腺病毒重组系统
腺病毒重组系统
AdEasyTM操作手册
目录
第一章简介1
第二章应用重组腺病毒的优点 2
第三章AdEasyTM 技术 3
3.1 技术概况3
3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3
第四章主要流程4
4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4
4.1.1 克隆的一般原则4
4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5
4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5
4.2.1 共转化的一般原则5
4.2.2 共转化方法5
4.2.3 预期结果5
4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6
4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6
4.4.1 细胞铺板6
4.4.2 磷酸钙转化技术7
第五章常用技术8
5.1 QBI-293A细胞培养8
5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8
5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8
5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8
5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9
5.2.1 感染QBI-293A细胞9
5.2.2 病毒空斑形成9
5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9
5.3 MOI测定10
5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11
5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11
5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12
5.5.3 Western杂交13
5.5.4 Southern杂交和点杂交13
5.5.5 病毒裂解产物PCR 14
5.5.6 免疫测定14
5.5.7 功能测定14
5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15
5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16
5.7.1 不连续密度梯度离心17
5.7.2 连续密度梯度离心17
5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17
5.8 病毒滴度测定18
5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19
5.8.2 空斑测定法20
5.8.3 50%组织培养感染剂量法20
第六章疑难解答22
6.1 QBI-293A细胞培养22
6.2 感染力测定22
6.3 转移载体克隆23
6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24
6.5 转染QBI-293A细胞25
6.6 筛选和测定25
6.7 在QBI-293A细胞中表达26
6.8 重组腺病毒的扩增26
6.9 纯化26
6.10 病毒滴度测定27
缩写英文全称中文全称
Ad Adenovirus 腺病毒
Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒
AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体
Amp Ampicillin 氨苄青霉素
β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶
bp Base Pair 碱基对
BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白
cDNA Complementary DNA 互补DNA
cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA
CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应
CsCl Cesium Chloride 氯化铯
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜
DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭
FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清
Hr Hour 小时
ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复
Kan Kanamycin 卡那霉素
kb Kilobases 千碱基对
KDa KiloDaltons 千道尔顿
LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基
MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点
Min Minute 分钟
MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数
mRNA Messenger RNA 信使RNA
MWCO MOIecular Weight Cut-off
PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳
PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液
PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位
pi Post Infection 感染后
RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒
RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复
SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠
TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸
TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量
TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白
TE Tris/EDTA TE溶液
wt Wild Type 野生型
X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
第一章简介
当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。
1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B）。但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（He et al，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。
这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。
第二章应用重组腺病毒的优点
1. 宿主范围广, 对人致病性低
这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。
2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因
逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。
