土霉素发酵工艺

1 引言

生物工程产品工艺学课程设计，一方面要求综合应用生物、发酵工程、代谢控制发酵工程和CAD制图等课程的理论知识，以掌握微生物发酵中常见的代谢控制方法、产品工艺的设计方法以及设计步骤，另一方面又要根据设计对象的具体特征，凭借设计者的经验（或者借鉴前人的经验），了解设计的诀窍，对设计参数等做合理的选择和优化，这往往成为设计能否成功的关键所在，也是设计区别于习题的重要方面。

1.1 土霉素发展现状

在上世纪60～70年代，土霉素曾经在我国抗菌药市场上占据着重要位置，但自80年代中后期起，土霉素的市场就开始逐渐下滑，大批企业先后放弃了生产。21世纪初，全国土霉素产量已从20世纪80年代的2万吨下降到12000吨，目前的产量已不到1万吨，生产企业从几十个减少到只有几个。目前主要生产企业为XX华曙制药、XXXX制药、XX星火制药等。其中XX华曙制药的规模和产量最大，达6000吨左右，约占世界总产量的1/4。

随着土霉素产量的不断下降，出口量也逐年减少，出口价格一路走低。1995年，我国土霉素出口价格为11.5美元/公斤，1998年为10美元/公斤，2000年已降到7美元/公斤。近年来，出口量和出口价格还在下滑。在国内市场上，土霉素除了作为生产强力霉素等的原料外，主要用于畜禽药物以及饲料添加剂，临床用药微乎其微。在发达国家，土霉素已基本不再使用，发达国家畜牧业中用的也是纯度高的无菌土霉素。我国生产的土霉素大部分为低档产品，未来几年出口形势将十分严峻。

1.2 土霉素的应用

（1）土霉素为四环类抗生素，生产工艺简单、生产成本较低，可作为生产其它新型抗生素的原料。

（2）土霉素价格低廉，可以作为饲料添加剂用于养殖业。实践表明：土霉素用于饲料添加剂，可以改善饲料转化效率，促进畜禽生长，提高畜禽抗疾病能力。

（3）土霉素是广谱抗生素，对多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌作用。临床上主要用于肺炎，败血症，斑疹，伤寒了，淋巴肉芽肿，砂岩及其他细菌

性感染等，对伤寒有效，也可用于阿米巴痢疾和阴道滴虫病患者。此外还能抑制立克次体和砂岩病毒及淋巴肉芽肿病毒。

2 土霉素及发酵微生物介绍

2.1 土霉素化学式及性状

土霉素又名氧四环素，化学名是：(4s,4аR，5S，5аR，6S，12аS）-N-4-二甲胺基-1，4，4а，5，5а，6，11，12а-八氢，5, 6，10，12，12а- 六羟基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，为灰白色至黄色的结晶粉末，无臭，味苦，熔点是180℃，在空气中性质稳定，在日光下颜色变暗在碱性溶液中易破坏失效。土霉素的盐酸盐为黄色结晶，味苦，熔点190～194℃，有吸湿性，但水分和光线不影响其效价，在室温下长期保存不变质，不失效。盐酸盐易溶于水，溶于甲醇，微溶于无水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性条件下不稳定。添加到饲料中，在室温下保存四个月，效价下降4%～9%，制粒时效价下降5%～7%[1]。

土霉素化学式：C22H24N3O9，R=H，R'=CH3，R''=OH，齐结构示意图如图1-1所示：

图1-1

2.2 作用机理

（1）改变致病微生物的结构和干扰其代谢过程，如阻碍细胞壁的合成，影响细胞黏膜的通透性，阻碍蛋白质的合成，改变核酸代谢。

（2）能抑制动物肠道内的有害微生物，激活大肠中有利于营养物质合成的微生物。

（3）土霉素可使动物肠壁变薄，更有利于营养物质的吸收和利用，从而提高肠道吸收效率。

2.3 发酵微生物

土霉素是由龟裂链霉菌产生的，属于放线菌中的链霉菌属，他们具有良好的菌

丝体，菌丝体分支，无隔膜，直径约0.4～1.0米，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝之分，孢子丝再形成分生孢子。

而龟裂链霉菌的菌落呈灰白色，后期生褶皱，成龟裂状。菌丝成树枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。

3 土霉素生物合成的代谢调控

土霉素属于四环素类抗生素，是一大类广谱抗生素，他们的化学结构中都含有二甲氨基，酰胺基，酚羟基和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统，即都含有氢化直骈四苯的基本结构，具有共同的碳架。四环素类抗生素生物和成及调控过程中，起始的化合物是丙二酰胺辅酶A，它同8个丙二酰辅酶A分子重复缩合脱羧，形成一个直链化合物—β-多酮次甲基链，然后经过重复闭环等反应，形成四环素类抗生素。土霉素代谢调控机制的控制主要有磷酸盐的调节作用、ATP的调节的调节等

[2]。

3.1 抗生素的生物合成与糖代谢途径的关系

在某些抗生素发酵过程中，不同时期的糖代谢途径是不同的。从菌体生长期转变为抗生素分泌期，糖代谢途径也发生变化，可见，抗生素的生物合成与糖代谢途径有着一定关系。

四环类抗生素这类聚酮体衍生物的合成，需要还原型辅酶Ⅱ（NADPH），而且NADPH还可能是限制因素，它的浓度大小决定体外醋酸盐进入聚酮体或脂肪酸的数量。但是，NADPH又只是来自戊糖循环，该循环的酶活性的强弱直接影响NADPH 的产量，因此，过量的磷酸盐或通气会严重干扰土霉素的合成，使产生NADPH的戊糖循环受阻。

