蛋白质工程
蛋白质工程绪论
对已存在的蛋白质分子进行改造
蛋白质分子的稳定性（热稳定性、化学稳
定性、压力稳定性、催化效率），不良反
应，半衰期，免疫原性，生物活性
发展简史
1926 脲酶纯化酶的本质是p，核糖核酸酶
1953 牛胰岛素肽链结构的解析
1965 人工合成牛胰岛素蛋白
1982 基因定点突变首次应用（酪氨酰tRNA合成酶）
1983 protein engineering 的发表（正式诞生）1988 首次从头设计新蛋白研究内容
1. 蛋白质结构分析——基础
2. 结构、功能的设计和预测——基础的应用与验证
3. 创造/改造蛋白质——新蛋白——终目标
应用：
抗病毒药β-干扰素稳定性的改进。
酪氨酰tRNA合成酶
改变酶的专一性
蛋白质的理化性质一、热力学函数
内能：组成物体的所有分子的无规则运动的动能与分子间相互作用的势能之和。
·焓：是一个系统的热力学参数。它描述的是体系的一个状态性质，它的改变量仅仅取决于系统的始态和终态，用符号H表示，即： H=E+pV其中，E为系统内能，p为其压强，V则为体积。·熵（S）:是度量体系混乱度的热力学函数。
从微观的角度来看，熵具有统计意义，它是体系微观状态数(或无序程度)的一种量度。熵值小的状态，对应于比较有秩序的状态，熵值大的状态，对应于比较无秩序的状态。
·热力学第一定律：能量既不能创生也不能消灭。用数学方式表达为：ΔU = 0，其含义是，在任何隔离系统中系统储藏的能量不变。能量守恒·热力学第二定律：自发过程向熵值（宇宙的总的混乱程度）增加的方向进行。用数学方式表达为：ΔS ＞ 0，其含义是，在任何隔离系统中，不违背第一定律的过程得以进行的最起码的条件是该系统的熵值增加。
吉布斯自由能(G):亦称吉布斯函数，它是定温定压下系统的状态函数。可以用公式表示为：
G = H - TS 当ΔG＜0 时，自发过程，被称为是放能的过程，它们可以用来做功；
当ΔG＝0 时，反应已达到平衡，即其正向过程和逆向过程正好处于平衡；
当ΔG＞0 时，非自发过程，被称为吸能的过程，必须注入自由能才能驱动此类过程。
稳定蛋白质三维结构的作用力：氢键、范德华力、疏水作用力和盐键（离子键）及共价二硫键。
盐桥或离子键又称盐键，它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。
盐键的形成既是静电相互作用的过程也是熵增的结果。
·范德华力有三种来源：
取向力 :取向力是极性分子间的固有偶极同极相互排斥异极相互吸引，定向排列，产生分子间作用力。
诱导力 :诱导力是极性分子与非极性分子的固有偶极与诱导偶极间的作用力，它的大小与分子的极性和变形性等有关。
色散力 :色散力是非极性分子间瞬时偶极距的相互作用力。
范德华力包括吸引力和斥力。
发挥生物活性的最稳定结构中有重要作用
疏水效应:水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。这一现象被称为疏水作用或疏水效应.蛋白质溶液系统的熵增加（熵变化?S为正值）是疏水作用的主要动力。二硫键
又称S-S键是共价键。是2个SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的键。在生物化学的领域中，通常系指在肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键。
为了确定蛋白质的一级结构，须在2-巯-乙醇、二硫苏糖类、巯基乙酸等的硫化合物与尿素等变性剂同时存在下将二硫键打开.
二硫键对肽链的正确折叠不是必要的，但它对稳定折叠态结构作出贡献。RNA酶复性实验。
二、蛋白质折叠
（一）历程
二级结构的形成，稳定，多途径折叠，天然态的形成
（二）蛋白质折叠的速度机制
假定每个氨基酸残基可能的构象状态数为j，一个有N+1个氨基酸残基，N个肽单位的完全去折叠蛋白质，其肽链可能获得的构象状态数为j N。例如j=8,一个有101个氨基酸残基的较小的蛋白质，其肽链的可能构象状态为8100（1089）。
如果构象之间的转换速率为k，蛋白分子经历全部构象的平均时间为：
τ=（Nk）-1j N
蛋白质的折叠不是一个随机过程，是通过特定的动力学途径达到天然构象，即动力学上最容易达到的构象（三）蛋白质折叠热力学
蛋白质的折叠结构在一定条件下是热力学最稳定的,即通常的自由能极小的状态。由熵函数和吉布斯自由能
（四）其它常见的折叠病
折叠病：蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或构象有所改变也能引起疾病。
老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、白内障等。疯牛病-朊病毒：致病蛋白-朊病毒蛋白(PrP)在脑组织中累积而引起的
（1）由一种称Prion的蛋白质的感染引起的（2）致病Prion 与正常Prion 的一级结构完全相同，只是空间结构不同
（3）致病蛋白Prion 通过蛋白分子间的作用，感染正常蛋白Prion 转变为致病的折叠状态
蛋白质的分子生物学改造:——理性设计&非理性设计一、蛋白质的化学修饰（理性设计）
（一）侧链基团修饰
1、氨基——赖氨酸的Σ氨基
①氨基修饰剂：三硝基苯磺酸（TNBS）:生成三硝基苯基化的氨基磺酸复合物，在420nm处能产生特定光吸收
②氨基烷基化试剂：卤代乙酸、芳香卤和芳香族磺酸
③氨基甲氨酰化：氰酸盐
④赖氨酸氨基在中性pH下与磷酸吡哆醛（PLP）反应形成席夫碱后再用硼氢化钠还原，生成PLP衍生物。在325nm处有最大吸收峰，可用于定量检测
2、羧基——谷氨酸和天冬氨酸残基，产物一般为脂类或酰胺类，水溶性的碳二亚胺
3、巯基
巯基有很强的亲核性，容易发生反应
烷基化试剂：碘乙酸和碘乙酰胺
N-乙基马来酰胺：产物在300nm处有最大吸收5,5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）与巯基反应生成二硫键，释放1个2-硝基-5-硫苯甲酸阴离子，在412nm处有很强吸收峰
氧化：过氧化氢与巯基形成二硫键，大量时形成磺酸，也可以生成次磺酸
4、二硫键的化学修饰
用过量的巯基乙醇将二硫键还原为游离巯基
鉴定有无及位置：非还原、还原双向SDS电泳5、其他精氨酸的胍基-丁二酮
组氨酸的咪唑基-氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代，焦炭酸二乙酯（DPC）-产物在240nm有吸收和碘代乙酸
色氨酸的吲哚基-N-溴代琥珀酰亚胺（NBS），280nm处光吸收减少
酪氨酸-四硝基甲烷（TNM）生成发色基团3-硝基酪氨酸衍生物
（二）蛋白质位点专一性修饰
1、亲和标记：（不可逆抑制作用）酶活性部位
2、光亲和标记
（三）PEG修饰
蛋白质和PEG偶联的部位有：氨基、羧基和巯基功能
①掩盖蛋白质表面抗原决定簇→不与受体结合，不被机体免疫系统识别，避免相应抗原的产生，降低蛋白质的免疫原性
②大分子的屏障效应阻碍蛋白酶的降解
③减少肾小球的排出，
④半衰期延长
⑤改善蛋白质生物分布及溶解性能
（四）化学交联和化学偶联
交联：分子亚基内部，多个蛋白质分子间形成网状交联，
偶联：将一个蛋白质分子偶联到一个化学惰性水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白质
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获取目的基因片段的方法：
化学合成法
PCR法
基因文库法
cDNA文库法
目的基因转入宿主细胞
转化
转染
显微注射
电穿孔
重组子的筛选
抗生素抗性筛选法：含拮抗抗生素表型的重组子可在含抗生素环境生长
互补筛选法：载体的表达产物与宿主细胞中营养缺陷型突
变发生互补作用
营养缺陷型筛选法：载体携带某些营养成分的编码基因，只有含转化子的菌落才能够在缺少该营养物质的培养板上生长从而实现筛选
噬菌斑筛选法：经噬菌体载体包装的外源重组DNA转染宿主细胞，转化子在固体培养板上出现清晰的噬菌斑
宿主细胞表达系统
原核：大肠杆菌
真核：酵母昆虫细胞、哺乳动物细胞
二、定点突变
（一）寡核苷酸引物突变
通过聚合酶的作用启动DNA分子进行复制，用含有突变碱基的
寡核苷酸片段作引物合成DNA子链的一部分。
引物中除了所需的突变碱基之外，其余部分则应与目的基因编
码链的特定区段完全互补.