3. 能有效进行增殖，滴度高
这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。
4. 无需辅助病毒，可容纳7.5 kb外源DNA
为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA 稍大的DNA分子（105%）。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。5. 与人类基因同源
该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。
6. 不整合到染色体中，无插入致突变性
逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。
7. 能在悬浮培养液中扩增
293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。
8. 能同时表达多个基因
这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
第三章AdEasyTM技术
3.1 技术概览
AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。
在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，
其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PmeI线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。
同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5α等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。
3.2 Ad EasyTM系统中产生重组腺病毒的时程
与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1-3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5α中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。
一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。
我们强烈建议初学者用QBI-Infect＋阳性对照进行感染力测定（见5.2.2）。进行这些测定之前，必须先扩增QBI-293A细胞（见5.5.1）。感染力测定使你能观察到病毒增殖导致的细胞表型的改变，获知你所用细胞对腺病毒的敏感性，而病毒空斑测定可让你观察到病毒空斑的形成。
第四章主要流程
4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体
AdEasyTM系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建：pShuttle和pShuttle-CMV，这2个载体都含有多克隆位点（MCS）供插入基因。pShuttle不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA），允许插入含特定启动子和polyA位点的表达盒。pShuttle-CMV含有单拷贝CMV 启动子和polyA位点供基础表达和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入pShuttle-CMV 的多克隆位点。表1提供了各转移载体的特性。
表1 AdEasyTM转移载体特性
载体名称克隆能力启动子polyA位点克隆位点线性化位点说明
pShuttle 7.5kb ——MCS 共转化位点PmeI（ECoRI）
转染位点（PacI）将完整的表达盒装入多克隆位点（MCS）
pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共转化位点PmeI（ECoRI）
转染位点（PacI）CMV启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白
4.1.1 克隆的一般原则
AdEasyTM转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用，但在设计克隆策略时应考虑以下因素：
1）在BJ5183中进行共转化之前必须将转化载体线性化。确证表1中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。注意：在pShuttle中用EcoRI线性化时，需要用RecA辅助的限制性内切酶进行酶切。如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那么必须进行定向突变。
2）重组腺病毒质粒在转染QBI-293A细胞之前也必须用PacI进行线性化。同样，插入基因中不能含有PacI位点，如果有则必须进行定向突变。
3）克隆能力是指质粒载体能够克隆并且不影响病毒增殖能力的插入基因的最大长度。各转移载体的克隆能力见表1，建议插入基因的长度最好不超过它的上限。在pShuttle和pShuttle-CMV中分别插入大于7.5kb和6.6kb的基因将大大降低整个系统的效率。尽管也可能得到重组子，但可能会发生DNA重排，生长速度也将减慢。
4）如果要插入多个表达盒，应避免以头对头方向插入相同的元件（如CMV启动子），否则同源重组时两个元件之间的部分可能会发生丢失。
5）在进行构建腺病毒之前最好测定重组蛋白的暂时性表达。这里没有提供详细的操作方法，但在CMV或其它强力启动子控制下的基因很容易进行暂时性表达实验。但某些启动子控制下的蛋白表达水平在无病毒增殖时可能不足以达到检测水平。
6）载体DNA可用氯化铯溴化乙锭平衡密度梯度离心或亲和柱法进行纯化。我们不主张用小量粗制的DNA进行转化和转染实验，因为污染的DNA将大大降低菌落和空斑的形成数。
4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体
构建重组AdEasyTM转移载体的一般指导如下，但我们建议对于详细的克隆技术和操作方法还需参考通用的分子生物学手册。
1．若cDNA含有位置正确的粘性内切酶位点，则可将它直接克隆入转移载体。如果没有，可以使用钝末端内切酶位点，也可用含合适的酶切位点的引物进行PCR或连接含有酶切位点的接头使cDNA产生新的酶切位点。PCR插入酶切位点的方法较快速，但对于长cDNA 则应使用连接接头，因为在扩增过程中Taq酶可能会使序列的某些位点发生突变。
2．插入基因的鉴定可以用限制性内切酶分析或PCR的方法。
3．转化之前用PmeI或EcoRI将转移载体重组子线性化，消化应尽可能彻底，以减少背景信号。
4．琼脂糖凝胶上观察消化产物，若消化已完全，放入65℃20分钟进行灭活。
5．凝胶纯化线性化载体。尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。将线性化质粒去磷酸化也有助于降低背景信号。
6．重悬纯化的DNA，浓度至少为0.2ug/ul。每个转化实验取1ug进行，包括对照。
4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生
4.2.1 共转染的一般原则
1）将线性化转移载体和pAdEasyTM-1 DNA共转化BJ5183必须要用高活性的感受态细胞。试剂盒中提供的细菌为电穿孔感受态，有很高的转化效率。如果不用电穿孔法进行转化，那么必须制备化学敏感性感受态细胞，并在应用之前试验其转化活性（108已足够）。
2）DH5α不可用于转化，因其不支持重组，它只是用来扩增重组病毒DNA。
3）本实验需要2ug线性化胶纯化的重组转移载体，共转化和对照各需1ug。
4.2.2 共转化方法
同时进行实验组和对照组的转化实验：
实验组共转化：1ug线性化重组转移载体（5ul）和1.0ul pAdEasyTM-1载体（100ug/ul）
对照组转化：1ug（5ul）线性化重组转移载体
1．将BJ5183感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。将细胞分为2管，每管40ul。
2．40ul感受态细胞中至多加入6ul DNA，且DNA必须溶于水，避免含有离子。
