肿瘤细胞培养技术
肿瘤细胞培养技术
肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁
最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的
作用。
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性
肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体
外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点: (,)形态和性状
培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌
细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
(二)生长增殖
肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生
长的因子，而癌细胞在低血清中(2,,5,)仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能
在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落(克隆)的能
力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
(三)永生性
永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡(Apoptosis)。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反
证它在体内时同样如此,也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实
上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛;经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞
培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永
生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat,1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性(包括浸润性)是两种性状，受不同基因调控，但却有相
关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。
(四)浸润性
浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜
生长的能力。
(五)异质性
所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织;处于瘤
体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞
(Stem Cells)、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖;把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。
(六)细胞遗传
大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不
断进行着适应性演变。
(七)其它
肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于:?依赖性:肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是
肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关
系，可能影响癌细胞增殖生长的活性;?肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力;?
并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少;?离体培养肿瘤细胞可能需
求与体内相似的特殊生存条件。
二、培养方法
肿瘤细胞培养成功关键在于:取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与
正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。(一)要点 1(取材:
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选
活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4?中，但不宜栽过24 小时。
2(培养基:
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血
清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤
细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子;肿瘤细胞与
正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因
子〔如乳腺癌细胞等)。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。 3(成纤维细胞的排除:
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此
排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法(表2,1)。
表2,1 抑制成纤维细胞生长因素方法因素组织细胞
选择性附着
选择性附着底物
汇合饲细胞层
选择性培养基
胰蛋白酶
胶原酶
聚丙烯酰胺
聚四氟乙烯(Teflon)
胶原(猪皮)
小鼠3T3
人胎小肠
D-缬氨酸(Valine)
MCDB-710
MCDB-153
Phenobarbitone 胚胎小肠、心肌、表皮
乳癌
各种肿瘤
转化细胞
表皮细胞
表皮
正常和恶性乳腺上皮
结肠癌
肾组织
乳腺
表皮
肝细胞
注:上表结果为个别实验室经验，仅供参考 (二)成纤维细胞排除法
1(机械刮除法:
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中
高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为:
(1)标记:镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位;
(2)刮除:弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间;
(3)用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞;
(4)注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止
2(反复贴壁法:
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬
液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
(1)待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液;
(2)取编号为此A、B、C三个培养瓶;首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5,20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角
后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后;向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养; (4)培养B瓶中细胞5,20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中;再向B瓶中补加完全培养基。
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌
细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3(消化排除法:
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是:
(1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02,EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和
不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化;
(2)把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养;向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，
成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
4(胶原酶消化法:
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
(1)可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化;
(2)用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
5(其它方法:
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用;也有人用聚蔗糖制备成比重1.025,1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23?
中800g离心 10分种。在比重1.025,1.050层为成纤维细胞，在比重
1.050,1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化
学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。 (三)提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施
根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现以下几种情
况:
完全无细胞游出或移动;
有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代;
有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡;
传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获得好的培养效果，不能局限于一般培养
法，必须采用一些特殊的措施。
1(适宜底物:
把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。
2(生长因子:
应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、
雌激素以及其它生长因子。
为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞(干细胞)的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培
养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。
3.动物体媒介培养方法:
(1)瘤块接种:取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成1,3毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺
入皮下，注入瘤块;
(2)饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织;
(3)进行体外培养。
(4)为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。
肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同，但成功率比正常细胞高。
(四)体外培养肿瘤细胞生物学检测
一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系(或株)后，不论用于实验研究还是建立细胞系，都需要做一系列的细胞生物学
测定，主要的目的在于求得证明:
所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。测定项目数量无
明确规定，根据需要而定，以下为常做的项目和要点。
【形态观察】主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
【细胞核型分析】检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
【凝集试验】检测凝集力。
【软琼脂培养】检测集落形成能力。
【异体动物接种】向异体动物体内(皮下)接种细胞悬液，观察成瘤能力。
【其它】除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。在上述肿瘤细胞生物学检测中，最主要的为:异体动物(以用裸鼠为上)接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。
当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测，这些项目将在本书第二篇中介绍。 (五)对肿瘤细胞系或细胞株的评价
已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。但根据
研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。众所周知，长
期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变
动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例，都已传代少则几十，多则百代以上后，才确认建成了细胞系。这种情况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。已如前述，癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去，凡已长期传代的细胞系，都已获得不死性。当前尚未完全确证所有
癌细胞都具有不死性;因此尚难肯定在长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内时仍完全相同(包括不死性)。据上述对用癌细胞系所获实验
结果应尽量做分析性的结论，避免做概括性的与体内等同的结论，外推与体内等同更是不妥的。广泛来说，应用各种较长时间培养细胞做实验
时，都应如此。
肿瘤细胞培养方法和培养基
肝癌细胞培养 一、培养基 1、RPMI-1640+10%胎牛血清培养基 2、DMEM+15%胎牛血清培养基 成分表
二、实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用 3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。 三、细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。 （2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s 内完成。 （3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。 （5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。 （6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。 四、细胞传代： 当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 （1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。 （2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。 备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。 （4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。 （5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。 （6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。 （7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法 09级生科3班余振洋200900140156 一、【实验原理】 1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物： 恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。 8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。 2．关于筛选方法： 下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。 1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。 2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染 FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA
细胞培养基本方法.docx
1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?