①将待突变基因克隆到突变载体上;
②制备含待突变基因的单链模板;
③引物与模板退火5’端磷酸化的突变寡核苷酸引物, 与待突
变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA
④合成突变链: 在DNA 聚合酶的催化下, 引物以单链DNA为模
板合成全长的互补链, 而后由连接酶封闭缺口,产生闭环的异
源双链的DNA 分子;
⑤转化和初步筛选异源双链DNA分子,转化大肠杆菌后, 产生
野生型、突变型的同源双链DNA 分子。可以用限制性酶切法、
斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因;
⑥对突变体基因进行序列分析。
（二）PCR突变
1、重叠延伸PCR
四种扩增引物、三轮PCR反应
应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧
引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，
两者在其重叠区段具有同样的突变。
两条双链DNA片段经变性和退火处理，形成两种不同形
式的异源双链分子。
然后选用两个外侧寡核甘酸引物进行第三轮PCR扩增，
可得到一种含有突变位点的突变体DNA。
2、大引物突变法:
三种扩增引物、两轮PCR反应
将第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增引物
优缺点：突变率高、需先连接载体、需测序确定突变
3、扩增环状质粒全长
用两个突变引物同时对质粒DNA扩增，扩增产物依次通
过KpnI限制性内切酶酶切，Pfu DNA聚合酶补平，T4DNA
连接酶连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆
（三）盒式突变
利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。特点：简单易行，突变率高，可以在一对限制酶切位点内进行一次突变而获得多个位点缺点：需存在酶切位点
非理性设计：
一、定向进化
不用事先了解酶的结构、活性位点、催化机制等
各种因素，只需人为地控制进化条件，以希望模
拟天然进化机制来达到体外对酶基因进行改造，
产生基因多样性，并通过定向筛选或选择技术获
取定向选择的具有特定性质的突变酶的目的。
基本原则：获取你所筛选的突变体
定向进化=随机突变+定向选择
特点:快速简便
能控制突变频率
使用低保真度的Taq DNA聚合酶或改变PCR常规的反
应条件,引起碱基以某一频率进行随机错配而引入多
点突变,构建突变库,选择或筛选出所需的突变体。理
论上每个靶基因导入的取代残基在1.5~5个之间
连续易错PCR
（二）DNA改组
原理:用DNase I或者超生波进行切割产生随机大小
片段，再从正突变基因库中分离出来所需的DNA片段，
得到的随机片段在不加引物的多次PCR循环中，彼此
之间互为模板和引物进行扩增，直到连接成为接近目
的基因长度的DNA分子，然后再利用基因两端序列为
引物扩增获得全长基因。
（三）随机引物体外重组法
以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，
产生大量和模板不同位点互补的短片段，再进
行PCR时，它们之间可以相互同源引导和重组
进行合成。
特点：突变率和重组频率可通过改变随机引物
的长度、浓度、时间、温度及其它反应条件来
控制。
（四）交错延伸法(StEP)
它是在PCR反应中，将含有不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂的复性/延伸，反复重复直到形成全长基因片段。
特点：
1.缩短反应时间
2.新生DNA分子含有大量的突变组合
3.可通过控制反应条件和时间来进行调节
三、融合酶
主要是指将两个或多个酶分子组合在一起所形成的融合蛋白.
杂合酶，把不同酶中的部件有机的组合在一起从而在分子水平上出现了杂种优势
非理性设计法:通过构建库,再从中筛选出所需要的融合体
理性设计法:要求对操作对象的结构和功能有一个全面的了解,才能实现几个蛋白质的交换融合.
构建策略
注意：蛋白质的融合通常在同系之间进行，因为同源蛋白质序列的相似性越低，融合后导致酶活性丧失的可能性越大，并且其动力学参数、底物专一性、热稳定性、最适pH等基本特性越易改变。
二级结构融合:
在融合酶中具有特定功能的二级结构的互换可原酶和硫辛酰胺脱氢酶的辅助因子结合结构互换,实现了NADH和NADPH辅因子的互换.