3．将BJ5183转入2mm电穿孔杯，防止有气泡形成。
4．按电穿孔供应商的使用说明转化BJ5183，Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：5 Ohms、2.5KV、C=0。
5．用1mlLB重悬转化物。
6．转入15~50ml离心管中，37℃震荡培养60分钟。
7．将转化物铺3~5块LB/Kan（50ug/ml）培养板，37℃培养24小时。建议分别铺100、
300和600ul，以提高至少在一块板中得到可分离菌落的机率，应该得到40~100个菌落。8．挑出24个最好的克隆，转入2ml LB/Kan（50ug/ml）培养液中培养10~15个小时。不要储存BJ5183培养液，因有可能产生非目的重组子。尽快抽提重组AdEasyTM质粒。9．用传统碱裂解法小量制备质粒，取一半进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，验证超螺旋质粒的大小。玻璃珠或树脂制备质粒的试剂盒应避免使用，但粘粒DNA抽提试剂盒可以用。重组质粒大小约40kb，由于它是低拷贝质粒，所以小量制备时应相应调整具体操作。
4.2.3 预期结果
20%以上的菌落应含有大质粒（近40kb），这些是侯选重组子。与对照培养板生长的菌落进行对照即可大概估计线性化转移载体再连接所致的背景强弱。由于在此高效重组recA+细菌中重组转移载体会形成多聚体，因此背景将表现为一个梯度。
4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增
将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。比如：PacI酶切后通常得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切酶进行分析，鉴定是否含有插入基因。挑选最佳阳性重组子转入DH5α中进行扩增：转化DH5α只需1-5ul小量制备的重组子。这一步对于扩增时保持重组DNA的结构是必需的，因为AdEasyTM这样的大质粒在recA+细菌株如BJ5183中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在DH5α中能很容易地获得大量DNA。
1．将DH5α感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。
2．将1-5ul DNA加入40ul DH5α感受态细胞中，DNA必须用水溶，避免含有离子。3．将DH5α感受态细胞转入2mm电穿孔杯，防止形成气泡。
4．按照说明转化DH5α：Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX 仪器则为：50 Ohms、2.5KV、C=0。
5．将转化混合液重悬于1ml LB中。
6．转入15-50ml离心管中，37℃振荡培养60分钟。
7．培养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5α（1:10、1:100和1:1000）
8．取100ul转化液铺在LB/Kan（50ug/ml）板上，37℃培养24小时。未用的转化液可在4℃保存-2周。
9．每个重组子挑1~3个克隆转入5ml LB扩增，以备有足够量质粒。这时，用内切酶再次分析重组DNA，以确证含有插入基因，以及重组子的稳定性。
10．用柱纯化试剂盒制备至少5ug高质量的重组DNA。
11．取5ug质粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在无菌条件下溶于50ul 0.1×TE溶液。具体要求参见磷酸钙技术一章中有关转染前DNA制备的内容。
4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞
注意：培养细胞前先参阅5.1章中有关QBI-293A细胞培养的内容。磷酸钙技术中的注意点：无菌
在整个过程中保持所有成分的无菌是至关重要的。昆腾公司提供的试剂盒中所有成分均是无菌的，但使用者还必须保证所用其它试剂也均为无菌。
DNA纯度
磷酸钙转染中所用的DNA必须是高纯度的，一些DNA污染物对培养的细胞具有很强的毒性，那些成功转染的细胞往往会被污染物杀死。
沉淀时间
以前的资料都建议磷酸钙- DNA共沉淀颗粒在加入细胞和培养液之前至少应反应20分钟。然而与此相反，最近的研究（Jordan等，1996）显示长时间共沉淀会形成聚合沉淀块，从而降低转染效率。因此，建议共沉淀成分混合后1分钟即可将沉淀加入细胞培养板。这一时间
上的调整可产生小而稳定的沉淀，能更有效地被细胞摄入。
4.4.1 细胞铺板
每块板都用DMEM5%进行培养，这样细胞在铺板后第二天即可达到70%汇合率。由于共转染是通过细胞表面完成的，因此转染时细胞必须是分离的，而不是汇合的。
1．转染前一天以7.5×105 QBI-293A细胞在60mm培养皿中铺板，用DMEM5%培养，第二天的细胞数应达到1.0~1.5×106。37℃CO2孵箱中培养。CO2孵箱有助于保持合适的PH，培养皿在不进行操作时必须始终保存在CO2孵箱中。
2．转染前3-4小时换成新鲜培养液，以保证在转染过程中细胞具有超常的生长力。将培养皿放回CO2孵箱中。
4.4.2 磷酸钙转化技术
1．每个转染都必须用5ug无菌的线性化重组腺病毒DNA。
2．标记一个1.5ml离心管为编号1。用微量移液枪加入169ul无菌水和5ul 2M氯化钙溶液。上下吸打二次混匀，然后一滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2M氯化钙，再用移液枪慢慢吹打混匀。此时缓冲液的体积为250ul，含有0.25M氯化钙和5ug DNA。
3．准备第2管离心管（编号2），加入250ul 2×HBS缓冲液。
4．用1ml移液枪吹打2号管中的溶液形成气泡，在吹打的同时逐滴加入1号管的溶液。加完后继续吹打5秒以使其完全混匀。这一步骤对于形成的共沉淀颗粒的大小至关重要，小颗粒转染效率更高，而吹打可以形成较小的颗粒。等一分钟后再加入细胞培养皿内。
5．在超净台内将磷酸钙-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培养皿中，覆盖范围尽可能广。培养液稍后即会透明，十字形晃动培养皿使沉淀均匀分布。
6．培养皿放入孵箱培养过夜。4小时后，沉淀颗粒在200×倒置显微镜下应清晰可见，尤其在无细胞的培养皿表面。
7．第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用PBS制备的1mM EDTA溶液洗一次，PBS洗2次。
注意：转染后细胞都十分脆弱，容易脱壁。清洗时应十分轻柔，将PBS沿培养皿壁加入，然后轻轻旋转培养皿。用移液枪反复将培养液直接加在细胞上，即可使细胞脱落，然后收集。由于这一时期细胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。
8．将细胞分装入4个60mm培养皿（每个培养皿中加5ml DMEM5%）或一块6孔板中（每孔加3ml DMEM5%），静置6小时使其贴壁。6小时后覆盖琼脂糖以供形成病毒空斑。
第五章常用技术
5.1 QBI-293A细胞培养
昆腾公司的293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293作为第一代，则30代内能得到最佳结果。一旦到了30代，最好复苏一管细胞开始新的培养。所以，我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞库。QBI-293A细胞在DMEM培养液中培养，该培养液还含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清浓度为2%~10%，视实验需要来调节细胞生长速度。为简化此操作说明，培养基描述为DMEM后加血清浓度（如：DMEM5%表示：含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、终浓度为2mM的谷氨酰胺和终浓度为5%的热灭活胎牛血清）。
QBI-293A细胞需按标准的细胞培养规程进行操作，在健康状态时，它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。被感染的细胞则变圆脱落，即所谓的细胞病理效应（CPE）。
