毒理学研究方法

（课件重点）

毒理学研究方法

1.体内试验(in vivo)：也称整体动物试验，可严格控制接触条件，测定多种类型的毒作用。大鼠，小鼠，豚鼠，家兔，狗和猴等。也有鱼类，鸟类，昆虫等

2．体外试验(in vitro):利用游离器官、培养的细胞或细胞器、生物模拟系统进行毒理学研究。器官（肝、胚胎），细胞，细胞器，分子等

3．人体观察(human toxicology)，事故或志愿者

4．流行病学研究(epidemiological study)：

为什么有选择毒性

1．物种和细胞学的差异 (植物生长调节剂) 2．蓄积能力

3.代谢过程和速率

4.损伤的修复能力

非损害作用(non-adverse effect)

所致机体发生的一切生物学变化都是暂时的、可逆的，应在机体代偿能力范围之内，不造成机体形态、生长发育过程及寿命的改变、不降低机体维持稳态的能力和对额外应激代偿的能力、不影响机体的功能容量，如进食量、体力劳动负荷能力等涉及到解剖、生理生化和行为方面的指标，也不引起机体对其他环境有害因素的易感性增高。

损害作用(adverse effect)

所致的机体生物学改变是持久的、不可逆的，造成机体功能容量的各项指标改变、维持体内的稳态能力下降、对额外应激状态的代偿能力降低以及对其他环境有害因素的易感性增高，使机体正常形态、生长发育过程均受到影响，寿命缩短

生物膜biomembrane

定义：将细胞或细胞器与周围环境分隔开的一层半透膜。

功能：将细胞或细胞器与周围环境隔离；保持细胞或细胞器内部理化性质的稳定；选择地允许或部允许某些物质通过，主动摄入或排出一些物质

生物转运过程的机理

1、被动转运

1）简单扩散：溶液中的化学物质分子，由浓集部位向各个方向分散，直到全部分子均匀分布在溶液中。

simple diffusion:化学物质由浓度较高部位透过生物膜向浓度较低部位分散的过程。特点：化学物不与膜起反应；不消耗代谢能量；膜两侧浓度差愈大，脂溶性愈高，其简单扩散速度快；

在毒理学上，是大多数化学物透过生物膜的主要转运方式。

简单扩散的条件：膜两侧存在浓度差；外来化合物有脂溶性；是非解离状态

2）滤过 filtration: 膜孔滤过指化学物通过细胞膜上的亲水性孔道透过细胞膜的过程。亲水性孔道：由嵌入脂质双分子层中的蛋白质结构亲水性氨基酸组成，不同的细胞膜，其孔径大小不一，小肠上皮细胞4Ao ，肾小球毛细血管内皮细胞为40 Ao。