功能域融合:
如果酶的活性部位位于不同的结构域上，可以通过功能域的程序化组合来生产新的融合酶。
整个酶蛋白的融合:
两个或多个酶蛋白融合在一起就可以产生具有多个功能的融合酶。
应用
理论研究方面
1.确定蛋白质结构与功能的关系
2.确定蛋白质之间的相互作用
实际应用方面
1.非催化特性的优化
2.创造新催化活性酶
3.研究酶及其它蛋白质的定位及移动
4.在酶内部创建别构作用
蛋白质纯化
蛋白质纯化的一般程序
预处理将蛋白质从目的材料释放，天然状态影响蛋白至提取率和纯度
一、细胞破碎：
反复冻融法：破坏细胞膜的疏水键、溶胀
细胞--------融解--------融解…
超声波处理：超声波的机械振动破碎细胞方法简单，重复性好
3、化生法
自溶法：特定ph和温度下，细胞自溶，时间长，需要防止细胞污染
酶溶法：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、蛋白酶、甘露糖酶、脂酶…细胞壁、细胞膜--生物酶-细胞溶解控制温度、酸碱度、酶用量、先后次序、时间，加入巯基试剂、尿素能增加效果
溶菌酶：要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞
? 蜗牛酶：从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等
20多种酶 。
? 纤维素酶：葡聚糖内切酶 、葡聚糖外切酶和β－葡萄糖糖苷酶三个主要成分组成的复合酶系。 ? 半纤维素酶：木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯半乳糖酶和木葡聚糖酶等多组酶的
总称。
? 脂酶：一种催化脂类的酯键水解反应的水溶性酶。脂酶是酯酶下的一个亚类。 4、化学渗透法
二、蛋白质的抽提：
（选择合适缓冲液把蛋白质提取出来注意温度，防蛋白变性、降解（加入蛋白酶抑制剂）将蛋白质与非蛋白质分离，将各种不同的蛋白质分离。 1. 沉淀法 （1）盐析法
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响；蛋白稳定因素：水化膜，电荷。蛋白质在低盐浓度下溶解度随盐浓度的增高而上升（盐溶），当盐浓度升高到一定程度时，其溶解度呈现不同程度下降，并不断析出（盐析）。盐析是由于，盐浓度增高到一定数值，使水合作用降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。
盐溶：在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加。
盐析：盐浓度比较高，随着盐浓度升高，蛋白质的溶解不同程度下降并先后析出 离子强度对盐析过程的影响 Cohn 经验公式： I
K S s -=
βlog
S--蛋白质溶解度，mol/L ，I--离子强度；
Β--盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；
Ks--盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。
?Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；
?β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅
度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。
?Ks盐析法：由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前
处理。
△盐析用盐的选择：
半径小的高价离子盐析作用较强；半径大的低价离子盐析作用较弱。
（Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁
常用的盐析用盐：硫酸铵：溶解度大（767g/L）、硫酸钠、磷酸盐、柠檬酸盐
△影响盐析的因素
①溶质种类的影响：Ks和β值
②溶质浓度的影响：浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨率低；
③pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近；
④盐析温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度↑，蛋白质溶解度↓；
（2）有机溶剂沉淀法
蛋白质在一定浓度的有机溶剂的溶解度差异而分离
△优点：
分辨能力比盐析法高；沉淀不用脱盐；
生化制备应用比较广泛△缺点：
容易使蛋白活性丧失，操作温度低
有机溶剂的选择：能和水混溶：乙醇、甲醇、丙酮、DMSO…
△有机溶剂沉淀法的影响因素
①温度：低温降低溶解度，保持蛋白活性
②样品浓度和ph：样品浓度高，共沉淀高，等电点时蛋白溶解度最小
③金属离子：多价阳离子降低蛋白质溶解度，不影响其活性，盐浓度不能过高<5%,使用乙醇不超过2倍体积
（3）等电点沉淀法
不同的蛋白质有不同的等电点，位于等电点时，溶解度最低，
蛋白质与金属离子结合，等电点会偏移。等电点方法多与其他方法联合使用，注意要制备的蛋白质对酸碱的稳定性，活性的影响
（4）生成盐复合物沉淀法
金属复合盐法：蛋白质在碱性溶液中带负电，能与金属离子形成沉淀。
有机盐法：含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能如蛋白质分子的碱性集团形成复合物沉淀析出。
无机复合盐法：无机盐如磷钼酸盐，磷钨酸盐等与蛋白形成复合物的溶解度低，极易沉淀析出。常发生不可逆的沉淀反应，使蛋白变性。
（5）选择性变性沉淀法
利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对物理或化学因素敏感的差异，有选择地使之变性，以达到分离的目的。可利用的因素有：
⑤表面活性剂或有机溶剂（如三氯乙酸）
⑥温度
⑦酸碱变性…
（6）非离子多聚物沉淀法
溶液 -除去-大颗粒-调整-ph、温度-加入- 中性盐和多聚物-冷储-沉淀
非离子聚合物如聚乙二醇（PEG）, 壬基酚聚氧乙烯醚（NPEO）, 葡聚糖，右旋糖酐硫酸钠…
原理：PEG在溶液中形成了网状结构，与溶液中蛋白质分子发生空间排斥作用，使蛋白质分子凝聚、沉淀。蛋白质的分子量越大，所需的PEG浓度越低；ph越接近等电点，所需的PEG浓度越低。
（7）免疫共沉淀：
将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。
（8）聚沉：
在聚沉剂的作用下，使胶体的微粒相互聚集为较大的聚沉物。
原理是：①中和胶粒的电荷、②加快其胶粒的热运动以增加胶粒的结合机会，使胶粒聚集而沉淀下来。聚沉剂主要是无机盐类（氯化锌，氯化铁…）和聚合无机盐（聚氯化铝、聚氯化铁…）
方法：
?加入电解质，增加了胶体中离子的总浓度，而给带电荷的胶体粒子创造了吸引相反电荷离子的有利条件，从而减少或中和原来胶粒所带电荷，使它们失去了保持稳定的因素。
如：豆浆做豆腐时，在一定温度下，加入CaSO4(或其他电解质溶液)，豆浆中的胶体粒子带的电荷被中和，其中的粒子很快聚集而形成胶冻状的豆腐（称为凝胶）
?加入带相反电荷的胶体，也可以起到和加入电解质同样的作用，使胶体聚沉。
如把Fe(OH)3胶体加入硅酸胶体中，两种胶体均会发生凝聚。
?加热胶体，能量升高，胶粒运动加剧，它们之间碰撞机会增多，而使胶核对离子的吸附作用减弱，即减弱胶体的稳定因素，导致胶体凝聚。
如长时间加热时，Fe(OH)3胶体就发生凝聚而出现红褐色沉淀。
（9）絮凝
在絮凝剂的作用下，将不稳定颗粒诱导结合到一起，逐渐紧密，随后形成更大的凝聚物。
淀粉、树脂、单宁、离子交换树脂和纤维素衍生物。无机絮凝剂主要是依靠中和粒子上的
化学絮凝：加入絮凝剂后由于彼此的化学反应造成胶质粒子的不稳定状态。
物理絮凝：加入与胶体粒子具有不同电性的离子溶液时,会发生凝结作用，中和电性,不稳定的胶体粒子再互相碰撞而形成较大的颗粒。碰撞后粒子便经由不同的物理化学作用而开始凝集,较大颗粒粒子从水中分离而沉降。
2.透析法
利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。可以除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品。透析平衡需要的时间比较长，耗时。透析膜可能含有极微量的硫化物、重金属离子和其他杂质，需要预处理。
透析关键：半透膜透析的动力：扩散压
截留分子量（MWCO）：能通过膜的最大分子量。实际中，MWCO比所需要的蛋白质分子低20%以上。
