生物制药工艺学 甾体激素类药物的生产工艺流程 讲义

第三章甾体激素药物

第二节甾体激素类药物的生产工艺流程

了解甾体激素类药物的生产的一般工艺流程；掌握甾体激素类药物的原料的来源及工艺。

教学基本内容：

§1 甾体激素类药物的生产的一般工艺流程

甾体激素类药物的微生物催化法生产一般包括菌种培养、孢子/菌悬液制备、种子培养、发酵培养、投加底物催化、分离提取等过程。

甾体生物转化工艺一般可分为两个阶段：

（1）菌体生产和产酶阶段：将菌种接入斜面孢子培养基上，在一定温度下培养3-5天，然后将成熟孢子接入摇瓶和种子罐沉没培养。种子培养好后转入发酵罐，在适当培养基和培养条件（温度、搅拌、通风量、pH）下进行培养。细菌的生长阶段一般为12-24小时，真菌为24-72小时。在这个阶段重要的是创造各种良好条件使微生物尽快的生长和繁殖，在尽可能短的时间内繁殖大量的菌体并产酶。

（2）甾体转化阶段：将被转化的物质直接加入到培养液中进行生物转化，这一阶段需要控制好适合转化反应的各种条件，如pH、温度、搅拌和较大的通气量等，必要时还可以加入酶激活剂和抑制剂。

§2 甾体生物转化方法

（1）一步发酵转化法（边发酵边转化），是我国目前甾体医药工业普遍采用的微生物转化法。

（2）静息细胞、干细胞或孢子悬浮液法；

（3）多菌种协同转化法；

（4）固定化细胞或固定化酶

（5）双水相系统转化法

（6）有机相介质转化法

§3甾体药物原料的生产

3.1 薯蓣皂苷的提取：我国是甾体激素原料药生产和出口大国。早期合成甾体激素的起始原料大多是来自动物的胆固醇、胆酸等，由于这些原料的来源少，含量低，合成路线长，成本高，不能满足生产的需要。相当一段时期甾体药物主要采用以皂素为原料的半合成生产工艺生产。

薯蓣皂素则从黄姜中提取，造成大量耕地的占用。据统计，我国2008年黄姜种植达面积4000万亩。从黄姜中需要经酸水解、有机溶剂萃取等多步骤提取皂素，再经多个化学反应，制成双烯醇酮醋酸酯或表雄甾酮，二者作为合成各种甾体药物的中间体原料。该工艺为化学反应过程，步骤繁多，使用苯、甲苯、硫等10余种有机溶媒，操作危险性高，对环境特别是河流已造成严重的污染。因此该类项目在很多省市都受到限制。但由于对薯芋皂素的需求日增，薯芋资源日渐枯竭，原料价格的大幅上升，人们开始开拓新的资源。

3.2 植物甾醇侧链降解反应生产甾体药物前体：采用微生物发酵转化方法生产AD、ADD和9-OHAD，该方法能避免因皂素资源紧缺导致甾体激素类药物生产成本过高的问题，可减少对植物资源的破坏，又能充利用其它产品的废物，原料来源丰富充足。同时，以AD等为原料生产其他甾体类激素药物的合成步骤也更为简捷，因此用微生物发酵方法生产AD、ADD和9-OHAD，再以AD、ADD和9-OHAD为原料生产各种甾体激素具有更为经济的市场前景。

目前国际上逐渐开发的是利用微生物转化洗羊毛废水、造纸废液、食用油精炼下脚料中的胆固醇、豆甾醇、谷甾醇，制备形成AD、ADD和9-OHAD作为合成各种甾体药物的中间体原料。

（1）菌体的培养及PS转化反应

采用0.5%的Tween80无菌水溶液洗下斜面种子，使菌体OD值控制在1.0±0.2，以2%的接种量接种到一级种子，于29 ℃，110 r/min培养36 h左右，此时菌体OD值为1.0±0.2，pH为6.6-6.8，以7％的接种量转接于含有植物甾醇的发酵培养基中，于29 ℃，200 r/min振荡培养168 h。

种子培养基(g/L)：磷酸氢二钾0.5、柠檬酸铁铵0.05、柠檬酸2、甘油20、硫酸镁0.5、硝酸铵2、葡萄糖5、碳酸钙10

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸亚铁铵0.05，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇适量(按投料比添加)，pH 7.2 （2）植物甾醇转化产物的分析与鉴定方法

薄层层析法（TLC）

高效液相色谱法（HPLC）

气相色谱法（GC）

液质联用（LC-MS）测定

核磁共振（NMR）测定

单晶衍射（X-ray）测定

本节课作业:

1.写出用甾体药物生物转化的一般工艺流程。

2.甾体激素类药物的原料来源？