基因工程复习题及解答

1基因工程的基本步骤，其特点是什么?

狭义基因工程的基本五步：切、接、转、增、检。

a.从供体中分离出基因组DNA ，用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。

b.接，用DNA连接酶含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成DNA重组分子。

c.转，借助细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。

d.增，短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。

e.检，筛选和鉴定经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。

2基因工程的基本原理

a．利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因育载体重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中拷贝数，以提高其宏观表达水平。涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传的遗传学原理。

b．筛选、修饰、重组启动子、增强子、操作子和终止子等基因转录调控原件，并将这些原件与外源基因精确剪切，通过强化外源基因的转录水平而提高其表达水平。

c．选择、修饰、重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控后原件，强化受体细胞中目标蛋白的生物合成过程。（以上两步涉及基因表达调控的分子生物学原理。）

d．在强化并维持基因工程菌（细胞）最佳生产效能的基础上，从工程菌大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微生物反应器的增值熟读和最终数量，也是提高外源基因表达产物产量的重要环节。

3基因工程中载体的功能是什么？一个理想的载体具有哪些特征？

(1).载体有三大功能：a.为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。b.为外源基因提供在受体细胞中复制或整合能力。c.为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。

(2).理想载体所具有的4个特点：a.具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体入细胞的效率。b.具有与特定受体细胞相适应的复制位点和整合位点，使得外源基因在受体细胞中稳定的遗传。c.具有多种单一的核算内切酶识别切割位点，以便于外源基因的剪接插入。d.具有合适的选择性标记，以便于重组DNA分子的检测。

4在构建质粒载体时，质粒的基本特征中哪些被利用？哪些通常被除去？为什么？

（1）质粒的基本特征：a。自主复制性，质粒能够利用宿主细胞的DNA复制系统独立的复制并保持恒定遗传，由必要区和非必要区组成。必要区含复制相关的基因，决定质粒的存活与复制功能。非必要区主要含抗性、毒素分泌、复杂物质降解等性状的基因，影响细胞表型。

b.可扩增性，有有严谨型和松弛型两种复制形式。

c.不相容性，不同的质粒能稳定的存在同一受体细胞内称为质粒的不相容。

d.可传递性，质粒在一系列特定转移基因控制下，可以通过结合作用在宿主细胞间进行自然传递。

e.自带有遗传标记性状。

（2）理想的质粒载体所具有的特点：a.能高效的导入受体细胞。b.具有完整的复制子功能和整合位点，能在受体细胞中稳定的遗传。C.具有易被检测的合适的选择性标记。d.具有多种限制性内切酶的单一识别位点。e.具有尽可能小的分子质量。f.属于松弛型复制。g.属于非传递型质粒。

5.质粒载体构建的基本思路？

a.删除DNA非必要区域，尽量缩小质粒的相对分子质量，提高外源DNA片段的装载量。

b.灭活不需要的基因（如为提高拷贝数而灭活的质粒表达的负调控基因，为防重组质粒扩散污染而灭活mob基因。

c.添加易于识别的选择标记基因（最好具有双重或多重选择标记）。

e.在选择性标记基因内引入多酶切位点，即多聚接头，以便于外源基因的重组。

f.根据外源基因克隆的不同要求添加特定的调控原件或用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。

6不同质粒载体的用途

a.克隆质粒载体，用于克隆和扩增外源基因，含有氯霉素可扩增的松弛型复制结构，如pBR 系列，质粒拷贝数可达数千个/cell。

b.穿梭质粒载体，含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。

c.表达质粒载体，在多克隆位点的上下游有转录较高的启动子，合适的核糖体聚合位点（SD 序列）以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点的任何外源基因都能在受体细胞中高效表达。