动力：渗透压梯度和液体静压。在它们的作用下，大量水及分子直径小于孔道的化学物可经膜孔道，透过生物膜，完成其生物转运过程。

2、特殊转运

1）主动转运：不溶于脂质的亲水性化合物由低浓度处透过生物膜向高浓度处移动并引起消耗能量的过程。

特点：逆浓度梯度转运；通过载体；需消耗能量；具有一定的选择性，存在竞争性抑制，可饱和；

2）易化扩散（facilitated diffusion):指某些不易溶于脂质的亲水性化合物，透过生物膜由高浓度处向低浓度处转移的过程。

其机理：化合物与膜上的蛋白质或酶构成的载体结合（与主动转运相同），只能由高向低转移，它不需消耗代谢能量。

3）膜动转运：指细胞与外界环境之间进行的某些颗粒物或大分子物质交换过程。

此过程需要耗能。

吞噬（phagocytosis)胞饮(pinocytosis)胞吐（exocytosis）

气溶胶（aerosol)指固体或/和液体微粒稳定地悬浮于气体介质中形成的分散体系，其中的气体介质称为连续相，微粒称为分散相，其成分复杂，大小不一。

分布的原因

1）体内各种屏障：

血脑屏障，由中枢神经系统的毛细血管壁构成，为紧密融合在一起的扁平内皮细胞，管外包裹的星形胶质细胞。

胎盘屏障

2）与血浆蛋白质结合

a血浆中各种蛋白质均有结合其他化学物的功能，特别是白蛋白的结合量最高。

b不同的化合物与血浆蛋白质结合的量不同，结合型的化合物由于分子量大，不能跨膜转运，暂无生物效应，不能被代谢排泄，可延缓消除过程和延长化合物的毒作用。

作用：两重意义，即急性中毒的保护作用，使血液浓度降低；离开接触后，由于血液浓度下降，贮存库中的毒物重新就会释放进入血液，具有潜在的危害。

主要与清蛋白浓度、结合亲和力、与内源性物质的竞争结合的差异

3）与组织成分的结合

指组织中的一些特殊结合蛋白，包括各种蛋白质、粘多糖、核蛋白及磷脂。

特殊的亲和力，CO与血红蛋白；百草枯与肺

肝、肾组织：金属硫蛋白

4）脂肪和骨骼中的贮存

脂溶性的有机物易于分布和蓄积在脂肪组织内；铅、氟易于贮存在骨骼中；

双重性，降低血中毒物的浓度；重新释放，将造成潜在的危害

共氧化：指氢过氧化物的还原和其他底物氧化生成脂质氢过氧化物的过程

葡糖醛酸结合是II相反应中最普遍进行的一种，由UDP-葡萄糖醛酸基转移酶催化。谷胱甘肽结合，是由谷胱甘肽S-转移酶催化的GSH结合反应。它在亲电子化合物解毒及自由基解毒中起着重要作用

生物转化的复杂性

1)多样性：

a一种外来化合物在体内可能有多种不同的代谢转化途径，生成各种不同的代谢产物。

b同一化合物经不同的代谢，产生的毒性作用可能不同

c化合物在体内的生物转化类型取决于化合物的性质、剂量、环境及机体的因素，即影响毒性作用的因素。

2）连续性：外来化合物在体内的代谢转化常常是多个反应连续进行的。

3）两重性：生物转化的结果有解毒和增毒两种。当然，大多数是解毒。

4）代谢饱和:外来化合物在体内生物转化，由酶催化进行的，当其浓度到一定程度，也就是说代谢过程所需的基质可能被耗尽；代谢酶能力有限；造成单位时间内代谢产物不再随底物增加而增加，有可能发生代谢途径的改变，这种代谢途径被饱和的现象称代谢饱和（metablic saturation)。

5)代谢酶的诱导与抑制:酶的诱导（induction)指有些外来化合物可使某些代谢酶合成增加并伴有活力增强的现象。抑制（inhibition)则是表现为活力下降

影响毒性的因素可分为四大类：毒物、机体、接触条件及外界环境。

基础毒性分类：

根据接触毒物的时间长短分为急性毒性、短期重复剂量毒性、亚慢性毒性、慢性毒性。

相应所进行的观察和评价毒效应的试验即为急性毒性试验、短期重复剂量毒性试验、亚慢性毒性试验、慢性毒性试验。

急性毒性作用的有关参数

以死亡为终点（上限参数）

绝对致死剂量或浓度（LD100 或LC100)

半数致死剂量或浓度（LD50 或LC50)

最小致死剂量或浓度（MLD, LD01或MLC,LC01 )

最大非致死剂量或浓度（MNLD, LD0或MNLC,LC0 )

非致死性指标为检测终点（下限参数）

急性毒性LOAEL(观察到有害作用的最低剂量）

急性毒性NOAEL(未观察到有害作用的剂量）

为什么进行替代试验？？？

动物保护;降低试验成本;缩短试验周期 3R：替代，减少，优化

蓄积作用的意义

1.是外源化学物产生亚慢性、慢性毒作用的物质基础。

2.是评价外源化学物是否可能产生慢性中毒的重要指标。

3.在制订卫生标准时，蓄积毒性的大小是选择安全系数的重要考虑因素之一。

4.耐受也是蓄积毒性的表现之一。

亚慢性、慢性毒性试验

剂量与设组

原则：设3个剂量组和1个阴性（溶剂）对照组。设及剂量时应考虑人类的实际接触量。高剂量：动物表现出明显的中毒效应，不发生或仅有个别死（＜10% )。

中间剂量：动物出现轻度中毒效应，应相当于最小有作用剂量水平（LOAEL).