超滤主要用于蛋白质的脱盐、脱水和浓缩。
关键：半透膜
超滤是加压膜分离技术，对水溶液施加压力，使小分子溶质穿过膜，大分子被截留。
三、蛋白质的纯化——色谱
利用混合物各组分的物理化学性质（分子的性质和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数）的不同，使各个组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分因流动的速度不同而分离的技术。
凝胶过滤
△凝胶介质的选择
基本条件：
①惰性：凝胶不与目的蛋白和流动相不发生任何作用
②水不溶性
③能高度水化。较广的pH和温度范围，寿命长
组别分离：选择将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶，常选用排阻极限较小的凝胶类型
分级分离：所选凝胶的分级范围的中间值接近目的蛋白的分子量
凝胶颗粒的直径约小，分离效果越好，流速慢，分离时间长
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。
△凝胶柱的操作 装柱
（1）选择色谱柱：
① 防腐，
② 死体积小于0.001Vt
③ 凝胶柱长度25-70cm ，内径4-16mm H/D(高径比)=｛（25：1）-（100：1）｝
分辨率↑，H/D ↑。填装小颗粒凝胶使用直径较大的色谱柱，用粗颗粒时用直径小的色谱柱 （2）凝胶预处理：
干胶+5-10体积的洗脱液溶胀。溶胀后将凝胶匀浆悬浮，去上清杂质或不均已的细小颗粒 不能用沸水加热，凝胶>40℃开始溶解
干胶用量= 1.1-1.2x 柱床体积/凝胶的床体积 （3）步骤（柱床均一，不能有气泡）
① 制备凝胶匀浆 ② 安装色谱柱 ③ 测定Vt ④ 灌胶平衡
⑤ 检测柱床和柱效 样品和缓冲液的准备 （1）蛋白样品制备：
洗脱缓冲液溶解蛋白初品，稳定性好 蛋白样品液不能太浓 0.45um 过滤
（2）缓冲液的准备： 样品的溶解性、稳定性
样品与凝胶介质可能发生的吸附 加样和洗脱
（1）加样体积：不能超过两组分的洗脱体积之差，较小，分辨率更好， 一般为柱床体积的1%-5% （2）加样方法：洗脱液平衡柱后，液面降至床面2-3mm ；吸取样品缓慢加入凝胶床内，打开出水，降低液面至床面，小心吸取缓冲液冲洗样品，打开出水，降低至床面，然后加入缓冲液开始洗脱
（3）洗脱：固定流速，按每管2-5ml 定量收集，并排好顺序。观察基线，不再上升说明样品已完全洗出。
凝胶柱的再生和保存 （1）清洗和再生
用洗脱缓冲液继续清洗，加入0.2mol/L NaOH 或2%的蛋白酶液
（2）保存：0.02%的叠氮钠或0.002%洗必泰 4℃保存，脱水干燥
△凝胶过滤色谱的应用——分子量的测定
（1）凝胶色谱体积参数 洗脱体积 ： V e = V O +K d V i
K d -分配系数，在（0，1）之间。 完全排阻的大分子，洗脱体积V e =V O ， 完全渗透的小分子的洗脱体积 V e = V O +V i （2）原理
Kav ＝－b logMw + C ； Ve ＝－b'logMw + C' 其中 b,C 为常数。
在一恒定的凝聚色谱系统中， Ve 越大，Kd 越大 Ve-洗脱体积：某一被分离样品从凝胶柱内完全被洗脱出来所需的体积， （3）测定方法
蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关，先测得几种标准蛋白质的Ve ，并以其分子量对数对Ve 作图得一直线，再测出待测样品的Ve ，查标准曲线即可确定分子量。
离子交换层析
（1）概念：蛋白质分子在一定pH 条件下所带电荷多少和电荷排布不同，它们与带电的凝胶颗粒（离子交换剂)的电荷相互作用也不同。通过改变溶液的离子强度或溶液的pH 来洗脱蛋白质。增加溶液的离子强度，可以增加离子间的竞争作用，降低离子交换剂和蛋白质所带电荷之间的静电引力；改变溶液pH ，使待分离物质的解离度降低，从而降低与离子交换剂的亲和力。
（2）洗脱顺序：蛋白质分子所带电荷中与离子交换剂所带相反电荷越多，结合能力越强，越是后面被洗脱下来 （3）凝胶介质
分类
根据交换基质与水的亲和力分为：
①疏水性离子交换剂：如苯乙烯与交联剂二乙烯苯的聚合物
②亲水性离子交换剂：纤维素、葡聚糖、琼脂糖等
实验操作
①选择合适离子交换剂：
考虑因素：
?被分离物质带何种电荷
?被分离物质分子的大小：大分子物质选用凝
胶，其次选用纤维素
?被分离物质所处的环境
?被分离物质的物理化学性质
?被分离物质的大概数量②缓冲液的选择
原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性；
③确定合适的pH值
④洗脱剂
原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团
改变pH或离子强度
增强洗脱液与离子交换剂的结合力；降低分离物与离子交换剂的结合力
聚焦色谱
亲和层析
利用生物大分子之间有专一的亲和力而达到分离纯化的层析方法
优点：
①纯化过程简单、迅速
②分离效率高
③实验条件温和缺点：
④针对某一分离对象制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件
⑤配基的选择及其与基质的共价结合需要烦琐的操作步骤
基本过程
①固相化
配基:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。
对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 必须具备能被修饰的功能基团
基质(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。要求：
有丰富的可供活化的化学基团，并在温和条件下能与配基共价结合。
惰性的，非专一性吸附无或足够小。
多孔网状结构。
良好的机械性能，具有好的液体流动性。 有较好的物理和化学稳定性。
琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶②吸附
③洗脱
非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗
脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢
复到天然结构
特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于非专一吸
附上去的杂蛋白
④再生
亲和层析拄可在一次层析后用大量洗脱剂连续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡，经处理后的层析柱能再次使用。
蛋白质组学
定义：
一个基因组、一个细胞或一种生物表达的全部蛋白质
所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。
同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。
在空间和时间上动态变化着的整体。
一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物。根据研究范围的不同，蛋白质组学可以分为表达、结构、细胞图谱蛋白质组学。发展史：
1970s，高分辨二维凝胶电泳（2-DE）技术建立1980s，固相化pH梯度凝胶（IPG）胶条的发明和标准化，改善2-DE的重复性
质谱技术应用在蛋白质分子-电喷雾质谱（ESI-MS），飞行时间质谱（MALDL-TOF-MS）1982年，人类蛋白质组计划设想
1994年9月，蛋白质组的概念提出
1996，澳大利亚建立蛋白质组研究中心
2002，美国成立人类蛋白质组研究组织（HUPO）
研究内容：
1.蛋白质结构
2.蛋白质功能
3.蛋白质的丰度变化
4.蛋白质修饰
5.蛋白质分布
6.蛋白质与蛋白质的相互作用
7.蛋白质与疾病的关联性难点：
1.同一性与多样性
2.静态与动态
3.有限与无限
4.时间与空间
5.孤立行为与相互作用
6.单一手段与多种技术
7.蛋白质组与基因组的互补互助性
8.基因蛋白质工程药物
一、蛋白质组表达模式的研究方法（一）蛋白质组研究中的样品制备
通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等
蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等
蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等
