属离子污染(Pb 2+)

对蛭弧菌的影响

结果如图5所示，有机污染对4株蛭弧菌的生长繁殖有较大的影响，苯酚达到0.02%时能显著抑制4株菌的生长繁殖，尿素浓度为0.5%能显著抑制BDZ-100、BDZ-103和BDZ-105的生长，而浓度达到1.5%时才抑制BDZ-104生长繁殖，Pb 2+浓度为1mg/L 以上时对4株菌的生长繁殖具有显著的抑制作用。 2.6 蛭弧菌的抗生素敏感性研究

实验结果如图6所示，4株蛭弧菌对四种抗生素均敏感；氯霉素对BDZ-100、BDZ-103、BDZ-104和BDZ-105的MIC 值分别为8 μg/mL 、8 μg/mL 、8 μg/mL 和16 μg/mL ；青霉素对它们的MIC 值分别为8 IU/mL 、16 IU/mL 、32 IU/mL 和32 IU/mL ；诺氟沙星对它们的

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MIC 值分别为16 μg/mL 、32 μg/mL 、16 μg/mL 和32 μg/mL ；土霉素对它们的MIC 值则分别为8 μg/mL 、32 μg/mL 、16 μg/mL 和8 μg/mL ；由此表明，在将蛭弧菌应用于水产食品安全生产时不能将其与各种抗生素混合使用，避免抗生素对其有效性的抑制作用。

图5 蛭弧菌分别在苯酚、尿素、Pb 2+

存在的环境中培养2 d 后

的浓度变化

Fig. 5 Effect of incubation in phonel, urea and Pb 2+ containing

conditions for 2 days on the growth of Bdellovibrio

图6 蛭弧菌在4种抗生素存在的环境中培养2 d 后的浓度变化 Fig. 6 Effect of incubation in antibiotics containing conditions

for 2 days on the growth of Bdellovibrio 表1 中心组合实验中的变量及其水平

Table 1 Independent variables and the levels of Central

composite rotatable design 因素

水平

–2 –1 0 +1+2X 1 pH 值 5.3 6.2 7.1 8.08.9X 2 温度/℃ 20 25 30 35

40

X 3 NaCl 质量百分比/% 1 2 3 4 5

X 4 Ca 2+浓度/ (mmoL/mL)

3 5 7 9 11

2.7 蛭弧菌培养条件的优化

根据之前的单因素实验数据，选择四个因素的五个水平如表1所示。

自变量按下式进行编码变换：

i

i i X X X x Δ?=

j

i ij i

ii i i x x b j i x b x b b y ∑∑∑∑+++=4

1

412414104

3423241312

12

42322214

32114.01.0058.0031.024.0069.039.064.158.106.259.02.017.023.062.9x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x y ?+++++????++(i=1,2,3,4) (1) 该式中x i 是自变量X i 的编码值，X 0是自变量X i 在中心点的值，ΔX i 是自变量变化步长。用软件采用标准多项式回归方法，对实验数据进行拟合，便得到描述响应量与自变量之间关系的二次多项式模型，本实验中的4因素5水平系统的模型可以描述为：

(i=1,2,3,4) (2) 该式中y 是预测的响应值，b 0是截距，b i 是线性系数，b ii 是平方系数，b ij 交互作用系数。

经软件用标准多项式回归法对实验数据分析拟合后得到如下二次回归方程：

?+=

模型的方差分析结果如表2所示，在α=0.01的水平

时，该模型回归极显著(P <0.0001)，模型的确定系数R 2=0.9850，失拟项不显著(P >0.05)，从另一个角度说明该方程对数据进行了很好的拟合，同时，相对低的变差系数值(CV=5.3%)说明整个试验具有良好的精密度和可靠性。

表2 二次多项模型方差分析表

Table 2 ANOV A for the quadratic polynomial model

变异源平方和自由度均方 F 值 Prob >F 模型 216.76 14 15.48 212.45

<0.0001

误差 1.09 15 0.073 失拟项0.98 10 0.098 4.47 0.0560纯误差0.11 5 0.022

总和 217.85 29

R 2

=0.9850 R =0.9925CV=5.3%

模型优化结果显示，当x 1=-0.06，x 2=0.13，x 3=0.07，

x 4=0.74，

即pH 值为7.046，温度为30.65 ℃，NaCl 浓度为3.07%，Ca 2+浓度为8.48mmol/L 时，蛭弧菌的生长活性最强，此时模型预测蛭弧菌浓度对数值达到9.854。为检验模型的可靠性，采用上述优化条件培养蛭弧菌，考虑到实际操作的便利，将条件修正为pH

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值为7，温度为31 ℃，NaCl浓度为3.1%，Ca2+浓度为8.5 mmol/L，实际测得的蛭弧菌的浓度对数值为10.44，与理论预测值相对误差在6%以内，因此该模型优化得到的蛭弧菌最佳培养条件准确可靠，具有实用价值，可以为将来蛭弧菌的发酵培养提供理论支持。

3 结论

本实验对命名为BDZ-100、BDZ-103、BDZ-104和BDZ-105的4株海洋性蛭弧菌的生物学特性进行了系统的研究，结果表明，其在25~35 ℃、pH 6.8~8.0的范围内均有很好的生长繁殖能力，最适温度为30 ℃，BDZ-100和BDZ-104的最适pH为7.1，BDZ-103和BDZ-105的最适pH则为7.4；NaCl 浓度的影响较小，最适浓度为2.5%~3%；二价金属离子(Ca2+)对蛭弧菌具有非常显著的影响，没有Ca2+存在的环境中，4株蛭弧菌均不具有生长繁殖能力，Ca2+浓度的提高(在0mmol/L-7mmol/L的范围内)可以有效增强蛭弧菌的生长活性。苯酚浓度为0.02%时能显著抑制所有4株蛭弧菌的生长繁殖，Pb2+浓度达到1 mg/L时，它们的生长活性均显著下降，尿素浓度为0.5%时，蛭弧菌BDZ-100、BDZ-103和BDZ-105的生长活性显著降低，而当浓度达到1.5%时才会显著抑制BDZ-104的生长。

4株海洋性蛭弧菌对青霉素、土霉素、氯霉素和诺氟沙星均敏感，青霉素对BDZ-100、BDZ-103、BDZ-104和BDZ-105的MIC值分别是8 IU/mL、16 IU/mL，32 IU/mL、32 IU/mL；土霉素对它们的MIC 值则分别为8 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL和8 μg/mL；氯霉素对它们的MIC值分别是8 μg/mL、8 μg/mL、8 μg/mL和16 μg/mL；诺氟沙星对它们的MIC值分别为16 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL和32 μg/mL。因此，在未来将蛭弧菌制剂应用于水产食品安全生产时，需要特别注意抗生素对蛭弧菌的影响。

在单因素实验基础上，运用响应面的分析方法对海洋性蛭弧菌BDZ-100的培养条件进行了优化，确定了其最佳生长条件：宿主菌浓度为1×1010 CFU/mL ~1×1011 CFU/mL，摇床速度为250 r/min，培养液pH 值为7，培养温度为31 ℃，NaCl 含量(NaCl)为3.1%，Ca2+浓度为8.5 mmol/L。在该培养条件下，当BDZ-100的初始浓度约为2×102 PFU/mL时，经过1 d的培养，其浓度可达到2.75×1010 PFU/mL。该结论为将来蛭弧菌的发酵制备提供了理论基础。

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