3.2 抗生素的生物合成与三羧酸循环、脂肪酸代谢的关系

已知四环类抗生素的碳架，是由乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A合成的。这些前体物质是糖代谢的中间体或衍生物，凡是影响合成抗生素的前体物质形成的反应，都会影响抗生素的生物合成。有些前体物质，不仅可供合成抗生素之用，还可进入三羧酸循环等初级代谢途径而被消耗。乙酰辅酶A既可与草酰乙酸反应形成柠檬酸，然后进入三羧酸循环而被氧化，又可以形成脂肪酸和聚酮体，因此成为代谢途径中的三岔路口，随着菌体代谢机能的差异而调节它的代谢途径。

还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的不足可能是产生菌选择合成四环素的途径和停止合成脂肪酸的主要原因。因此，从能量的观点来看，利用丙二酸单位来合成土霉素，对产生菌是有利的。

3.3 抗生素生物合成与生物能量的关系

目前认为，细胞的ATP（或EC）很可能是控制抗生素合成基因表达的一种效应剂，低水平的ATP可能是发酵单位的标志，高水平的ATP可能抑制抗生素的形成。

3.4 抗生素发酵的代谢调控图（见附图1）

4 土霉素发酵工艺

4.1 菌种的选育与制备

用微生物发酵方法生产抗生素，首先要有一个性能良好的菌种，从自然分离的野生菌种由于生产能力低，往往不能满足工业上的需求。所以工业上常用的菌种都是经过人工选育，具备工业生产要求，性能优良的菌种。本设计中，土霉素发酵生产菌株为龟裂链霉菌，属放线菌。

4.1.1 标本采集

土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耗作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多。采土时先用小铲除去表土，取5～15cm深处的土样，选好3～5点，每点取土10g混在一起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间、地点、植被等情况，以备考察[3]。

4.1.2 标本的预处理

由于土霉素产生菌龟裂链霉菌属放线菌中的链霉菌属，又由于放线菌的孢子（如链霉菌）更加耐热，所以常采用热处理方法减少材料中的细菌数。

取到的菌样在用土壤、根土组成的培养基中富集培养。要求：9cm 直径平皿培养，加入35～45ml培养基，培养基温度在100℃培养1h或40℃培养2～6h。待培养基上长出菌落后，依据龟裂链霉菌菌落外观标准判断。

龟裂链霉菌菌落外观：菌落较小而致密，不易挑取，菌落呈皱状裂纹。孢子丝初旋至螺旋形。孢子长圆形至柱形，表面光滑。由此可断定为龟裂链霉菌。

4.1.3 所需菌种的分离

筛选抗生素生产菌的方法包括抑菌圈法、稀释法、扩散法、生物自显影法等。

本设计采用稀释法，稀释法又可分为液体稀释法和固体稀释平板倾注法。这里采用后者。先将待分离的材料作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1: 10000……)，然后分别取不同稀释度的溶液少许，与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合摇匀后，倒入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌或微生物繁殖而成的，随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

4.1.4 菌种的培养

以麸皮、琼脂作为天然培养基，在37℃保温箱中培养，至培养基中部分出现成熟颜色即可进行保藏。

4.2 诱变育种

从自然环境中分离的菌种的生产能力有限，一般不能满足生产的实际需要。诱变育种是提高菌种的生产能力，使所需要的某一特性的代谢产物过量积累的有效方法之一。

诱变育种的理论基础是基因突变，一般包括诱变和筛选两个部分，诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到获得高产菌株。

4.2.1 出发菌株的选择

用来进行诱变的出发菌株的性能对提高诱变效果和效率十分重要，诱变出发菌株要有一定的目标产物的生产能力。由于野生型菌株生产性能较差，通常采用经历过生产条件考验的菌株，这样的菌株队诱变剂的敏感性会有所提高。

4.2.2 菌悬液的制备

在诱变育种中，所处理的细胞必须是均匀状态的单细胞悬液。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。有时，虽然处理的是单核的细胞或孢子，但由于诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变无法反映在当代的表型上。由于上述原因，故在诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子。

在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠震荡

5min，来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤，得到分散菌株。菌悬液介质一般用生理盐水。

4.2.3 诱变剂处理

诱变包括物理、化学、生物诱变，本设计利用物理诱变，方法及步骤如下：紫外线诱变处理：将制备好的菌悬液于无菌培养皿中，置波长为253.7nm，15W的紫外灯下60cm处开盖，进行振荡照射。

4.2.4 突变菌株的筛选

诱变处理后，正向突变的菌株通常为少数，需进行大量的筛选才能获得高产菌株。在抗生素生产菌的选育中，应筛选抗生素抗性突变株。

初筛：选用适合于抗生素产生菌的抑制圈法进行初筛。待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。方法：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4～5天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。选择抑制圈大的菌落接入斜面备用。

复筛：将经过初筛后的少数菌株接种于增殖培养基中培养13小时后，接种于锥形瓶发酵培养基中进行往复式摇床震荡培养，即得到药瓶种子。

4.3 菌种保藏

菌种的保藏方法有：斜面菌种低温保藏法、沙土管干燥保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法等[4]。本设计采用砂土管干燥保藏法，这种保藏法适用于产生孢子的真丝状真菌和放线菌，或形成芽孢的细菌。

4.3.1 保藏原理及沙土管制备方法

沙土管干燥保藏法的原理是造成干燥的寡营养条的保藏条件。

制备方法：首先将沙和土分别洗净烘干并过筛（一般沙用80目过筛，土用100目过筛），按沙与土比例1～2：1混合均匀，分装于小试管中，分装高度约为1cm 左右，121℃高压间歇灭菌2~3次，无菌实验合格后烘干备用。

4.3.2 保藏方法和操作步骤