(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式
肿瘤细胞培养(完整版)
第6章肿瘤细胞的培养 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点： (1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物 因素对肿瘤细胞生命活动的影响。 (2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究 癌变的发生机理； (3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。 (4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。 (5)研究周期短，比较经济。 但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。 一、肿瘤细胞培养的生物学特性 1、形态和性状 形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。 2、生物特性 癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。 3、永生性 永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。 4、侵润性 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。 5、异质性 所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。
肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞培养技术 随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。 肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。 无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。 一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子 (一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth
肿瘤学研究常用实验技术及方法
精心整理 肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2. DHPLC 3. i. ii. 梯度中 iii. SDS- iv. 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超载，条带过宽而重 叠，甚至覆盖至相邻泳道。 4.对多种蛋白质而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂，故适 合的电流为玻璃板微热。 5.胶转膜后应在膜上标记好正反面及电泳方向。 6.电转移时应注意勿将滤膜和胶的位置放反，而且滤纸、滤膜和胶应等大，以免短路。
4.组织培养/基因的克隆、转化与表达 i.请列举至少3种流式细胞仪的用途? 1.定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分 2.研究细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、 氧化还原状态、吞噬性等)。 3.定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分 临床中应用：1.白血病和淋巴瘤的免疫分型 1. 2. 3.细胞 磷酸酶（phosphatase） 激酶（Kinase） 连接酶（Ligase） 5.生物质谱简介 生物质谱在蛋白组学中的应用？ 1.ProteinsMWmeasurements； 2.ProteinIdentification；(ID) 3.Peptideandproteinprofiling； 4.ImagingMS； 5.ProteinPTMs；5.ProteinQuantification 6.《常用电泳技术基本原理及应用》课程复习题
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
3D细胞培养
3D多细胞肿瘤球的培养 原创2017-04-20医生科研助手 3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。 与传统的2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征。 因此，3D多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、癌症研究、药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。 虽然3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的3D多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段。 本文利用Liquid Overlay的制备方法，以乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7为模型制备3D多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜对其进行详细表征。
1 实验前准备工作 1.提前24 h取12 mL DMEM和RPMI 1640完全培养基（含10%FBS，下同）于50 mL离心管内，置于4℃冰箱中预冷； 2. 将分装好的Matrigel基质胶提前24 h从-20℃放入4℃，使其融化成液体状态； 3. 将无菌的1 mL移液器枪头放入无菌50 mL离心管内，置-20℃冰箱预冷。 2 琼脂糖包被96孔板 1. 准确量取6 mL RPMI 1640培养基（或DMEM培养基）于2个10 mL的注射玻璃瓶内，加入90 mg琼脂糖，盖塞后放入80℃的水浴锅内加热溶解30 min； 2. 加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115℃灭菌30 min；
3. 灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板内。 注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至96孔板中。 此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和100 μL的移液器枪头。 4. 加入完成后，96孔板要保持水平约30 min使孔内的琼脂糖凝固。 3 配置含Matrigel基质胶细胞悬液 1. 取对数生长期的MDA-MB-231细胞（或MCF-7细胞），胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用RPMI 1640完全培养基（或DMEM完全培养基）将细胞悬液浓度调整至 2.0×105cells/mL，备用。
骨髓瘤细胞的培养实验
实验一、骨髓瘤细胞的培养 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。 骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超106／ml，一般扩大培养以1∶2稀释传代，每2～3天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 二材料： 1.试剂： （1）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4℃保存。 不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100×L.G.溶液1ml，双抗溶液1ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，HEPES溶液1ml。 不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml，NaHCO3 3.7g，100×L.G.溶液10ml，双抗溶液10ml，7.5% NaHCO3溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml，用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后杂交瘤细胞培养。 （2）小牛血清灭活：从-20℃冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56℃ 30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶），-20℃冻存备用，尽量避免反复冻融。 （3）青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。 2.器材： 超净工作台、CO2恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、100ml细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等 三方法： 细胞冻存及复苏 先用24孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株，当长满时，再扩大到100ml细胞瓶。当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10﹪DMSO，40﹪FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3×106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70℃冰箱过夜，然后沉入液氮中。复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40℃水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min，弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞，移入24孔板中培养。