d.整合质粒载体，含有整合酶基因以及整合特异性的位点序列，其上插入的外源基因在受体细胞中能够准确的重组到宿主染色体DNA的特定位点上。

e.测序质粒载体，含有测序通用引物互补序列和多酶接头

f.探针质粒载体，含有报告基因，用于筛选克隆基因的表达调控原件。

g．温敏质粒载体，在不同温度下表现出整合、拷贝数等不同性质

7λ-噬菌体载体的构建的基本步骤

a.缩短野生型λ-DNA的长度，提高外源DNA片段的有效装载量。

b.删除重复的酶切位点，引入单一的多酶切位点，构建多克隆位点。

c.灭活与列解周期有关的基因，使λ-DNA载体只能在特殊的条件下感染裂解宿主细胞，避免生物污染。

e.加入合适的选择标记基因，以便于重组噬菌体的检测。

f．根据需要构建密码子的琥珀突变体。

8比较质粒载体和病毒载体的基本特征

（1）λ-DNA的优点

a．λ-DNA可经过体外包装生成能高效转染E.coli细胞的噬菌体颗粒。

b．λ-DNA载体的装载量远大于质粒，可以达25kb。

c．重组λ-DNA分子的筛选和提取较为方便。

d．λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。

9了解基因工程中常用工具酶的功能和用途

a．核酸酶—切开、切除或降解核酸分子的酶。

b．连接酶—将两个DNA分子连接起来的酶。

c．聚合酶—催化DNA复制和修复DNA分子损伤的酶。

d．修饰酶—在DNA分子上去除或添加化学基团的酶。

e．拓扑异构酶—向共价闭合环状DNA分子中引入或消除超螺旋的酶。

10不同末端连接的方法，比较平头末端和粘性连接的效率，解释产生差异的原因

（1）四种不同的连接方法

a．两种DNA分子都具有5’黏性末端，在连接反应前两种DNA片段都用Klenow酶补平，

然后进行连接，因此产生的重组分子多出四个碱基。

b．两种DNA分子都具有3’黏性末端，可以用T4—DNA聚合酶将这两种DNA的3’黏性末端切除，形成平头末端后在连接，所产生的重组DNA分子少了4个碱基对。

c．一种DNA分子具有3’黏性末端，另一种DNA分子携带5’黏性末端。则3’黏性末端用T4—DNA聚合酶修平，而5’端用Klenow酶补平，因此重组的DNA分子并没有改变碱基数目。

d．两种DNA分子都具有不同的两个黏性末端，通常先用Klenow酶补平一种DNA分子的5’黏性末端，再用T4—DNA聚合酶切平3’黏性末端的另一端。

（2）DNA黏性末端的连接在退火条件下属于分子内部作用，而平头连接为分子间反应。因为平头末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平头末端的3’羟基或5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平头末端的连接速度要比黏性末端的慢10——100倍。

11了解重组率和转化率的概念及其影响因素和其在基因工程中的用途

（1）转化率的影响因素：

a．载体及DNA重组分子方面，载体本身的性质、载体的空间构象、插入片段的大小b．受体细胞方面，受体细胞与载体想匹配。

c．转化操作方面，受体细胞的预处理（影响最大）、供受体的比例（50-100ngDNA对应108受体细胞）、转化方法（Ca2+>原生质体转化法>λ-DNA转染>电穿孔法）。

（2）转化率的用途：利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验的规模。

12比较转化子筛选和重组子鉴定的三种基本策略的优缺点。

（1）基于载体遗传标记的筛选与鉴定

a．原理，利用载体携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子（但一般不能区分目标与非目标重组子）。

b．第一轮选择时，培养基施加合适的选择压力，使转化子能显示出(菌落或噬菌斑)，非转化子不显示出。

c．第二轮选择(通常原位影印到第二轮的板上进行)时，视标记基因的性质进行正选择或负选择，从转化子中筛选出重组子。

（2）基于克隆片段序列的筛选与鉴定

a．原理，根据被克隆基因(或DNA片段)的部分序列来筛选鉴定目标重组子，可作为目标重组子的一个证据。

b．PCR鉴定法、菌落原位杂交法、限制性酶切图谱法、亚克隆法、DNA序列测定法（3）基于外源基因表达产物的筛选与鉴定

a．通过鉴定基因表达的蛋白质产物的结构或功能来筛选和鉴定目标重组子。因此重组子必须含有相应的表达元件，并且受体细胞本身不产生具有相同结构和功能的蛋白质。b．蛋白质生物功能检测法、放射免疫原位检测法、蛋白凝胶电泳检测法。