组织水平上的蛋白质组样品制备
免疫亲和技术和激光捕获显微切割(LCM)
关键是保持蛋白质的完整性和活性，避免蛋白质降解或细菌污染
（二）蛋白质组研究中的样品分离
1、双向凝胶电泳（2-DE)：
原理：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质
第一向等电聚焦(IEF)：
在电泳槽中加入载体两性电解质，电泳时从阳极向阴极形成pH逐渐增加的梯度。蛋白质移动过程中在等电点区驻留。因此可根据等电点分离蛋白质。稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。
第二向 SDS-PAGE电泳：
在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。根据分子量分离蛋白质
缺点
①极酸、极碱性，疏水性蛋白质，极大、极小及低丰度蛋白质
用此种技术难于有效分离。
②胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。
③重复性还不令人满意
凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立
凝胶图像的扫描：
图像加工：
斑点检测和定量：
凝胶配比：
数据分析：
数据呈递（report）
2-DE数据库的建立
2、荧光差异凝胶电泳（DIGE）
在传统二维电泳技术上结合多重荧光标记和分析方法，在同一块胶上定量分析不同样品中蛋白质差异表达的技术。不同荧光标记的样品等量混合，在同一块凝胶上观察
提高结果的准确性、可靠性和重复性
3、高效液相色谱（HPLC）
与质谱联用，不存在相对分子质量和等电点的限制
（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定——质谱（MS）法
基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。
组成：进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器、数据分析系统
根据离子化源不同：电喷雾ESI、快原子轰击质谱FAB等
根据质量分析器不同：飞行时间质谱、四极杆质谱等
电喷雾质谱（ESI-MS）
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MS）
蛋白质工程
蛋白质工程的现状发展及展望 摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化 20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脱氢酶变成9- 18 : 0- ACP脱氢酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacillus stear other mophilus分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] DNA改组( DNA shuffling)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起, 它的原理是使用DNase I酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因, 这些小片段随机出现部分片段的重叠, 产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR,通过随机的自身引导或在组装PCR过程中重新组装成全长的基因, 由于存在不同的模板, 使得到的全长基因具有不同谱系之间的重组, 再进行最后一轮PCR,加入全长引物, 扩增得到改造过的全长基因。利用DNA改组已成功进化了编码内酰胺酶、葡萄糖苷酶、脂肪酶、绿色荧光蛋白、烷基转移酶、苯甲基脂酶基因以及编码砷酸盐和阿特拉
蛋白质工程(1)
蛋白质工程：以蛋白质的结构与功能为基础，利用基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现代生物技术，是基因工程的深化和发展。 蛋白质结构：一级结构：蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序。 二级结构：一段连续的肽单位借助氢键排列成具有周期性结构的构象。 三级结构：蛋白质多肽链在各种二级结构的基础上，进一步盘曲折叠形成具有一定规律的三维空间。 四级结构：由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链组成的蛋白质的寡居蛋白，通过肽链间的次级键相互结合形成的空间结构。 蛋白质超二级结构：相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成规则排列的组合体，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合体称为超二级结构，或结构模体。 结构域：指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。结构域是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质三级结构的基本单位，也是蛋白质功能的基本单位。 蛋白质变性：天然蛋白质分子受到某些物理因素（热、紫外线、高压）或化学因素（有机溶剂、脲、胍、酸、碱）的影响，引起蛋白质天然结构的破坏，导致生物活性的降低或完全丧失。 蛋白质折叠：蛋白质因所含氨基酸残基的亲水性、疏水性、带正电、带负电……等等特性通过残基间的相互作用而折叠成一立体的三级结构。 蛋白质定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤-突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。 蛋白质的分子设计：蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，确保获得比天然蛋白质性能更加优越的新型蛋白质。 第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系，人们称之为第二遗传密码或折叠密码。蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生改变的过程。 蛋白质组：基因组表达全部蛋白质及其存在方式，或基因组、一个细胞或一种生物表达的所有蛋白质。 蛋白质组学：定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为，以及基因表达调控的机制的学科。双向电泳：是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。 噬菌体表面展示技术：噬菌体展示技术是将外源基因或一组一定长度的随机寡居核苷酸片段克隆到特定的表达载体内，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。 基因工程抗体：利用基因重组技术对编码抗体的基因按不同需求进行加工改造和重新装配，引入适当的受体细胞，由其编码产生出预期的抗体分子。 抗体酶：通过改变抗体与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。既有抗体的高度选择性，又有酶的高效催化效率。 单克隆抗体：由一种抗原决定簇激活，并具有相应抗原受体的B细胞产生的针对这一抗原决定簇的抗体。
蛋白质工程及其应用研究进展
蛋白质工程及其应用研究进展 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功
蛋白质工程重点