所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则，这一点是至关重要的。抗生素可用可不用，但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。
QBI-293A细胞生长的相对密度见下表：
表2：汇合率与细胞数量
汇合率(%) 60mm培养皿100mm培养皿
50 1.60×106 3.5×106
75 2.40×106 5.25×106
100 3.20×106 7.00×106
5.1.1 QBI-293A细胞初始培养
1. 将冻存的一管QBI-293A细胞在37℃水浴轻轻晃动融化。
2. 融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。
3. 将细胞转入15mL无菌离心管中，加入10mL DMEM 10%，600×g离心5分钟使细胞沉淀。
4. 弃去上清。
5. 将细胞用10mL DMEM 10%重悬，轻轻打匀
6. 转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。
7. 在5% CO2孵箱中37℃培养过夜。
8. 第二天观察细胞汇合率，若合适则可进行实验，否则按5.1.2所述继续培养。
5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖
QBI-293A细胞必须按1:10到1:20传代
1. 室温下胰酶消化1~3分钟使贴壁细胞脱落
2. 拍打培养瓶边缘使细胞脱落，在倒置显微镜下观察细胞是否变圆，是否已从培养瓶表面脱落。
3. 按需要用新鲜培养液稀释细胞悬液，转入新的培养瓶中。
在5% FBS中，细胞倍增的时间是26小时，在10% FBS中稍短一些。
5.1.3 QBI-293A细胞的冻存
建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于50%，以保证亚克隆的特定表型。
1. QBI-293A细胞必须在含10%高质量FBS的DMEM中培养。
2. 将健康生长的QBI-293A细胞离心沉淀。
3. 以最小体积的DMEM 10%重悬细胞。
4. 用血球计数器进行细胞计数。
5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重悬细胞，细胞终浓度为1×106/mL。
6. 无菌操作将1mL细胞悬液转入2mL冻存管中。
7. 将冻存管放入冻存盒中，-80℃储存24小时。这一简便措施可保持约1℃/分钟的降温速率，适于冻存细胞。
8. 第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150℃冰箱中长期保存。QBI-293A细胞若正确冻存，则可在液氮罐中保存数年。
5.2 QBI-293A细胞的感染和病毒空斑的产生
感染QBI-293A细胞和产生病毒空斑在这本手册的多种操作中都得到应用，其具体操作视不同的实验目的而稍有差异（如滴度测定、大规模扩增和纯化）。这一节提供了一个基本的操作说明，并详细描述了QBI-293A细胞感染后不同时间的具体变化。
5.2.1 感染QBI-293A细胞
QBI-293A细胞中腺病毒的感染周期表现为光镜下可见的细胞表型的改变，此周期始于病毒
和细胞接触后。被感染细胞的表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率相关，这个比率称为感染复数（MOI）。病毒控制细胞并阻止细胞的生长需要几个小时的时间。
10~20的MOI值通常用于需要同时感染所有细胞时，此时细胞汇合率应该在90~95%左右，因为细胞在感染数小时内将停止生长。加入病毒的量可通过MOI值测定（见5.3）或病毒滴度测定（见5.8）确定。在这个MOI值条件下，被感染细胞的形态在1~2天后就会完全改变：细胞变圆并逐渐从壁上脱落（见5.2.2）。随着病毒的增殖，细胞核将占据细胞的大部分，这一表现称为细胞病理效应（CPE）。感染后3天，所有细胞都将呈现CPE。
当QBI-293A细胞在MOI值为1或更低的情况下被感染，则只有一部分细胞能被感染。此时感染所有的细胞必须产生完整的感染周期并释放病毒，整个过程大概需要4天。在这个过程中，未被感染的细胞将继续生长，细胞可能在未被全部感染时达到100%汇合率而停止生长。感染后的表现是多种多样的，但典型的表现是在感染后5天可见大多数细胞呈现CPE 而其余的细胞表现为原来未被感染的形态。
感染的操作很简单，只要将病毒与细胞接触。为增加感染的有效性，在最初2小时感染中最好将培养液的体积减到最小，这样病毒与细胞接触得会更紧密，然后再增加培养液。此外，缓慢而持续地晃动培养板（Mittereder et al. 1996）可使病毒分布更均匀，从而使感染效果更好。
注意：处理细胞和病毒时都必须使用消毒的枪头。
5.2.2 病毒空斑形成
病毒空斑形成源于一个细胞被一个病毒感染后，经过多次完整的感染周期释放病毒再感染周围的细胞。病毒空斑的形成是一个缓慢的过程，甚至在光镜下能观察到空斑之前，细胞已经达到100%汇合。为限制病毒的扩散，通常在培养液中加入琼脂糖，但在琼脂糖覆盖下观察细胞形态的改变则要稍微困难一些。
感染后7天左右可以在显微镜下看到小的空斑，表现为一定区域内细胞呈现CPE。第10天可以在光镜下看到形态完整的空斑，有经验的研究者则能凭肉眼观察到培养板底部有小的空白斑点形成。到14天，空斑可非常容易地被挑选出来。
5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞
将琼脂糖覆盖细胞不是一项容易的技术，你必须在琼脂糖凝固之前迅速地将它在单层细胞上完全铺匀。但是如果铺得太快太重，那么细胞往往会脱壁。但通过几次实验后，这一步应该比较容易了。
琼脂糖/DMEM混合物制备：
1. 用无菌PBS制备5% SeaPlaque琼脂糖（FMC产品）储存液，高压消毒后每管10mL分装在50mL塑料离心管中，4℃保存。
2. 使用之前先在微波炉中融化5% SeaPlaque琼脂糖（避免沸腾），然后冷至45℃。防止琼脂糖沸腾最好的办法是在沸水浴中加热，如果没有完全融化的话再在微波炉中加热数秒。
3. 加入30mL预平衡至37℃的DMEM5% 后充分混匀，这样琼脂糖的终浓度为1.25%。立即使用。
覆盖QBI-293A细胞：
在进行下一步操作之前，请确认细胞是否已贴壁完好。
1. 移去培养液，用1.25%琼脂糖/DMEM混合物覆盖单层细胞。
2. 沿着培养板的边缘将琼脂糖轻轻加入，加入的具体体积参考表3，然后放回CO2孵箱培养。
表3：不同培养器皿应用的琼脂糖体积
培养皿大小首次量追加量
100 mm 10 mL 5 mL
60 mm 5 mL 3 mL
6孔板3 mL 1.5 mL
空斑应在10~21天内形成，为保持细胞活力，每4~5天或培养基变黄时追加琼脂糖/DMEM 混合物。
5.3 MOI测定
这一实验用来粗略估计病毒上清中病毒颗粒的数量（精确测定病毒颗粒数量见5.8节的滴度测定）。MOI测定通常在扩增病毒尤其是在大量扩增的时候使用，以确定感染的最佳条件。这一实验可在含有1×106QBI-293A细胞/孔的6孔板中进行。
1. 移去培养液，每孔加入500μL新鲜的培养液
2. 一孔为对照，其余每孔分别加入2、5、10、25、50μL病毒上清。
3. 不断缓慢晃动培养板，培养约3小时。
4. 加入1.5mL新鲜培养液培养72小时。
观察每孔细胞是否出现CPE，根据预先的估计，感染后3天细胞完全出现CPE的病毒MOI 值为10~20。这样，根据感染的细胞数量，你就可以估计出上清中的病毒量。
5.4 腺病毒感染力测定
这一实验的目的是确定腺病毒是否能将DNA转导入293之外的某一细胞株。该实验至关重要，因为它将确定腺病毒是否可应用于这个细胞株，以及如果能应用则需要多少的病毒量（也就是需要大量扩增的程度）来完成整个研究。这个实验中，如果用的是Ad5-CMV-LacZ则检测β-半乳糖苷酶，Ad5-CMV-GFP或Ad5-CMV5-GFP则检测GFP。这些高滴度的产品都可单独向昆腾公司购买。本实验的阳性对照（β-半乳糖苷酶检测）亦可向昆腾公司购买，但由于病毒滴度太低而不适于直接进行实验，通常需要扩增以达到理想的病毒滴度（扩增步骤见5.6）。
腺病毒转导的效率各个细胞株都不太一样，其中尤以淋巴细胞株最难转导。
腺病毒感染力测定通常在多孔板中进行，MOI为1~200，当测定淋巴细胞株时MOI可至1000。对大多数细胞株来说，1~50的MOI值可将报告基因转入所有的细胞而不会出现任何的毒性。在高MOI情况下，某些病毒蛋白的高表达可对某些细胞产生毒性。无论MOI为多少，感染时都必须用最小的培养液体积并不断晃动，以使感染效果达到最佳。
1. 按5.
