生物化学综合实验

实验目的：

1、了解评价大米质量的一般简单方法；

2、掌握分光光度计测吸光值的方法。

实验器材：

1、电饭煲，一次性筷子和纸碗1；

2、250ml烧杯，100ml量筒，玻璃棒；100ml容量瓶；直尺10个（或坐标纸也可以），培养皿，长100mm，内径11.0mm的标准试管（或其它小刻度的标准试管）；

3、水浴锅，分析天平，可见分光光度计，粉碎机；

4、4种大米：湖南籼米、苏北大米、五常香米、东北粳米；

5、NaOH，KOH，碘，碘化钾，冰醋酸，95%乙醇，直链淀粉，支链淀粉，百里酚蓝指示剂。

实验原理：

大米的硬度主要是由蛋白质含量决定的，硬度越强，蛋白质含量越高，透明度越高。反之，蛋白质含量较低的米含水量高，或是用不成熟的稻制的米，透明度差，米的腹部不透明，垩白较大。米最易变为黄色，其主要原因是某些营养成分发生了化学变化。发黄的米，其香味、口感、黏性、营养价值都较差。

淀粉与碘形成碘－淀粉复合物，并具有特殊的颜色反应。支链淀粉与碘生成棕红色复合物,直链淀粉与碘生成深蓝色复合物。在淀粉总量不变的条件下，将这两种淀粉分散液按不同比例混合，在一定的波长和酸度条件下与碘作用，生成由紫红到深蓝的一系列颜色，代表其不同直链淀粉与支链淀粉含量比例，根据吸光度与直链淀粉浓度呈线性关系，可用分光光度计进行测定。

碱消值系指大米在1.7%KOH溶液中30℃浸泡23h，米粒解折程度。碱消值可以代表糊化温度的相对高低。

不同品种的淀粉胶在冷却时具有不同的粘稠性。定量的冷却米胶在水平试管中在一定时间内其延伸的长度不同。通过测量米胶的延伸长度从而确定相应的胶稠度。

盐溶蛋白谱带不同水稻品种之间表现多态性，利用蛋白质电泳技术就可检测出不同不同水稻品种的盐溶蛋白谱带。

实验步骤:

（一）、大米外观品质分析

1、看色泽，是否是精白色或淡青色，有无光泽，是不是呈半透明的角质米；

2、看形态，颗粒是否整齐、均匀，表面是否光滑，组织是否紧密完整；

3、看碎米粒和杂质是否超标；

4、看有无黄粒米、霉变粒和病斑粒。这些指标虽然重要，但只是大米的外

观形态，只有闻才能嗅出大米的品质。

（二）、米饭的蒸煮

1、水洗与浸米

2、加水量新米加水量一般是米容积的1.1倍，陈米一般是1.2～1.3倍；

3、加热用电饭煲煮饭；

4、品尝米饭的口感和味道并给出评价。

（三）、稻米直链淀粉含量测定（标准碘比色法）

1、用米粉机将稻米碾成米粉。称取米粉样品2g，置于100mL容量瓶中，加入1.0mL 95%乙醇，轻摇容量瓶，使样品湿润分散，加入9.0mL 1.00mol/L的氢氧化钠溶液，使碱液沿颈壁缓慢流下，旋转容量瓶，使碱液冲洗粘附于瓶壁上的样品。将容量瓶置沸水浴中煮10min后取出，冷却至室温后加蒸馏水定容。吸取5.0mL样品溶液，加入已盛有50mL蒸馏水的100mL容量瓶中，再在这一容量瓶中加入1.0mL 1.00mol/L的乙酸溶液，使样品酸化，加入1.50mL碘液，充分摇匀。用蒸馏水定容，静置20min。以5mL的0.09mol/L的氢氧化钠溶液代替样品，配制空白溶液。用空白溶液于分光光度计波长620nm处调节零点并测出有色样品液的吸光度值

2、称取与待测样品保存在同样的条件下三天以上的高、中、低已知直链淀粉含量的标准样品各0.1000g，用上述改进简化法与待测样品同时进行测定。以标样的直链淀粉为纵坐标，以相对应的吸光度为横坐标，绘制标准曲线或列出曲线的回归方程式：