一、名词解释 1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。 2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。 3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。 4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。 5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。 6、晶胞(Unit cel l)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。 7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。 8、化学势（位）移（ ）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。 9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。 10、蛋白质组（proteome）——一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。 二、问答题 1、蛋白质修饰特异性与非特异性诱变方法： 随机突变：UV、X射线、其他化学方法、转座元件、简并引物 定点突变：核式突变、限制性内切酶位点、寡核苷酸介导突变、PCR依赖 1）、Kunkel突变法 双突变菌株 转染于dut+ung+野生型受体菌不含U碱基的保留，含U碱基的被切除 原理：当大肠杆菌dUTP酶缺失突变时（dut-），这些细菌就不能把dUTP转化为dUMP,因而细菌体内的dUTP浓度大为增加，并且一些dUTP会掺入到DNA合成中应该由胸腺嘧
《蛋白质工程的应用》教案
《蛋白质工程的应用》教案 教学目标 1、举例说出蛋白质工程崛起的缘由。 2、简述蛋白质工程的原理。 3、尝试运用逆向思维分析和解决问题。 教学重难点 (1)为什么要开展蛋白质工程的研究？ (2)蛋白质工程的原理。 课时数 本节教学建议用1课时。 教学过程 (1)采用“问题—探究—新问题—再探究”的教学模式。 本节内容是基因工程的延伸和发展。由于蛋白质工程刚刚起步，学习内容较少。如何学得充实，又让学生悟出些终身学习的道理，建议采用“问题—探究—新问题—再探究”的教学模式。 新课一开始，可以带领学生回忆原有知识：要想让一种生物的性状在另一种生物中表达，在种内可以用常规杂交育种的办法实现，但要使有生殖隔离的种间生物实现基因交流，就显得力不从心了。基因工程的诞生，为克服这一远缘杂交的障碍问题，带来了新的希望。于是取得了丰硕成果：大肠杆菌为人类生产出了胰岛素，牛的乳腺生物反应器为人类制造出了蛋白质类药物，烟草植物体内含有了某种药物蛋白……至此，人们也只是实现了世界上现有基因在转基因生物中的表达。但一个新问题出现了，生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中形成的，它的结构、性能不能完全满足人类生产和生活的需要。为了加深这一点的认识，可调动学生从书中找实例(干扰素例子、工业用酶的例子)加以佐证。于是要对现有蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们又开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。 (2)建议加强与已有知识的联系，用逆向思维的方法解决新问题。 学生在必修课中已学习过中心法则及蛋白质具有复杂的空间结构等知识。中心法则告诉我们遗传信息的流动方向如图1-4所示。 遗传信息的流动方向
蛋白质工程在农业或医药方面的应用[精品文档]
蛋白质工程的研究进展及其农业医药应用展望 摘要：蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术，是生物 工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。随着社会和技术的不断发展，蛋白质工程技术在农业和医药方面的作用越来越突出，必将为社会的发展和许多重大社会问题的解决提供极大的支持。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；农业应用；医药应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1 概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。 2 蛋白质工程基本途径
蛋白质工程
课题4 蛋白质工程 教学目标 考点：蛋白质工程（A级，课标要求：1 .举例说出蛋白质工程崛起的缘由 2.简述蛋白质工程的原理；3.通过讨论、进展追踪等活动，提高收集资料、处理资料、撰写专题综述报告的能力。） 案例引入 通过图片引入，想让一种生物性状在另一种生物中表达，在种内可以通过常规杂交育种的方法实现，但要使有生殖隔离的种间生物实现基因交流，需基因工程。但一个新问题出现了，生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中形成的，它的结构，性能不能完全满足人类生产和生活的需要。这就需要对现有蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们又开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。 自主学习 一、概念：以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系为基础，通过物理、化学与生物化学等技术，并借助计算机辅助设计、和重组DNA技术，以天然蛋白质，甚至创造自然界中的蛋白质，以满足生产、生活需要。 二、基本方法、原理 从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，具体见下图： 三、蛋白质工程的主要知识点分析 ①关键技术是，其主要包括内容有等。 ②实施蛋白质工程的前提条件是。 ③测定蛋白质空间结构常用的方法：测定其三维空间结构，了解其构象。 ④蛋白质改造的方法及其含义 “大改”——是指根据的性质和特点，设计并制造出自然界中的全新蛋白质，使之具有特定的氨基酸序列、空间结构和预期功能。 “中改”——是指在蛋白质分子中替代或。 “小改”——是指通过基因的，有目的地改造蛋白质分子中 部位的一个或几个，以改善蛋白质的性质和功能。 ⑤改造蛋白质的核心技术是，常用方法是，基本过程 是 . 四、蛋白质工程的应用 (1)在酶工程领域：有目的的提高酶的热稳定性，增加耐酸、碱、有机溶剂的能力；增强酶的活性；大量生产人类需要的酶:常用方 法，
蛋白质组学及其主要技术
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复
高中生物1.1.3 蛋白质工程 教案(1)(中图版选修3)
蛋白质工程 一、教学目标 1.举例说出蛋白质工程崛起的缘由。 2.简述蛋白质工程的原理。 3.尝试运用逆向思维分析和解决问题。 二、教学重点和难点 1.教学重点 （1）为什么要开展蛋白质工程的研究？ （2）蛋白质工程的原理。 2.教学难点 蛋白质工程的原理。 三、教学策略 1.建议采用“问题—探究—新问题—再探究”的教学模式。 本节内容是基因工程的延伸和发展。由于蛋白质工程刚刚起步，学习内容较少。如何学得充实，又让学生悟出些终身学习的道理，建议采用“问题—探究—新问题—再探究”的教学模式。 新课一开始，可以带领学生回忆原有知识：要想让一种生物的性状在另一种生物中表达，在种内可以用常规杂交育种的办法实现，但要使有生殖隔离的种间生物实现基因交流，就显得力不从心了。基因工程的诞生，为克服这一远缘杂交的障碍问题，带来了新的希望。于是取得了丰硕成果：大肠杆菌为人类生产出了胰岛素，牛的乳腺生物反应器为人类制造出了蛋白质类药物，烟草植物体内含有了某种药物蛋白……至此，人们也只是实现了世界上现有基因在转基因生物中的表达。但一个新问题出现了，生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中形成的，它的结构、性能不能完全满足人类生产和生活的需要。为了加深这一点的认识，可调动学生从书中找实例（干扰素例子、工业用酶的例子）加以佐证。于是要对现有蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们又开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。 2.建议加强与已有知识的联系，用逆向思维的方法解决新问题。 学生在必修课中已学习过中心法则及蛋白质具有复杂的空间结构等知识。中心法则告诉我们遗传信息的流动方向如图1-4所示。 图1-4 遗传信息的流动方向 这是学习新知识的基础。既然蛋白质的功能是由DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造DNA。所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。结合课本中插图，可以较明确地说明这一点。 还有两点教学建议需要说明。第一，蛋白质工程的诞生是有其理论与技术条件支撑的，正如课本中开头描述的，它是随着分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展而诞生的，也与基因组学、蛋白质组学、生物信息学的发展等因素有关（本书“前沿动态”中有简要介绍）。第二，说明蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。这样学习，可以