2.1中所述方法在6孔板中用不同数量病毒感染细胞（合适的MOI范围），培养48小时。
2. 进行X-gal染色（见下述）。注意细胞与病毒培养后不必清洗细胞，在整个实验过程中让病毒留在培养液中。
5.4.1 X-gal染色
1. 弃去培养液，用37℃预热的PBS冲洗一遍，然后加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆盖细胞，0.05%戊二醛室温孵育5~15分钟或2%多聚甲醛室温孵育60分钟。
2. 弃去固定液，室温下用PBS彻底洗3遍：第一遍将冲洗液立刻弃去，第二、第三遍则让冲洗液保留5分钟。
3. 加入最小体积的X-gal溶液。
4. 37℃孵育1至12小时（过夜），阳性细胞将被染成蓝色。染色完成后可将培养板置于4℃保存。
溶液：
a）戊二醛固定液
使用前将戊二醛用PBS稀释至终浓度为0.05%。
b）多聚甲醛固定液
1. 将2g多聚甲醛溶解在50mL预热至55℃的水中。
2. 加入2滴10 N NaOH，溶液将变澄清。
3. 待多聚甲醛溶解后，加入10mL 0.2M 磷酸二氢钠（2.76g/100mL）和40mL 0.2M 磷酸氢二钠（无水，3g/100mL）。
4. 固定液在37℃条件下加入，在室温下固定。多聚甲醛固定液可在4℃最长保存一个星期。c）X-gal溶液
用PBS制备（PH7.4）：
20 mM氰铁酸钾( K3Fe(CN)6 )
20 mM氰亚铁酸钾( K4Fe(CN)6?3H2O )
2 mM MgCl2或MgSO4
使用前加入X-gal储存液（20mg/mL溶于N,N-二甲基甲酰胺），终浓度为1mg/mL。
上述三种X-gal染色用的溶液可在室温下保存数月，溶于N,N-二甲基甲酰胺的X-gal储存液则可于-20℃在玻璃容器中储存，用箔包裹后避光保存。
5.5重组腺病毒的筛选和纯化
腺病毒转移载体和腺病毒DNA通过在体同源重组产生重组腺病毒，这涉及到复杂的反应和基因重排或突变，导致病毒呈现不同的表型。虽然重组腺病毒DNA在细菌内重组后已筛选到含有插入基因，但我们还是建议按照下面的操作步骤对细胞内产生的重组腺病毒进行鉴定。
5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送
重组腺病毒的挑选取决于病毒表达蛋白和增殖的能力。比如有两个不同特性的克隆，第一个克隆蛋白表达很好而且病毒可增殖至5000VP/细胞，而第二个克隆虽然蛋白表达水平只达到第一个克隆的75%，但是却可以增殖到10000VP/细胞。扩增的时候，第二个克隆10L产量中的病毒数量即可达到第一个克隆20L的产量，这样当需要大量扩增病毒时第二个克隆是较好的选择，而且产物足以产生生物学效应，。
筛选方法的选择取决于病毒最终的应用。如果用于蛋白表达，那么必须使用能监测蛋白表达水平的方法；如果要挑选能有效扩增的克隆，那么就用能定量检测DNA产量的方法。
简单的重组腺病毒筛选可用PCR方法，这一技术只检测病毒中的重组DNA，而不能筛选特定的表型。其它技术不但能筛选重组病毒，同时也能挑选特定的表型。克隆的挑选可根据：1. 每个细胞产生病毒的数量。这可以用Southern杂交的方法，因为病毒DNA量与每个细胞的病毒含量有关。能产生高水平病毒量的克隆有利于生产高滴度的病毒储存液，但是增殖最佳的克隆未必能最有效地表达蛋白。
2. 每个细胞蛋白表达的水平。这可以用Western杂交或功能测定的方法。
请注意有些最佳克隆可能会较难培养。因此筛选方法的选择取决于用来观察生物学效应的蛋白表达水平和重组腺病毒的最终应用。
表4提供了选择最佳筛选方法的向导。报告基因、表达蛋白的抗体和功能测定的敏感性将影响操作方法的选择。得到最初结果的时间对方法的选择也很重要，但这一原则必须慎重考虑，因为如果最终目的是生产大量病毒，那么一个10倍量高产的克隆只需扩增1L即能达到原来10L的病毒量，这时使用快速筛选方法所节省的时间会在大量扩增过程中完全耗费掉。表4：各种筛选方法的特性
筛选方法优点缺点
显示表达蛋白的完整性Western杂交
显示插入基因的蛋白表达水平
需要表达蛋白的抗体可以用与其它蛋白有交叉反应的抗体，因为蛋白会在胶上得到分离
得到最终结果需两个星期
Southern杂交
使用克隆基因作为探针，无须特殊试剂或点杂交
需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间通过信号强弱间接测定每个细胞内的病毒数量
仅能检测克隆的基因
仅能检测克隆的基因且无法定量迅速，使用扩增病毒的储存液只需1天时间PCR
可能需要优化克隆基因的PCR条件
相对快速，总共需要3天时间免疫测定
需要与细胞蛋白无交叉反应的特异性抗体显示插入基因的蛋白表达水平
需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间直接显示蛋白的完整性和功能功能测定
对于大多数方法来说，信号密度与蛋白的表达水平、病毒DNA的增殖程度以及病毒保存液的纯度有关。空斑总量中的阳性率提示克隆的纯度高低。比较不同克隆间的信号密度水平时克隆的纯度非常重要，也就是说必须保证所有筛选出来的空斑必须100%阳性。
5.5.2病毒空斑挑选和小量扩增
通过AdEasyTM系统纯化得到的细菌克隆而产生的病毒空斑应该几乎都是（95%）重组病毒。每个细菌克隆最好测定至少1~2个空斑的表型。
操作步骤
1. 从培养板上挑选6~12个空斑，标上圆圈。
2. 无菌条件下用200μL枪头挑出克隆并转入含0.5mL DMEM5%/孔的24孔板。
3. 37℃病毒24小时。
4. 铺一块每孔含1×105 QBI-293A细胞的24孔板。
5. 移去培养液，轻轻加入100μL步骤3中清洗的病毒（约103病毒颗粒），切勿将细胞吹起，十字型轻轻晃动3次，转入CO2孵箱37℃培养90分钟。
6. 加入DMEM5%，使总体积为1mL，轻轻混匀。
7. 37℃CO2孵箱培养直至完全出现CPE，在此MOI值下一般需要5~10天。如果10天后还没出现CPE，说明此克隆的病毒量太低，需要进行第二轮扩增。
8. 为从细胞中释放病毒，在-20℃和37℃中充分冻融细胞3次。
9. 收集细胞，在15mL离心管中打碎。台式离心机上以最大转速离心10分钟，收集上清并储存于-80℃。这一冻存液中大约有5×107VP/mL。如步骤7中所述，如果在第一次扩增后CPE不完全，则进行第二轮扩增。
由于QBI-293A细胞含有腺病毒基因组的E1区，因此E1区缺失的腺病毒与人染色体发生同源重组而产生有增殖能力的腺病毒（RCA）的机率很低。发生这种回复突变的机率大约为1/107，这种腺病毒的增殖速度比重组腺病毒快。首轮扩增产生的腺病毒保存液是十分重要的，因为它含有RCA 的可能性最低。这种保存液必须节约使用，并保存好所有低代病毒，以便进行大量扩增，不可用已传过数代的病毒进行大量扩增。低代病毒DMEM5%溶液可在-80℃条件下保存数年。所以，保存好低代病毒可避免进行重复筛选和纯化病毒克隆的工作。在这一期间可以选择适当的方法来筛选重组病毒，当所有病毒空斑100%为正确的重组病毒时可以认为这个克隆为纯的。如果此时病毒仍然不纯，则可以进行第二轮空斑纯化，然后再用适当方法进行筛选。
