病原物的分离培养和纯化

病原物的分离培养和纯化

摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。

关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基

目的意义

在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。

1材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试材料

新鲜山茶树真菌病叶叶片

1.1.2 试验仪器与用品

真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。

1.2 试验方法

1.2.1试管的制作

用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。制作这样的试管两只。

1.2.2 PDA培养基的制作和灭菌

1.2.2.1 PDA培养基的制作

将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（发霉、变绿的不要）切成小方块，称取200g，倒入锅内，加水1000m L煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻璃棒不断搅拌，以免烧焦锅底。再加入葡萄糖10g，琼脂20g，最后加水补足至1000mL。融化后在铁架台上趁热放入试管中，然后斜放制作斜面。

1.2.2.2 PDA培养基和试管的灭菌

将装有PDA的试管和培养皿用高压锅蒸汽灭菌，125℃下30min。冷却后备用。

1.2.3 病原真菌的分离培养

1.2.3.1 病叶剪取

取山茶树新鲜病叶，选择典型的单个病斑，用剪刀剪取病健交界处的病斑小块（3mm×3mm）数块。

1.2.3.2 真菌的分离培养

用酒精棉球将接种箱内部全部擦洗干净，放入试管架、酒精灯、标签、接种铲、笔、火柴、病叶组织等试验用具放入接种箱内，密封接种箱。依次打开接种箱与无菌室的紫外灯，紫外线灭菌20分钟。用肥皂洗手后在无菌操作台内用

酒精喷洒手上，灭菌，待酒精干燥后开始分离操作。培养皿先在火焰处旋转几周后，在靠近火焰处打开培养皿一条缝，倒取真菌培养液于灭菌后的培养皿上，制作真菌培养基。然后再在火焰处旋转灭菌。

将剪取的病叶组织放入70%酒精消毒3～5s后（消除寄主表面的气泡，减少表面张力），按无菌操作法将病组织移入0.1%升汞液中进行表面消毒，消毒时间做四个梯度：分别为10s、15s、20s、25s，然后放入无菌水中连续漂洗三次，出去残留的消毒剂，最后放在无菌纸上，吸去病组织表面多余的水分。

用无菌操作法将病组织移至平板培养基中，每皿放四块，即消毒时间的四个梯度。做好标记（姓名、材料、消毒时间等）。将培养皿倒置放入25℃左右的恒温箱内培养。前两天主要观察是否被细菌污染，3～4d后观察待分离菌生长结果。

1.2.4病原真菌的纯化

4d后菌落长出，观察分离的四个病叶组织处真菌菌落的特征，然后在无菌台上进行纯化。

在无菌条件下，用接种铲从菌落边缘挑取小块移入斜面试管培养基上，在25℃左右的恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况。

2 结果与分析

4d后，观察分离培养后的两个PDA培养皿发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。因此可以看出这种真菌的生长周期短。用升汞液处理的四个梯度长出了单一的大小不等的菌落，但用升汞液处理15s的菌落单一而且最大，无杂菌感染，生长良好，因此15s的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。观察到菌落之间无连接和交叉感染，证明无杂菌的污染，并且四片病叶组织位置合理。通过对四个方向上都长出了菌落的培养皿上四片病叶组织处菌落的观察发现，同一个培养皿中的四个菌落有三个呈白色、疏松，能够观察到疏松的菌丝。另外一个菌落呈很淡的黑色、半径略小些，菌丝较疏松。将这两种菌落用两个含有PDA培养基的试管接种，并用于进一步的鉴别。另一个PDA

培养皿中长出的两个菌落都呈白色、疏松，能够观察到疏松的菌丝。把消毒时间为15s的菌落接种到两支斜面试管培养基上纯化，但是都被细菌污染而失败了。

3 讨论

在整个分离培养和纯化过程中，无菌操作是实验成败的关键。一个PDA 培养基上有两个方向什么也没有长，原因可能是剪取的叶片部位没有受到真菌感染，病斑可能是其他非生物因子引起的。或者是消毒的时间过长，杀死了所有的菌物。另一个都长有菌落的PDA培养基，消毒时间为15s时的菌落，不仅单一而且生长良好，无杂菌污染，因此，15s对于这种山茶真菌病毒的消毒来说最为合适。其他三个时间的菌落，生长也比较良好，其中消毒时间为10s时的菌落有一些小污染，但结果整体也还不错。两支斜面试管培养基的纯化都失败了，原因可能是接种时，接种铲或者斜面试管培养基受到细菌的污染。