蛋白质工程在医学中的应用及其发展前景
蛋白质工程在其诞生以来就在人们生活的方方面面起到了很大的作用，它的应用主要是在在医药，食品加工，轻工业，农牧业等方面，为社会的发展进步提供了不容忽视的力量，这将预示着蛋白质工程将在以后的社会发展中有着良好的发展前景。 随着20世纪70年代初期DNA基因工程的诞生，蛋白质工程在它的冲击下应运而生。1983年，美国Genex 公司K.Ulmer 在《Science》上发表以《Protein Engineering.》为题的专论，第一次提出了蛋白质工程的概念，并建立了专门的研究实体，制定了相应研究开发计划，标志着蛋白质工程的正式诞生。在以后的二十多年里，蛋白质工程有了长足的发展且应用于医学，农业，轻工等各个领域，产生了较大的经济效益和社会效益。 一．蛋白质工程在医药中的的医用 基因工程为实现蛋白质工程已经提供了基因克隆、表达、突变以至活性测定等关键技术，而蛋白质分子的结构分析、结构设计和预测为蛋白质工程的实施提供了必要的结构模型和结构基础。蛋白质工程的实施实际上是一个由理论到实践、由实践到理论的周而复始的研究过程，对蛋白质的结构—功能关系的规律性认识是一个螺旋式上升的过程。蛋白质工程不但有着广泛的应用前景，而且在揭示蛋白质结构形成和功能表达的关系研究中也是一个不可替代的手段。 （一）蛋白质工程在医药中的应用 1抗体工程的应用 抗体工程的出发点是改善抗体的特异性、亲和性以及在受体细胞中的可生产性。当然也包括使其特性扩展，可同时作用于不同的抗原。对于很多应用而言，只改变亲和性是不够的。在一些应用中，特别小的抗体片段是必需的；鼠抗体必须改成人抗体；再者，增加抗体分子对蛋白酶的稳定性以及正确折叠都是重要的考虑。 下面以一个特异性结合实体瘤的单克隆鼠抗体为例。这种抗体对高度特异性肿瘤治疗而言是很理想的，它可以将免疫毒素带到瘤细胞中，从而杀死瘤细胞。由于完整的抗体分子太大，不能最大限度地扩散到瘤体中，以致不能完成治疗目的。为此，必须将抗体分子变小，抗体的最小片段Fv就成了最佳候选分子。然而Fv本身不稳定，这样抗体运载体Fy和所携带的毒素可能在到达目的地之前就分开。因而，首先要使其稳定化；然后抗体的亲和性要尽可能高，这是因为抗体对抗原(即瘤细胞)的结合越好，所携带的毒素错误地在身体内传布的危险性就越小，抗体更能达到其目的地。然而，如果病人的免疫系统将这个鼠源抗体识别为外源蛋白质，则几天之后由于HAMA反应产生的人抗鼠抗体就阻断了携带毒素的鼠抗体到达瘤细胞之路，使免疫治疗归于失败。为了解决这一问题，就要对抗体进行改造。近年来，用大肠杆菌系统有效地表达所需要的特定功能的抗体技术取得突破，向人们提供了具有全新性质的医用抗体片段。以上就是对鼠源抗体改造的路子。 如上所述，由于HAMA免疫反应直接从具有特异性结合活性的鼠源单抗在治疗中的作用就受到限制。由于绝大多数HAMA抗体是抗鼠源抗体的恒定区，使人们想到产生嵌合抗体可能解决上述问题，即将鼠单抗的恒定区换成人抗的恒定区。由于人抗体基因和鼠抗体基因都可以分别进行克隆，利用PCR技术很容易将鼠单抗可变区与人的恒定区重组到一起，所得到的嵌合抗体仍然能特异性地结合抗原，而HAMA反应被减少。由于这样的嵌合抗体的恒定区(或恒定结构域)来源于人，因而它对于激活人免疫系统的某些辅助功能更有效，则可有效地激活依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)，这就是某些像这样的人源化抗体已经用到临床实验的原因。
蛋白质工程
蛋白质工程的应用与发展前景 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实力作了蛋白工程应用。 关键词：蛋白质工程研究内容应用 蛋白质是一切生命的基础，是生命的几乎体现着，离开了蛋白质，生命将不复存在。在一切生物学过程中都起着关键的作用。1983年，美国生物学家厄尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念n]，随即被广泛接受和采用。蛋白质工程是以蛋白质结构与功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为舍乎人类需要的新的蛋白质。人们利用分子遗传学的知识和对蛋白质结构的了解，在实验室条件下，设计出垒新的优良蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白
质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1、蛋白质工程的由来 蛋白质工程是在基因工程冲击下应运而生的。基因工程的研究与开发是以遗传基因，即脱氧核糖核酸为内容的。这种生物大分子的研究与开发诱发了另一个生物大分子蛋白质的研究与开发。这就是蛋白质工程的由来。它是以蛋白质的结构及其功能为基础，通过基因修饰和基因合成对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。这种新型蛋白质必须是更符合人类的需要。因此，有学者称，蛋白质工程是第二代基因工程。其基本实施目标是运用基因工程的ＤＮＡ重组技术，将克隆后的基因编码加以改造，或者人工组装成新的基因，再将上述基因通过载体引入挑选的宿主系统内进行表达，从而产生符合人类设计需要的“突变型”蛋白质分子。这种蛋白质分子只有表达了人类需要的性状，才算是实现了蛋白质工程的目标。 ２蛋白质工程原理和基本操作 ２.１分子设计 由于基因工程的发展，人们已经可以运用基因重组等理论和方法去设计并制造出预想的各种性能的蛋白质。这种改变蛋白质的操作可以在蛋白质水平上，也可以在基因水平上。如基因水平的改变，是在功能基因开发的基础上，对编码蛋白质的基因进行改造，小到可改变一个核苷酸，大到可以加入或消除某一结构的编码序列。蛋白质水平的改变则主要是对制造出的蛋白质进行加工、修饰，如磷酸化、糖基化等。蛋白质的化学修饰条件剧烈，无专一性，而基因操作则比较方便，在
蛋白质的应用及前景
蛋白质工程的研究的前景 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。 2 蛋白质工程基本途径 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸（基因） 3 蛋白质工程研究内容 3.1蛋白质结构分析 蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有生物功能的必需手段。晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展，但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克～几十毫克），制备出单晶
蛋白质工程