5.5.3 Western 杂交
以下内容提供了进行Western杂交的一般指导。按照本手册制备的初次病毒扩增保存液已足
够用来检测大多数腺病毒蛋白，SDS-PAGE、抗体反应和检测系统的具体操作请参考标准实验手册。
1. 在5×105细胞/孔的24孔板中每孔加入500μL DMEM5%培养液，然后再每孔加入200μL初次病毒扩增保存液感染48小时。
2. 确证所有细胞均出现CPE，如果CPE不完全则再延长感染24小时。
3. 取出400μL转入1.5mL试管中，其余-80℃冻存。
4. 800rpm离心5分钟，弃上清后用20μL PBS重悬细胞，用P20移液枪充分混匀重悬细胞。
5. 加入20μL 2 ×Laemmli缓冲液（注意：对于某些蛋白和抗体，这一步使用不含巯基乙醇的缓冲液至关重要）。
6. 煮沸5分钟。
7. SDS-PAGE上样。
不同克隆抽提物中的蛋白含量变化很大，上样量勿过量。在显微镜下先测定每个样品的蛋白含量对于获得好的结果十分重要，每孔的蛋白上样量大约为5~10μg。
5.5.4 Souther杂交和点杂交
1．六孔板中加入2×106 QBI-293A细胞，然后加入含500-1000ul初次扩增病毒保存液的DMZM 5% 3ml，感染48-72小时，直至完全出现CPE。
2．600×g离心5分钟沉淀细胞。
3．500ul TE重悬细胞，然后加入SDS、EDTA和蛋白酶K，至终浓度分别为0.6%、10MM 和200mg/ml。
4．37℃孵育2小时。
5．加入5M Nacl储存液至终浓度为1M。
6．冰浴3小时以上，或4℃过夜。
7．14000×g 4℃离心30分钟，小心移走上清。
8．加入1倍体积双蒸水稀释，以降低盐浓度。
9．将DNA依次用TE缓冲的酚/氯仿/异戊基乙醇（25:24:1）、氯仿/异戊基乙醇（24:1）抽提一遍。
10．加入2倍体积100%乙醇，用最大速率离心，使DNA沉淀。
11．加入50ul双蒸水重悬DNA（此沉淀中亦含有RNA）。
上述操作可获得足够DNA进行各种试验，如按标准进行Souther杂交和点杂交。所需DNA 的量和所采用的技术有关（检测单拷贝基因所需的DNA量）。由于每个细胞可产生1000~10000个拷贝的重组病毒，膜上每点的DNA量可降低150~1000倍而不会影响信号。
5.5.5病毒裂解产物PCR
理论上讲，这是筛选重组病毒最快的方法，但是很难预料一对引物能否正常工作，因此常常需要优化PCR条件。如果把优化PCR条件的时间也计算在内，那么获得最终结果需要的时间可能和其它定量方法差不多。PCR反应可直接用初次扩增得到的病毒保存液进行（5.5.2，第9步）。一个25ul反应体积的标准PCR反应需要4ul病毒保存液（无需抽提），25pM引物和1单位Taq酶，取5-10ul进行电泳分析。标准的PCR过程请参考通用的分子生物学手册。
如果PCR扩增无效，则反应前需象Souther杂交一样抽提DNA（Hirt法）。其实，每个克隆用酶切反应进行分析更为合适，因为尽管酶切和PCR需要相同的时间，但酶切分析更能确认重组病毒的序列结构。
5.5.6 免疫测定
这是最快的筛选方法。免疫测定可直接在培养孔进行，一天内即可完成。但这方法需要特异的抗体，而且无法定量。具体操作请参考相应的标准免疫测定方法。
1．如5.2.1中所述，用初次扩增的病毒保存液感染细胞。
2．4%多聚甲醛固定感染的细胞20分钟，PBS洗2次，如果需要可用0.075%曲拉通/ PBS 渗透，PBS洗2次以上，2%BSA阻断60分钟。
3．加入一抗37℃培养60分钟。
4．PBS洗两次。
5．加入标准的二抗（FITC，缄性磷酸酶，辣根过氧化物酶等）进行孵育。
6．用相应方法进行蛋白显色。
5.5.7 功能测定
有些蛋白的功能可直接进行测定。如果目的是进行蛋白表达，那么建议用评价蛋白功能的方法来筛选病毒，必须应用能准确评价蛋白质量的方法，操作应视需要进行相应调整。以下是分离含有完整蛋白的被感染细胞的一般方法：
1．在每孔含5×105细胞的24孔板中，每孔加入700ul含200ul首次病毒扩增保存液（5.5.2，第9步）的DMEM5%，培养48小时。
2．观察细胞直至完全出现CPE，如果CPE不完全，再延长感染24小时。
3．取出400ul转入1.5ml离心管中，将剩余的300ul冻于-80℃。
4．800rpm离心5分钟，弃上清，将沉淀用20ulPBS重悬，用P20移液器使细胞充分混匀，重悬。
此时，可按照能保留蛋白功能的操作方法提取蛋白。注意，细胞抽提物含有大量病毒DNA，从而会提高溶液的粘滞度。如果粘稠性影响操作，可用超声降解DNA或用20G针头将DNA 打碎。但细胞浆抽提物则不存在此问题。对于DNA结合蛋白，蛋白功能测定通常是观察其迁移，对某些酶则进行比色测定。
5.6病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增
一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在QBI-293A细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000，因此1L培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀）。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。
操作步骤：
1. 在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 QBI-293A细胞。
2. 取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释应得到的MOI 值约为5。
3. 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。
4. 加入9ml DMEM5%。
5. 再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒（5.3）。
如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定（5.8）。收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然
后按5.8进行病毒滴定。
6. -20℃/37℃冻融3次。
7. 转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。
8. 3个175cm2培养瓶中各加入107 QBI-293A细胞进行培养。
9. 将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。此时MOI值约为25。
10. 加入DMEM5%至30ml。
11. 再培养48~72小时。此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。若需要，进行MOI 测定（5.3）以估计病毒滴度。