低剂量：无中毒反应,应相当于最大无作用剂量水平(NOAEL)。要高于人得实际接触水平。对照组：排除混杂因素

剂量组间的组距2~4倍，最大不超过10倍。

剂量设计参考原则和方法

?对能求出LD50的化学物：

参考同一动物种属品系和同一染毒途径的短期毒性资料，最高剂量组为1/10- 1/20LD50，最低剂量至少为人体摄入量的3倍。再设中间剂量。

?对食品药品等毒性很低的化学物：

药品以临床用药量的10,30,100倍（大鼠）

食品以人体摄入量的100，200,300倍（大鼠）

●慢性毒性试验:参考亚慢性毒性实验结果设计。

急性毒性作用概念及急性毒性实验目的;亚慢性毒性作用概念及亚慢性毒性实验目的;慢性毒性作用概念及慢性毒性实验目的;蓄积毒性与蓄积系数;LD50;NOAEL;LOAEL;ADI;脏器系数;食物利用率

化学致癌物

致癌机制：遗传毒性致癌物+非遗传毒性致癌物（表观遗传毒性致癌物）

代谢角度：直接致癌物+间接致癌物（前致癌物，近致癌物，终致癌物）

致癌阶段：引发剂+促长剂+助致癌物+完全致癌物

化学致癌的三阶段学说;化学致癌的机制;化学致癌物的分类;判断化学致癌物的试验方法2、选择致突变试验的成套观察项目（test battery）配套原则：

1. 多种遗传学终点兼顾。

2.多种物种兼顾。

3.体内和体外实验配合。

4.体细胞与生殖细胞兼顾。

致突变试验与致癌试验的关系

致突变试验是致癌短期筛检试验中的一种，可检出遗传毒性致癌物。但也能出现假阳性如遗传毒性非致癌物和假阴性如非遗传毒性致癌物。

1. 发育毒性（developmental toxicity）：指出生前后接触有害因素，子代个体发育为成体之前诱发的任何有害影响。具体表现为

◆(1)发育生物体死亡：吸收胎、流产、死胎、

◆(2)生长改变：

生长迟缓：生长发育指标低于正常对照均值的2个标准差

◆(3)结构异常：畸形，包括外观畸形，骨骼畸形，内脏畸形。

◆(4)功能缺陷：出生后个体免疫，神经行为缺陷，儿童早期肿瘤

2.发育毒理学（developmental toxicology)：

研究出生前暴露于环境有害因子导致的异常发育结局及有关的作用机制、发病机理、影响因素和毒物动力学等。是毒理学的重要分支之一。

3.畸形（malformation）：发育生物体解剖学上形态结构的缺陷。分为严重畸形和轻微畸形。严重畸形（major malformation）：对外观、生理功能和（或）寿命有明显影响

轻微畸形（minor malformation）：对外观、生理功能只有轻微影响或没有影响。

4.器官形成期（critical peroid)：从胚泡着床到硬腭闭合的时期，是畸形发生的关键时期，也成致畸敏感期。

5.致畸物(致畸原teratogen):能引起畸形的环境因子。

6.致畸作用（teratogenesis）致畸物引起畸形的过程。

7.致畸性(teratogenicity）：致畸物引起畸形的能力。

8.变异（variation）：同一种属的亲代和子代之间或子代的个体之间，出现不同程度的差异。变异由遗传和遗传外因素控制，或由于分化改变而引起。一般变异指小的或次要的结构改变，一般不影响正常生理功能，也不危及生命。值得注意的变异是致畸试验中，有剂量效应关系异常增多的变异。

9、胚体毒性（embryotoxicity）：外源性理化因子对孕体着床前后直到器官形成期结束时

的有害影响。

10、胎体毒性或胎儿毒性（fetoxicity）：对孕体器官形成期结束以后的有害影响。

11、胚胎毒性(embryo-fetal toxicity)：胚体毒性和胎体毒性的统称。一般指孕体的死亡和生长发育迟缓，不包括结构畸形。

12、出生缺陷（birth defect）：指出生前期即已形成的发育障碍，主要包括畸形和功能缺陷。

13、不良妊娠结局（adverse pregnancy outcomes）：指妊娠后不能产生外观和功能正常的子代，包括所有的不良后果。

不同毒性的主要毒性表现：

靶窗（target windows）：在器官形成期的致畸敏感期，不同的器官还各有特别敏感的时间。致畸带：对于致畸物而言，指从致畸最大无作用剂量（NOAEL）到胚胎100%死亡的最小剂量之间的剂量范围。

致畸带越大，潜在的致畸危险性越大