选修3 专题一 基因工程和蛋白质工程 1、基因工程的概念:基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。 (1)供体：提供目的基因(2)操作环境：体外(3)操作水平：分子水平(4)原理：基因重组(5)受体：表达目的基因(6)本质：性状在受体体内表达(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。 2、限制酶是一类酶，而不是一种酶。 3、限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 4、将一个基因从DNA 分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。 5、不同DNA 分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA 分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 6、限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 7、基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA 分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 8、基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。 9、基因工程的操作步骤 (1) 获取目的基因—????? ①从基因文库中获取②利用PCR 技术扩增③通过化学方法人工合成 (2) 基因表达载体的构建（核心）—组成 （目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。） (3) 将目的基因导入受体细胞—方法 ①植物： ②动物： ③微生物：感受态细胞法 (4) 目的基因的检测与鉴定 10、目的基因的插入位点不是随意的 基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。 11、基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象 第一步存在逆转录法获得DNA ，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。 12 13、原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。 14、一般情况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。
蛋白质工程的应用
蛋白质工程的应用 蛋白质的化学合成和修饰以及利用基因工程进行蛋白质表达是人类认识和利用蛋白质的巨大的飞跃。然而人们并不能满足于此, 因为不论是蛋白质的人工合成还是天然蛋白质的化学修饰都存在很多局限, 如得到的多肽长度、成本、修饰专一性等问题。相比之下基因工程表达蛋白质有很大的优势,但离达到人们所需要的蛋白质的性能还有很大距离。这就向蛋白质的研究 利用提出了更高的要求, 蛋白质工程恰恰能够满足这个要求。 蛋白质工程就是通过对蛋白质结构和功能关系的认识, 按人类的需要通过基因工程途径定 向地改造和创造蛋白质的理论及实践。 医用蛋白质工程 利用生物细胞因子进行人类疾病治疗的独到作用已越来越被人们重视, 基因工程技术诞生后 首先就被用于人生长激素释放抑制因子、胰岛素等医用蛋白质产品开发,大大降低了用于治疗 的成本。利用大肠杆菌进行真核生物蛋白质表达会遇到生物活性低等问题, 解决这些问题的出 路一是研究开发新的表达系统, 如酵母、哺乳动物细胞等,这方面已取得很大的成效。另一方 面就需要借助蛋白质工程, 如利用分子设计和定点突变技术获得胰岛素突变体的工作国内外都取得了相当多的成果, 此外, 干扰素、尿激酶等蛋白质工程也都取得进展, 即将得到长效、速效、稳定作用更广的蛋白质药物。医用蛋白质的市场广大,待开发的产品也非常之多。此外, 利用蛋白质工程技术进行分子设计,通过肽模拟物(pep t idom im et ics) 构象筛选药物等方 面研究更加丰富了蛋白质工程的内容。 工业用酶的蛋白质工程 以酶的固定化技术为核心的酶工程是本世纪继生物发酵工程后又一次创造出巨大工业应用价值的现代生物工程技术, 蛋白质工程在这一领域应用可以说前景最看好。通过酶的结构或局部构象调整、改造, 可大大提高酶的耐高温、抗氧化能力, 增加酶的稳定性和适用pH 范围, 从而获得性质更稳定、作用效率更高的酶用于食品、化工、制革、洗涤等工业生产中, 这方面 已取得了许多成功的先例, 如食品工业中用于制备高果糖浆的葡萄糖异构酶, 用于干酷生产的 凝乳酶, 用于洗涤工业的枯草杆菌蛋白酶等蛋白质工程产品都将开发使用。 病毒疫苗的蛋白质工程 疫苗在病毒等病原引起的人及畜禽传染性疾病的预防中起着不可替代的作用, 从制备疫苗 的途径来说已有几代产品, 目前如乙肝等基因工程疫苗已开始得到应用。通过抗原移植、构建各种颗粒体、活载体及多价疫苗的研究已经成为生物技术领域的研究热点, 但也遇到一些问题, 主要是移植抗原三级结构没有完全恢复天然状态, 因而使得抗原性不够理想。蛋白质工程技术将在今后的疫苗改造中发挥重要的作用, 不但可使抗原性得到最大的提高, 还可使重组疫苗抗 病作用更加广泛。近年来越来越多的病毒精细结构的阐明正在为开展蛋白质工程奠定基础。 抗体的蛋白质工程 抗体不仅在哺乳动物机体中担负着重要的体液免疫功能, 还在医学、生物学免疫诊断中 被广泛地应用。本世纪证明了抗体是一类免疫球蛋白, 并相继阐明了抗体产生及其多样性的细 胞和分子机制, 使免疫学研究成为生命科学前沿领域。同时抗体的制备技术也经历着一次又一次革命, 由血清抗体到杂交瘤单克隆抗体, 再到基因工程抗体库技术, 可谓日新月异。单克隆 抗体给人类疾病的药物导向治疗带来了曙光, 但应用上遇到鼠抗体对人具有免疫原作用的问题, 蛋白质工程已成功用于解决这个问题。
蛋白质工程
6 蛋白质工程 学习目的：①初步了解蛋白质结构、以及蛋白质分子设计和蛋白质修饰和表达等的基本原理。 ②了解如何利用蛋白质工程技术和其他相关技术获得更加符合人类需求且比天然蛋白质更优良的蛋白质， 20世纪60年代初，随着生物化学和分子生物学的发展和延伸，人们对生物的遗传物质——DNA结构与功能已经有了比较清楚的认识。1972年，美国斯坦福大学Berg成功地实现了DNA重组实验，从此揭开了基因工程发展的序幕，并逐步形成了以基因工程为核心内容，包括细胞工程、酶工程、发酵工程在内的一系列高新生物技术。这些技术发展到今天，已经形成产业化并成为全球高科技领域发展的主流，广泛地应用于食品、医药、化工、农业、环保、能源、资源再利用和国防等许多部门与行业，并日益显示出不可估量的社会效益和经济效益，将为解决当前世界所面临的蛋白质缺乏、能源不足和高效医药品短缺等系列重大问题提供了基本保证和可行性技术。20世纪80年代初，随着蛋白质晶体学和结构生物学的发展，人类可以通过对蛋白质结构与功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等高新技术改造基因，以达到改进蛋白质某些性质的目的。这些技术的融合，促使了蛋白质工程这一新兴生物技术领域的诞生，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。1982年，Winter等首次报道了通过基因定位诱变获得改性的酪氨酸 tRNA合成酶；1983年，Ulmer 在《科学》杂志上发表了以"Protein Engineering"(蛋白质工程)为题的专论，这标志着人们能按自己的意愿创造出适合人类需求的新基因，并能表达出具有不同功能的蛋白质。这是新一代的基因工程，因而蛋白质工程也被称为第二代基因工程。 蛋白质工程的基本内容和目的可以概括为：以蛋白质结构与功能为基础，通过化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新的蛋白质；对现有的蛋白质加以定向改造、设计、构建和最终生产出比自然界存在的蛋白质功能更优良，更符合人类需求的功能蛋白质。 6．1 蛋白质结构基础． 6.1.1 蛋白质结构的基本构件 在自然界中，构成生命最基本的物质有蛋白质、核算、多糖和脂类等生物大分产，其中蛋白质最为重要，核酸则最为根本。各种生物功能、生命现象和生理活动主往是通过蛋白质来实现的，因此蛋白质不仅是生物体的主要组分，更重要的是它与生命活动有着十分密切的关系。在体内，蛋白质执行着酶催化作用，使新陈代谢能有序地进行，从而表现出各种生命的现象；通过激素的调节代谢作用，以确保动囱正常的生理活动；产生相应的抗体蛋白，使人和动物具有防御疾病和抵抗外界病原侵袭的免疫能力；构建成的各种生物膜，形成生物体内物质和信息交流的通路和能量转换的场所。这一系列功能充分说明了蛋白质在生命活动中的重要作用，说明生命活动是不能离开蛋白质而存在的。 6．1．1．1 蛋白质的化学组成 蛋白质在生命活动过程中之所以有如此重要作用，是由它自身的组成、结构、性质所决定的。从动、植物细胞中提取出来的各种蛋白质，经元素分析，均含有碳、氢、氧、氮及少量的硫元素。这些元素在蛋白质中多以大致一定的比例存在。有些蛋白质还含有微量的过渡金属元素，例如：铁、锌、钼和镍等元素。蛋白质经干燥后，其元素组成平均值约为：碳 50％～55％氢6．0％～7．0％氧 20％～23％ 氮 15％～17％硫0．3％～2．5％ 通常蛋白质的分子质量均在一万道尔顿以上，变化范围从10000到1 000000道尔顿，
蛋白质工程的应用及发展
蛋白质工程的研究进展和展望 农业与生物工程学院07级3班向文宝 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的