13了解目前常用的分离克隆目标基因的表达方法原理及适用范围

单一目的基因克隆的获得方法主要有两类：构建基因文库，用适当的方法从文库中筛选后的目标基因的重组克隆；用PCR技术合成单一的目标基因，在构建克隆进行表达。

主要方法：鸟枪法、cDNA法、PCR扩增法、化学合成法、基因文库的构建

3.1 在载体水平上影响大肠杆菌细胞中外源基因高效表达的的因素有哪些？

a．启动子，大肠杆菌及噬菌体的启动子是控制外源基因转录的重要元件，mRNA的生成速率与启动子的强弱密切相关，而转录又在很大程度上影响蛋白质的合成。

b．终止子，外源基因在强的启动子的介导下表达容易发生转录过头的现象，形成长短不一的mRNA混合物。过长的产物不仅影响mRNA的翻译效率，也使外源基因的转录速度大幅度降低。

c．SD序列，外源基因在大肠杆菌中高效表达不仅取决于转录启动频率，还与mRNA的翻译起始效率密切相关。mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译起始效率就越高，而这种结合程度取决于SD序列与16rRNA的碱基互补性。

d．密码子，基因对简并密码子的选择具有一定的偏爱性。

e．质粒的拷贝数，常使用的表达型质粒在E.coli细胞中的拷贝数可达数百到上千，质粒扩增通常发生在对数生长期内。但质粒的过度增殖以及随后目标基因的高效表达也会影响受体细胞的生长代谢，导致重组质粒的不稳定性以及外源目标基因宏观表达水平的下降。

2. E.coli基因工程菌的构建策略组要有哪些？其基本特点如何？

基本策略有：包涵体型异源蛋白的表达、分泌型异源蛋白的表达、融合型异源蛋白的表达、寡聚型异源蛋白的表达、整合型异源蛋白的表达、蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建a．包涵体型异源蛋白的表达，大部分存在于细胞质中，基本上由蛋白质组成，其中大部分是外源基因表达的产物，具有正确的氨基酸序列，但空间构象往往是错的因此没有生物活性。其优缺点：能简化外源基因表达产物的分离操作，能在一定程度上保持表达产物结构的稳定。但包涵体纯化过程中，重组蛋白收率有一定损失，且需要复性过程来恢复重组蛋白的天然活性结构。

b．分泌型异源蛋白表达，蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白分泌的前提条件。优缺点：1其目标蛋白产物的稳定性大大提高，2蛋白无论是分泌到细胞质中还是直接进入培养基，均可简化后续操作3目标蛋白产物的末端成天然状态。但是，E.coli蛋白分泌机制并不健全，外源基因很难在E.coli中分泌型表达。

c．融合型异源蛋白的表达，将外源基因与受体细胞自身蛋白质基因拼接在一起，作为统一阅读框架进行表达。有这种杂合基因表达出的蛋白成为融合蛋白，受体细菌蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。优缺点：1稳定性大大增强2分离纯化构成简单3表达高效。但是，1目标蛋白需要回收，融合蛋白经过进一步裂解分离才能获得目标蛋白。d．寡聚型异源蛋白的表达，将多拷贝外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达。适合于低分子量的外源蛋白或多肽的高效表达。

e．整合型异源蛋白的表达，将外源基因整合到受体细胞染色体的特定位置上。其优缺点：1目标基因表达稳定，2解决了解决重组质粒丢失的问题。但是，1目标基因表达效率低。f．蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建，通过蛋白序列的人工设计以及受体细胞的改造(构建多种蛋白酶专一或多重缺陷的 E.coli突变株)可以对重组目标蛋白在受体细胞内的半衰期进行调控。