肿瘤细胞培养基本方法
肿瘤细胞培养基本方法 (一)准备和安装过滤器 清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。 2、按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。 3、调pH至7.2左右。 4、加水至最终体积。 5、在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。 6、瓶口封好，4℃冰箱贮存。 (三)小牛血清的处理 市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近
来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。胎牛血清不必灭活。 1、将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 2、处理后的血清贮存于4℃。 3、小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。 (四)生长培养基的配制 除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 1.培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 2.按如下比例配制：基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。按1％体积 分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL，。 (五)冻存细胞的复苏 1.应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37。5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸 至水面以下不断摇动至融化。 2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取 出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。 (六)传代: 1.贴壁细胞: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使 细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。 2.悬浮细胞: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。 (七)冻存 将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约 106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。 (八)注意事项
分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
肿瘤细胞的培养及其实验的方法
肿瘤细胞的培养及其实验的方法 肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。 一、组织培养肿瘤细胞生物学特性 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点： （－）形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。 （二）生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2%?5%） 仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。 （三）永生性 永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis ）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性 是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、 10T1/2 等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。 （四）浸润性浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。 （五）异质性所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同
MDCK细胞培养基本技术方法 -2011本
MDCK细胞培养 一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。 二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。 三、程序 （一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。 （二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 （三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
肿瘤细胞生物学特性
组织培养肿瘤细胞生物学特性 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点： （－）形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。 （二）生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。 （三）永生性 永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。 （四）浸润性 浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。
原代肿瘤细胞的分离培养
原代肿瘤细胞的分离培养 实验目的：从新鲜人体标本中分离肿瘤细胞 实验器材：新鲜人体乳腺癌组织 胶原酶（Ⅰ、Ⅳ型胶原酶干粉溶解于DF12培养基，浓度1mg/ml），DMEM培养基，胎牛血清，PBS，双抗（青链霉素，100×） 手术器械，培养皿，培养瓶，离心管，恒温摇床，离心机，倒置显微镜，细胞培养箱 实验原理： 酶消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶。胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开，适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。 本实验就使用Ⅰ、Ⅳ型胶原酶对乳腺癌组织进行消化，以获取原代乳腺癌细胞。实验步骤： 1.将新鲜乳腺癌组织置于培养皿中，加入适量ＰＢＳ，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的 血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用ＰＢＳ清洗两遍。 2.将癌组织放入新的培养皿中，加入少量DMEM培养基，使用眼科剪将组织剪成约1mm3 大小的碎块。 3.转入15ml离心管中，用PBS冲洗数遍，组织块自动下沉后，除去PBS。 4.将组织块转入培养瓶中，加入5ml胶原酶和双抗（稀释至2×），吹散组织碎块，置于３ ７℃恒温摇床上消化组织，调节速度150r/min，每隔30min于镜下观察一次。 5.待组织块镜下透光性良好，呈絮状时，转入15ml离心管中，1300r/min离心5min，弃上 清。 6.加入PBS洗涤数次，反复吹打后，1300r/min离心5min，弃上清。 7.加入DMEM完全培养基（含1×双抗），反复吹打，转入培养皿中，镜下可见单个细胞 及细胞团，细胞培养箱培养。 注意事项： 1.全程严格无菌操作。 2.取材要注意新鲜和保鲜。 3.取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，尽可能减少对细胞的机械损伤，切碎组织时 应避免组织干燥。
常用的五种动物细胞培养方式
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。