此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤（5.8）。600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，按5.8章中所述进行病毒滴定。
12．移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。
13．30瓶175 cm2培养瓶中每瓶各加入107 QBI-293A细胞。
14．将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃培养90分钟。此时MOI值约为25。15．加入DMEM5%至30ml/瓶。
16．再培养48-72小时，此时约有3×1011~3×1012个病毒。若需要，进行MOI测定估计病毒滴度。
如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM5%中。-20℃/37℃冻融3次，离心沉淀细胞碎片。此时5ml DMEM5%中3×1011~3×1012个病毒颗粒，浓度为6×1010~6×1011vp/ml。然后按5.8章中所述滴定病毒储存液，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。
在109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量。如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。比如，用第2代病毒产生第3代病毒。如果没有第2代病毒，那么必须用第1代病毒来产生新的第2代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA水平尽可能低。
如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。
表5：腺病毒扩增
第一代第二代第三代第四代
每瓶细胞数1×105 5×106 1×107 1×107
培养瓶大小
（cm2）75 175 175
培养瓶数24孔板1孔 1 3 30
感染来源稀释的空斑首次扩增后的病毒保存液第二代病毒第三代病毒
每瓶接种量0.1 mL 0.5 mL或
2.5×107 1 mL 1.5 mL
总培养体积1 mL 10 mL 90 mL 900 mL
MOI 0.01 5 25 25
滴度（VP/mL）1×108~9 5×108~9 3.3×108~9 3.3×108~9
总病毒量1×108~9 5×109~10 3×1010~11 3×1011~12
5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒。
腺病毒纯化包括3步：
1．不连续氯化铯密度梯度离心去除主要的细胞污染物和缺陷性病毒颗粒。
2．连续氯化铯密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒分开。
3．透析去除氯化铯（去盐）。
连续密度梯度需要过夜离心。为保证时间安排，建议从早上开始第1步，这样大约在午后就可开始过夜离心。按照此时间安排，完整的一个纯化过程包括去盐在内大约需2天时间。下面所有操作均以SW28转子30ml离心管为例。理论上讲，溶液体积调整后也可用其它大小的离心管，切记在离心后收集病毒带。由于有些污染物和成熟的病毒颗粒密度相近，因此这二条带之间的距离很小。在大直径的离心管中，病毒带更细，离原始位置更远，这样，病毒带在30ml离心管中比在12ml的管中更易分辨。
5.5.7 不连续密度梯度离心
注意：为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增病毒至少需要3×108细胞。
1．预冷离心转子至4℃。
2．在离心管中缓慢加入8ml 1.4g/ml氯化铯（53g+87ml 10mM Trz-HCL，PH 7.9），再非常轻缓地加入6ml 1.2g/ml氯化铯26.8+92ml10mM Tris-HCL，PH 7.9）。病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。
3．超净台中在不连续梯度顶部加入20ml DMEM5%病毒保存液，病毒量必须少于109细胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量。如果保存液的体积少于20ml，用PH 7.9 10mM Tris-HCL调至20ml。
4．平衡离心管，100000×g（SW28转子上为23000rpw）4℃离心90分钟。
5．超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。
6．用10ml移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。
7．在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿刺过程中有液体泄露。
8．用带18G针头的5ml注射器从离心管外壁稍低于病毒带（最下的一条带）的位置进行穿刺。
注意：感染性和缺陷性病毒颗粒之间的区域通常较浑浊，切勿吸取这一浑浊区。
9．小心抽吸病毒带，避免吸到其它带和杂质，拔出针头。
10．取出针头，将含病毒的溶液转移至无菌15ml离心管。
11．加入1倍体积1×TE，这一步对于把溶液密度降低至1.2以下是必须的，病毒带的密度大约为1.345。
5.7.2 连续密度梯度离心
1．使用连续密度发生器将12ml 1.4g/ml和14ml 1.2g/ml氯化铯连续密度梯度加入离心管中。2．非常缓慢地在密度梯度顶部加入8-10ml 5.7.1第11步中稀释的病毒悬液。
3．100000×g 4℃离心16-20小时。
4．超速离心后，连续梯度溶液和不连续梯度溶液同样分层，但底部没有沉淀，因此通过底部穿刺即可获得感染性病毒带。溶液上部（含细胞成分）通常更为干净，大部分细胞碎片已通过第一步不连续梯度离心被去除了。
5．用10ml移液器从离心管顶部吸去大部分梯度溶液和杂质，避免吸到底部含病毒的蓝白色条带。这有助于在收集病毒时降低溶液流出速度。
6．用20 G针头从底部穿刺收集底部蓝白色病毒带。
7．让底部梯度溶液流入烧杯，当接近病毒带时再转入50ml离心管中收集。
8．蓝白色病毒带收集完后再将剩余的梯度溶液转入烧杯。
说明：当然，病毒带也可以象不连续梯度时一样从侧壁穿刺收集。
5.7.3 病毒溶液去盐和浓缩
氯化铯是通过透析去除的，这一步至关重要，因为高浓度氯化铯可能会影响病毒对细胞或组织的感染。透析液的选择取决于病毒的最终用途。如果用于动物，则应避免使用甘油，因为含有甘油的溶液极难注射；如果要使病毒滴度达到5×1011vp/ml，则应避免PBS-5%蔗糖缓冲液，因其不能提供良好的病毒稳定性，由于溶液PH的关系，病毒将会沉淀下来。含10mM Tris（PH8.0），2mM Mgcl2，5%蔗糖的病毒缓冲液可允许病毒浓缩至1013vp/ml，并且具有良好的稳定性。（Nyberg-Hoffman等，1999）。