3.包含体形成的基本机制主要有那些？

a.折叠状态的蛋白质集聚作用

b.非折叠状态的蛋白质集聚作用

c.蛋白折叠中间体的集聚作用

4. 高效表达的E.coli基因工程菌中影响重组蛋白形成包含体的因素主要有那些？

a.温度

b.表达水平

c.细菌遗传性状

d.异源蛋白氨基酸序列

5.影响外源蛋白复性的因素主要有那些？

a.浓度

b.温度

c.PH值

d.折叠促进剂

e.稀释倍数

6．基因工程菌遗传不稳定性产生的机制主要有那些？

a.细胞的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解作用

b.外源基因高效表达对受体菌正常生长代谢的严重干扰——能量、物质的匮乏和外源基因

产物的毒性作用

c.细胞分裂时重组质粒的不均匀分配——这是重组质粒逃逸的基本原因

d.受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排

7．目前可采用的改善基因工程菌不稳定性的对策主要有那些？（PDF49）

?改进载体宿主系统

?施加选择压力

①抗生素添加法

②抗生素依赖法

③营养缺陷法

?控制目的基因的过量表达

?优化培养条件

①培养基组成

②培养温度

③比生长速率

c-4

1. 同E.coli相比，酵母作为基因工程受体的主要优点有那些？

2. 酵母菌的宿主系统有那些类型及其特点？

a.提高重组异源蛋白产率的突变宿主特点：只有那些能促进任何外源基因分泌表达的基

因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体细胞。

b.抑制超糖基化作用的突变宿主

c.减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主

d.内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主

3.酵母菌的常规转化方法有那些？

a.酵母菌原生质体转化法

b.碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化

c.酵母菌电穿孔转化法

4.酵母菌的启动子可控性表达系统主要有那些类型及其特点？

a.温度控制表达系统

b.超诱导表达系统

c.严紧控制表达系统

5.影响酵母高效表达外源基因的主要因素有那些及其特点？

a.外源基因稳态mRNA的浓度

b.外源基因mRNA的翻译活性

c.酵母菌对密码子的偏爱性

d.外源基因稳态mRNA的半衰期

c-5

1.了解转基因和转基因技术等的概念

转基因和转基因技术——通过DNA操作整合到动（植）物染色体上的外源基因称为动（植）物转基因。为获得转基因在受体细胞中的稳定表达而采用的重组子构建技术、转化技术、重组DNA的稳定整合及可控性表达技术等统称为转基因技术。

2.动物细胞常用的转化或转染方法有那些？

动物细胞物理转化法

a.磷酸钙共沉淀法

b.电击法

c.脂质体包埋法

d.DNA显微注射法

动物病毒转染法

a.腺病毒

b.猴肿瘤病毒

c.牛痘病毒

d.反转录病毒

工程胚胎干细胞法

体细胞转基因克隆法

3. 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本途径有那些？

a.通过强化基因扩增高效表达外源基因

b.通过强化基因转录和翻译来高效表达外源基因

c-6

1.高等植物的基因转移系统有那些类型及其特点？

(1) Ti质粒介导的整合转化系统

a.适用较广——不仅适用于大多数双子叶植物，而且转化部分单子叶农作物也获得成成

功，目前>80%的转基因植物是通过此法获得。

b.转基因植株再生率高。

c.重组基因能稳定遗传——通常不会发生基因重排等，但也可能出现重组基因沉默现象。

d.拷贝数低——大多数为单拷贝转移。

(2) 植物病毒介导的转染系统

a.优点：1）病毒繁殖快，外源基因拷贝数可在短期内大量增加，可高效表达外源基因；

2）重组遗传操作简便，接种感染植株方便，可满足产业化操作的需要；

3 ）可感染单子叶植物，扩大了转基因的适用范围；

4）病毒易纯化。

b.缺点：部分病毒的重组分子易丢失外源基因，遗传不稳定。

(3) 植物细胞的直接转化方法

(4) 植物原生质体的再生

2.高等植物细胞的直接转化方法有那些？

(1)植物细胞的物理直接导入法

a.电穿孔法——较常用

b.激光微束穿刺法——较少使用

c.碳化硅纤维法——较少使用

d.显微注射法——较少使用

e.基因枪枪击法——常用

(2)植物细胞的化学直接导入法

a.聚乙二醇（PEG）法

b.脂质体法

(3)植物细胞的生物直接导入法

主要指花粉通道转化法。主要优点是简便、直接，特别适合难以建立有效再生系统的植物。

1.基因工程：是一项将一种生物的某个基因（目的基因）通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，

使之无性繁殖并行使其正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。

2.同裂酶：来源不同的限制酶识别序列相同，产生同样的切割，形成同样的末端，这类酶称为同裂酶。

3.同尾酶：来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,称为同尾酶。

4.COS位点：λDNA进入宿主细胞后，能连接后形成环状DNA的粘性末端。

5.启动子：一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，一般位于表达基因的上游。

6.终止子：能有效控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA的稳定性，避免质粒上其他基因的异常表

达。

7.包涵体蛋白：在一定的条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜

的裸露结构，这种结构称为包涵体蛋白。

8.接头：是一段含有某种限制性内切酶识别序列的人工合成的寡聚核苷酸。

9.引物：是人工合成的两段寡核苷酸序列，一条引物与目的区域一端的一条DNA模板链互补，另一条

引物与目的区域另一端的另一条DNA模板链互补。

10.探针：指经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。

11.质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中的现象。

12.限制性核酸内切酶：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割双链DNA特意位点的酶。主要存在于

原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用。

13.感受态：Ca2+诱导的完整细胞的转化

14.引物在基因工程中至少有4个方面的用途：（1)合成握针（2）合成CDNA（3）用于PCR反应（4）进

行序列分析