Y=a + b×x

（四）糊化温度的测定（碱消法）

1、取6粒成熟饱满的整精米置于培养皿内，加入10.0mL 1.70%氢氧化钾溶液，使米粒浸没，米粒彼此有一定间隔，盖好盖子。

2、将培养皿平稳移至30±2℃的恒温箱内，保温约23h，再平稳地取出。逐粒观察米粒胚乳的分解情况，进行分级记录（以分解度为主）。

（五）、胶稠度的测定

1、称取4种米粉各0.1000g，置于试管内，加入0.20mL百里酚蓝指示剂，并轻轻摇动试管，使样品充分湿润分散。

2、准确加入0.200mol/L氢氧化钾溶液2.0mL，并摇动试管，使米粉充分

混合均匀。

3、混匀后立即放入沸水浴内，用保鲜膜盖住试管口，调节水面高度，使沸

腾的米胶高度始终维持在试管长度的三分之二左右，糊化时间为8min。

4、取出试管，去除保鲜膜，在室温下冷却5min。将试管在冰水浴中冷却20min。

在室温25±2℃下，将试管平放在水平台上。1h后，量出试管底至冷胶前沿的长度，以毫米表示，即为样品的胶稠度。

（六）、大米盐溶蛋白的测定

1、盐溶蛋白提取单粒研磨, 加盐溶蛋白提取液( 0.05 mo l· L- 1Tr is-HCl 缓冲液) , 4 ℃提取 2 h, 离心( 4 ℃ , 15 000 r·min- 1 , 15 -20min) , 取上清加入1mL 丙酮( 含10 mmol·L- 1B-Me) , 然后放置于- 20℃的冰箱内 1 h, 使蛋白充分沉淀, 离心收集蛋白, 除去丙酮溶液, 沉淀的蛋白再用80% 丙酮溶液洗涤2次后置于- 20℃下, 使丙酮完全挥发。加入样品缓冲液溶解, 沸水浴煮5 min, 离心, 取上清用于蛋白电泳分析。

2、先知分离胶，灌胶后凝固后（20-30 min），制浓缩胶，灌胶后立即插梳子，凝固后（20-30 min）即可电泳。

点样：样品和上样缓冲液混合后，变形5 min（95-100℃，每孔点20uL。

电泳：V=75，I=65

溴酚蓝移动到前沿1-2cm处时，停止电泳，剥离胶，染色2-3h,脱色至胶的本底无色。

照相保持

实验数据和结果：

（一）、大米外观品质分析

外观品质分析记录表

（二）、米饭的蒸煮

的硬度最大，从品尝的结果发现湖南籼米的口感最差，五常香米的口感最好。但之结果也与煮饭时大米与水的量有很大的关系，应让同一个人按一定的比例加米加水，这样实验结果才能更准确！

（三）、稻米直链淀粉含量测定

Y ?????????

X ???????

Y=-0.11911+0.07628

实验结果值与实际值相比小很多。

养皿中即可，但是要选择成熟饱满的没有垩白的米粒，才能保证实验的准确性。且在将培养皿移至恒温培养箱时注意不让米粒移动，防止米粒粘粘在一起，影响实验结果。

（五）、胶稠度的测定

大差异，基本相近。

实训小结

这学期我们进行了为期一个星期的生化实验实训。在这一个星期内我们做了有关4种大米的各种测定，从直链淀粉含量、糊化温度、胶稠度和香型等方面衡量大米的品质。

我国是人口大国，同时也是一个稻米生产和消费大国，虽然曾经我们在水稻的产量上获得了很大的突破，但在水稻品质上还相对落后。然而，广大消费者最关心的还是稻米蒸煮食味品质。

第一个实验，我们从大米外观品质分析了湖南籼米、苏北大米、五常香米、东北粳米4种大米。在随取取得的每种大米的样本中找出其不完善粒、碎米、垩白粒、黄米粒、和大米的水分。发现苏北大米的含水量最多，湖南籼米的含水量最少。这一结果与第二次实验米饭蒸煮与品尝的结果相一致，含水量越多的大米越软。

在测定大米直链淀粉的含量时，由于容量瓶不够，实验进程很慢，花费了很多时间。稻米直链淀粉的含量与米饭的粘性、光泽等食味鉴定值、淀粉糊化等特性值关系密切，含量越高米粉越硬、口感越差。糊化温度则是确定谷子食味及蒸煮的品质好坏的另一标准。糊化温度依品种而异，糯稻低，籼米高，通常通过碱消值或碱解值的大小来衡量。

总的来说，这次实训由于人多，实验仪器不够，使得实验进程浪费了很多时间。尤其是最后一个实验花费了一天半的时间，配试剂需严谨，精确才能保证实验的成功。通过同学们的协同合作，实验获得较为理想的结果。