将病毒带在分子筛为25000道尔顿的纤维素酯膜中进行4℃透析，去除氯化铯盐。由于病毒分子量较大，大小约90nm，因此不能穿过透析膜。缓冲液的体积应为病毒溶液的200倍，每次透析一小时，然后更换缓冲液，3次更换缓冲液后应已无痕量氯化铯。透析后的病毒溶液可在-80℃中长期保存，-20℃中则可保存较短时间。需要注意的是腺病毒在反复冻融后感染力将减弱，因此可将病毒分装成小份，一部分进行滴度测定（5.8：病毒滴度测定），剩下的用于以后的实验。如果透析后病毒溶液太稀，Millipore公司的超纯浓集柱可将病毒浓度提高10倍。这个过程中所丢失的病毒量小于10%。纯化柱在使用前必须用70%乙醇消毒，然后在加入病毒前再去除痕量乙醇（比如用病毒缓冲液）。
5.8 病毒滴度测定
有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）
2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）
3．PFU（空斑形成单位）
4．TCID50（50%组织培养感染剂量）
不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP 或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行
感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。
对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差100倍以上，典型的数据见表6。所有结果都只是大概的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒/2个颗粒。
下一部分，我们将详细描述3种不同的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和耗时。无论选择那种方法，稀释和滴定过程必须重复操作以得到精确结果。一般来说，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度应为：
106~107 第一代细胞经冻融后
108~109 100倍数量的细胞经过冻融后
1010~1011 用氯化铯方法纯化后
表6：各滴度测定方法特性
方法类型时间可重复性滴度* 评注
VP 物理学方法2小时好5×1012
GTU 生物学方法2天可变2×1011
PFU 生物学方法21天变化很大5×1010 传统方法
TCID50 生物学方法10天可变2.5×1011 昆腾公司标准方法
*以VP法测得的5×1012的病毒保存液为标准
5.8.1 O.D.260 nm（VP/ml）
这种方法只是通过DNA量来表示病毒滴度。相关系数为1.1×1012/ OD260 单位。由于大多数分光光度计在OD值小于0.1时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释10倍，因此如果OD值大于0.1，我们可以估计病毒量大于1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含缺陷性颗粒。
1．4℃融化病毒保存液。
2．在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（0.1%SDS，10mMTris PH7.4，1mMEDTH）准备二个病毒稀释度。
最小需要量为：
病毒裂解液病毒稀释度
52ul 52ul 1：2（稀释液1）
168ul 42ul 1：5（稀释液2）
注意：病毒滴度高时（1013/ml）用1：10和1：20稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD 值在0.1~1.0之间。
3．56℃震荡培养10分钟。
4．准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替病毒裂解液。
5．测定260nm处吸光值：
稀释液1再稀释1：5，为稀释液3。
稀释液2再稀释1：5和1：10，分别为稀释液4和稀释液5。
测定稀释液5（2次）、4、3的OD260，取此4值的平均值作为最终结果。
例如
1．将450ulVLB和50ul稀释液即透析缓冲液加入比色杯中。
2．记下空白管读数后弃去，不要冲洗。
3．加入450ulVLB和50ul 1：5稀释样本（稀释液2），组成稀释液5。
4．记下读数后弃去。
5．清洗比色杯，加入样本重复测一次。
6．清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：5稀释空白液。
7．记下空白管读数后弃去，不要清洗。
8．加入400ul VLB和100ul 1：5稀释样本，组成稀释液4。
9．记下读数后弃去。
10．清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：2稀释空白液。
11．记下空白读数后弃去，不要清洗。
12．加入400ul VLB和100ul 1：2稀释样本，组成稀释液3。
13．记下读数后弃去。
将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度：
OD260×病毒稀释度×测定稀释度×1.1×1012= OPU/ml
5.8.2 空斑测定法
空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。
1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。
2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%，上下吸打5次，稀释度为10-2。然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。
注意：每次稀释时都必须换用新枪头。
3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。
4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。
5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。
结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。
5.8.3 50%组织培养感染剂量法
此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。
5.8.3.1 细胞准备：
1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。
2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。